一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法
【專利摘要】一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，也即基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復合材料的制備方法，其特征在于：是以基因修飾的TMVCP為模板，通過其與含金元素基團的靜電作用，在其表面吸附含金元素基團，最后加入還原劑，從而實現了納米金在基因修飾的TMVCP模板表面的生長，得到了新型的TMVCP-納米金一維復合材料。結果表明，與在未經基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長相比，在基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長，納米金在模板表面的生長密度得到較大提升，可望對TMVCP-納米金一維復合材料的應用產生積極影響。
【專利說明】一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及有機-無機復合材料研究領域，具體說是一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，也即一種基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復合材料的制備方法，利用本發(fā)明提供的方法，可提升TMVCP-納米金復合材料的一維化程度和納米金在TMVCP模板表面的生長密度，可望對TMVCP-納米金一維復合材料的應用廣生積極影響。
[0003]
【背景技術】
[0004]煙草花葉病毒(TMV)，是煙草花葉病得病原體，對煙葉生長危害極大，目前有關煙草花葉病毒的研究多以防治煙草花葉病相關(例如專利:銀杏內酯B在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應用(申請?zhí)?01010291033.8);專利:柴胡皂苷A在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應用(申請?zhí)?01010291073.2)，專利:6_0_咖啡酰基飛蓬苷在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應用(申請?zhí)?01010291012.6))。
[0005]近年來，有研究者開始將TMV在材料研究領域進行應用。TMV外殼蛋白(CP)以其納米管狀的幾何外形、高活性的內外表面被認為是一種理想的構筑低維材料的模板(R.Tsukamotoj M.Muraokaj M.Sekij H.Tabataj 1.Yamashita.Chem.Mater.，2007，19: 2389 ；E.Dujardinj C.Peetj G.Stubbs, J.Ν.Culver, S.Mann.Nano Lett.,2003，3: 413 ；M.Knezj `M.Sumserj A.M.Bittner, C.Wegej H.Jeskej T.P.Martin,K.Kern.Adv.Funct.Mater., 2004，14: 116.)，目前以 TMVCP 為模板，已經進行了多種納米材料的生長，最終得到的復合材料被認為可在信息存儲、光捕集以及傳感器等領域有應用的潛力(R.J.Tseng, C.Tsai, L Maj J.0uyangj C.S.0zkanj Y.Yang.Nature Nanotechnology, 2006，1: 72 ；R.A.Miller, A.D.Presley, Μ.B.Francis.J.Am.Chem.Soc.，2007，129: 3104 ；T.L Schlickj Z.Ding, E.W.Kovacsj M.B.Francis.J.Am.Chem.Soc.，2005，127: 3718)。
[0006]一般來說，TMVCP的組裝體在分散介質中存在多種可能的狀態(tài)(A.Klug.PhilosTrans R.Soc.London B, 1999, 354: 531),調控體系pH值、離子強度以及溫度等條件，可以使得TMVCP處于某幾種狀態(tài)的動態(tài)平衡中，這就使得TMVCP在具體應用中呈現出結構的不連續(xù)性，不利于發(fā)揮其作為模板材料的功能。本專利申請案的發(fā)明人在前期研究中，已經通過分子生物學的方法，對TMVCP進行了基因修飾，改善了 TMVCP模板的結構均一性，并已申請了中國專利:一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，申請?zhí)?01210336227.4。而在本專利申請中，發(fā)明人則進一步以基因修飾的TMVCP為模板，進行了納米金的生長。也即前一專利申請的續(xù)篇，對前一專利申請得到的結果進行了更深一步的改善，結果表明，與在未經基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長相比，在基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長，納米金在模板表面的生長密度得到較大提升，可望對TMVCP-納米金一維復合材料的應用產生積極影響。
[0007]

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的:
一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，也即基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復合材料的制備方法，是以基因修飾的TMVCP為模板，通過其與含金元素基團的靜電作用，在其表面吸附含金元素基團，最后加入還原劑，從而實現了納米金在基因修飾的TMVCP模板表面的生長，得到了新型的TMVCP-納米金一維復合材料。具體步驟如下:
(I)以六聚組氨酸(His-tag)對煙草花葉病毒殼蛋白TMVCP進行基因修飾，得到基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCPJf His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為
0.3~0.5 mg/mL的懸浮液。
[0009](2)將1(T15 mL此懸浮液、5~7 mL乙酸溶液、0.3^0.5 mL氯金酸溶液一同置于反應容器中，在避光條件下攪拌2~3 h。其中乙酸溶液的質量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M。
[0010](3)將fl.5 mL的水合肼溶液加入反應物中，室溫下將反應物靜置2~3 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0011](4)用去離子水、以離心的方法對產物進行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產物即本發(fā)明的目標產物，將該產物再次分散于去離子水中，得到含有目標產物的懸浮液，以便進行透射電鏡(TEM)表征(見附圖)，該目標產物即為基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復合材料。
