一種以煙草花葉病毒rna解旋酶為靶標(biāo)的抗病毒藥物虛擬篩選方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標(biāo)的抗煙草花葉病毒藥物的虛擬篩選方法，同時(shí)通過(guò)分子模擬軟件確定用于虛擬篩選的解旋酶結(jié)合ATP時(shí)的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)。該方法可用于具有防治煙草花葉病毒活性的化合物的快速篩選。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀標(biāo)的抗病毒藥物虛擬 篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物篩選方法，尤其涉及W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀點(diǎn)，利用分 子對(duì)接進(jìn)行的新型抗煙草花葉病毒藥物的虛擬篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草花葉病毒（7b知CCO fflfwaic Fir"s, TMV)是一種典型的煙草花葉病毒屬 病毒，能感染^煙草為代表的一系列茄科植物，病征包括萎縮、壞死、葉片卷 曲W及葉片組織上深淺綠色混合的特征性的花斑圖案等。
[0003] 現(xiàn)有煙草花葉病的綜合防治措施包括選擇抗性品種、合理施服、煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò) 程中進(jìn)行衛(wèi)生管理W及化學(xué)防治等。其中，化學(xué)防治手段大體可W分為天然源抗病毒劑和 化學(xué)合成抗病毒劑兩大類(lèi)，其作用機(jī)制主要可W分為W下H類(lèi)；（1)抑制病毒侵染宿主； (2)抑制病毒增殖和擴(kuò)散；（3)誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性。而在醫(yī)藥抗病毒藥物方面，其藥物分 子設(shè)計(jì)與作用機(jī)制研究的焦點(diǎn)還包括了逆轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶、蛋白酶、解旋酶等病毒復(fù)制所必 須的功能蛋白。
[0004] TMV的RNA基因組含有四個(gè)開(kāi)放讀碼框（open reading化ame, 0RF)，共編碼四個(gè) 蛋白，分別是126-kDa和183-kDa復(fù)制蛋白、30-kDa運(yùn)動(dòng)蛋白W及17. 5-kDa的外殼蛋白。 126-kDa的復(fù)制蛋白W-個(gè)玻巧終止密碼子（amber codon)UAG結(jié)束，該終止密碼子通讀為 酪氨酸時(shí)產(chǎn)生一個(gè)183-kDa的蛋白。126-kDa和183-kDa蛋白均含有甲基轉(zhuǎn)移酶W及解旋 酶結(jié)構(gòu)域，183-kDa蛋白的通讀部分則包含了一個(gè)典型的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶基序。
[0005] 實(shí)驗(yàn)證明，在缺乏解旋酶的情況下，病毒不能繼續(xù)侵染或破壞宿主細(xì)胞。近十幾年 來(lái)，W解旋酶作為抗病毒藥劑作用祀標(biāo)已有一定的研究。常見(jiàn)的解旋酶抑制劑結(jié)構(gòu)主要包 括核巧類(lèi)似物、聚苯、金屬離子馨合劑、黃麗、多環(huán)芳香族聚合物、香豆素等，根據(jù)其作用機(jī) 制又可W分為H類(lèi)；（1)抑制解旋酶催化的ATP水解；（2)抑制解旋酶催化的核酸分離；（3) 擾亂解旋酶與寄主因子之間的相互作用。而截至目前，尚無(wú)W TMV解旋酶作為藥物作用祀 標(biāo)的藥物分子設(shè)計(jì)或藥物作用機(jī)制研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是建立一種W TMV的RNA解旋酶為祀點(diǎn)的抗TMV藥物的虛擬篩選方 法，W豐富現(xiàn)有的篩選方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種確定TMV的RNA解旋酶與ATP結(jié)合時(shí)活性構(gòu)象的 H維結(jié)構(gòu)的方法。
[0008] 本發(fā)明利用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)，結(jié)合活體抗TMV治療活性測(cè)試方法，旨在發(fā)現(xiàn)能 有效結(jié)合TMV的RNA解旋酶的活性位點(diǎn)W抑制其ATP依賴(lài)的解旋酶活性的藥物，從而阻斷 TMV的復(fù)制進(jìn)而達(dá)到防治煙草花葉病毒引起的多種植物病毒病。
[0009] 本發(fā)明提供一種W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀標(biāo)的抗病毒藥物的虛擬篩選方 法，其特征在于，包括w下步驟： (1) 通過(guò)分子模擬軟件確定解旋酶結(jié)合ATP時(shí)的活性構(gòu)象的H維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)； (2) 采用分子對(duì)接軟件，依據(jù)活性位點(diǎn)的氨基酸殘基，確定分子對(duì)接的活性中也，設(shè)定 活性口袋； (3) 對(duì)小分子配體進(jìn)行篩選，建立對(duì)接用小分子配體數(shù)據(jù)庫(kù)； (4) 根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對(duì)接軟件，將對(duì)接用小分子配體數(shù)據(jù)庫(kù)中的小分 子配體與活性口袋一一進(jìn)行對(duì)接； (5) 根據(jù)對(duì)接結(jié)果的排序，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，初步確定具有抗煙草花葉病毒效果的候選 化合物。
[0010] 上述的虛擬篩選方法中，步驟（1)所述結(jié)合ATP的解旋酶的H維結(jié)構(gòu)通過(guò)W下步 驟確定： (1) 通過(guò)氨基酸序列比對(duì)得到已知H維結(jié)構(gòu)的模板蛋白，采用分子模擬方法，同源模 建煙草花葉病毒RNA解旋酶H維結(jié)構(gòu)； (2) 對(duì)同源模建的煙草花葉病毒RNA解旋酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化； (3) 通過(guò)H維結(jié)構(gòu)比對(duì)，得到H維結(jié)構(gòu)類(lèi)似的解旋酶與ATP復(fù)合物H維結(jié)構(gòu)，通過(guò)活 性位點(diǎn)氨基酸殘基疊合的方式，得到煙草花葉病毒RNA解旋酶與ATP結(jié)合的初始結(jié)構(gòu)； (4) 通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化，得到解旋酶結(jié)合ATP時(shí)的活性構(gòu)象的H維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。
[0011] 上述虛擬篩選方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子對(duì)接活性位點(diǎn)，可W是解旋酶 結(jié)合RNA或ATP的活性位點(diǎn)。
[0012] 上述虛擬篩選方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子對(duì)接活性位點(diǎn)，可W是解旋酶 的變構(gòu)中也。
[0013] 上述虛擬篩選方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子對(duì)接活性位點(diǎn)，可W是影響解 旋酶活性的其他氨基酸殘基。
[0014] 上述虛擬篩選方法，所述的小分子配體數(shù)據(jù)庫(kù)，可W是已有的免費(fèi)或商用數(shù)據(jù) 庫(kù)； 上述虛擬篩選方法，所述的小分子配體數(shù)據(jù)庫(kù)，可W是個(gè)人自行建立的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0015] 按照上述的W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀標(biāo)的抗病毒藥物的虛擬篩選方法，篩 選出的候選化合物作為防治煙草花葉病毒的農(nóng)藥和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用。
[0016] 按照上述的虛擬篩選方法篩選出的候選化合物在防治煙草花葉病毒的農(nóng)藥 和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用，所指的候選化合物為心1，A-1和A-2。L-1的化學(xué)名稱(chēng)為： (々-(((1-(6-氨基-9/^嘿嶺-9-取代）丙焼-2-取代氧代）甲基）磯醜基雙（氧代）雙 (亞甲基）異丙基二碳酸醋，A-1的化學(xué)名稱(chēng)為；2-(2-(6-氯-9/^嘿嶺-9-取代）己氧 基-苯甲酸（二己氧基磯醜基）甲醋，A-2的化學(xué)名稱(chēng)為；2-(2-(2-氨基-9/^嘿嶺-9-取 代）己氧基-3-甲基苯甲酸（二己氧基磯醜基）甲醋。結(jié)構(gòu)式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標(biāo)的抗病毒藥物的虛擬篩選方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 通過(guò)分子模擬軟件確定解旋酶結(jié)合三磷酸腺苷ATP時(shí)的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)數(shù) 據(jù)； (2) 采用分子對(duì)接軟件，依據(jù)活性位點(diǎn)的氨基酸殘基，確定分子對(duì)接的活性中心，設(shè)定 活性口袋； (3) 對(duì)小分子配體進(jìn)行篩選，建立對(duì)接用小分子配體數(shù)據(jù)庫(kù)； (4) 根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對(duì)接軟件，將對(duì)接用小分子配體數(shù)據(jù)庫(kù)中的小分 子配體與活性口袋一一進(jìn)行對(duì)接； (5) 根據(jù)對(duì)接結(jié)果的排序，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，初步確定具有抗煙草花葉病毒效果的候選 化合物。
2. 按照權(quán)利要求1所述一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標(biāo)的抗病毒藥物的虛擬篩 選方法，其特征在于：步驟（1)所述解旋酶結(jié)合ATP時(shí)的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)通過(guò)以下步驟 確定： (1) 通過(guò)氨基酸序列比對(duì)得到已知三維結(jié)構(gòu)的模板蛋白，采用分子模擬方法，同源模 建煙草花葉病毒RNA解旋酶三維結(jié)構(gòu)； (2) 對(duì)同源模建的煙草花葉病毒RNA解旋酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化； (3) 通過(guò)三維結(jié)構(gòu)比對(duì)，得到三維結(jié)構(gòu)類(lèi)似的解旋酶與ATP復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)活 性位點(diǎn)氨基酸殘基疊合的方式，得到煙草花葉病毒RNA解旋酶與ATP結(jié)合的初始結(jié)構(gòu)； (4) 通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化，得到解旋酶結(jié)合ATP時(shí)的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標(biāo)的抗病毒藥物的 虛擬篩選方法篩選出的候選化合物作為防治煙草花葉病毒的農(nóng)藥和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的虛擬篩選方法篩選出的候選化合物在防治煙草花葉病毒的 農(nóng)藥和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用，其特征是所指的候選化合物為A-I和A-2，A-1的化學(xué)名稱(chēng)為： 2-(2-(6-氯-9片嘌呤-9-取代）乙氧基-苯甲酸（二乙氧基磷酰基）甲酯，A-2的化學(xué) 名稱(chēng)為2-(2-(2-氨基-9片嘌呤-9-取代）乙氧基-3-甲基苯甲酸（二乙氧基磷酰基）甲 酯，結(jié)構(gòu)式如下 ：
【文檔編號(hào)】G06F19/16GK104504301SQ201410848300
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】楊松, 周青, 鄭玉濤, 葉意強(qiáng), 趙遠(yuǎn)超, 陳玉婷, 胡德禹, 薛偉, 吳志兵 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)