[0012]本發(fā)明步驟(1)中所述的基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCP是通過以下方法制備的:①兩條引物被用來擴增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC,和下游引物 His-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTCo ② PCR 產物使用 T4DNA 連接酶連接進入 pET28a載體。③在羧基端含有6*His標簽的含有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達。④上柱純化蛋白時，首先以50 mL預冷緩沖液沖洗柱子(50 mM磷酸鉀，300 mM氯化鉀，I mM PMSF, 10 mM β -巰基乙醇，10 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0)隨后，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子(50 mM磷酸鉀，300 mM氯化鉀，I mM PMSF,10 mM β-巰基乙醇，40 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0)，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白(50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，I mM PMSF, 10 mM β-巰基乙醇，500 mM咪唑，10%乙醇，PH 值 8.0)。
[0013]本發(fā)明通過基因修飾的TMVCP模板與含金元素基團的靜電作用，以化學沉積的方法，在基因修飾的TMVCP模板表面進行了納米金的生長，實現了基因修飾的TMVCP與納米金的復合，與在未經基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長相比，納米金在模板表面的生長密度得到較大提升?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0014]圖1為基于His-TMVCP模板生長的納米金透射電鏡(TEM)照片。
[0015]圖2為基于未經基因修飾的TMVCP模板生長的納米金透射電鏡(TEM)照片。
[0016]從圖(I)和圖(2)的對比可以看出，與在未經基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長相比，在基因修飾的TMVCP模板上進行納米金的生長，納米金在模板表面的生長密度的到較大提升。
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明以下結合具體實施例作進一步描述:
實施例1
(I)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進行基因修飾，得到的產物以His-TMVCP表示，制備過程如前面
【發(fā)明內容】
中所述(也可具體參照已公開的中國專利201210336227.4中的方法)，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.3 mg/mL的懸浮液。
[0018](2)將10 mL的His-TMVCP懸浮液、5 mL乙酸溶液、0.3 mL氯金酸溶液一同置于反應容器中，在避光條件下攪拌2 h。其中乙酸溶液的質量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01M0
[0019](3)將I mL的水合肼溶液加入反應物中，室溫下將反應物靜置2 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0020](4)用去離子水、以離心的方法對產物進行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產物，將該產物再次分散于去離子水中，得到含有目標產物的懸浮液，而后進行電鏡表征。
[0021]實施例2
Cl)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進行基因修飾，得到的產物以His-TMVCP表示，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.4 mg/mL的懸浮液。
[0022](2)將15 mL此懸浮液、6 mL乙酸溶液、0.4 mL氯金酸溶液一同置于反應容器中，在避光條件下攪拌2 h。其中乙酸溶液的質量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
[0023](3)將1.5 mL的水合肼溶液加入反應物中，室溫下將反應物靜置2?3 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0024](4)用去離子水、以離心的方法對產物進行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產物，將該產物再次分散于去離子水中，得到含有目標產物的懸浮液，而后進行電鏡表征。
[0025]實施例3
Cl)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進行基因修飾，得到的產物以His-TMVCP表示，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.5 mg/mL的懸浮液。
[0026](2)將15 mL此懸浮液、7 mL乙酸溶液、0.5 mL氯金酸溶液一同置于反應容器中，在避光條件下攪拌3 h。其中乙酸溶液的質量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
[0027](3)將1.5 mL的水合肼溶液加入反應物中，室溫下將反應物靜置3 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0028](4)用去離子水、以離心的方法對產物進行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產物，將該產物再次分散于去離子水中，得到含有目標產物的懸浮液，而后進行電鏡表征。[0029]實施例4
Cl)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進行基因修飾，得到的產物以His-TMVCP表示，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.3 mg/mL的懸浮液。
[0030](2)將10 mL此懸浮液、6 mL乙酸溶液、0.4 mL氯金酸溶液一同置于反應容器中，在避光條件下攪拌3 h。其中乙酸溶液的質量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
[0031](3)將1.2 mL的水合肼溶液加入反應物中，室溫下將反應物靜置2 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0032](4)用去離子水、以離心的方法對產物進行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產物，將該產物再次分散于去離子水中，得到含有目標產物的懸浮液，而后進行電鏡表征。
【權利要求】
1.一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，也即基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復合材料的制備方法，其特征在于:是以基因修飾的TMVCP為模板，通過其與含金元素基團的靜電作用，在其表面吸附含金元素基團，最后加入還原劑，從而實現了納米金在基因修飾的TMVCP模板表面的生長，得到了新型的TMVCP-納米金一維復合材料。
2.根據權利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，其特征在于:包括以下具體步驟: (1)以六聚組氨酸(His-tag)對煙草花葉病毒殼蛋白TMVCP進行基因修飾，得到基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCPJf His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.3~0.5 mg/mL的懸浮液； (2)將1(T15mL此懸浮液、5~7 mL乙酸溶液、0.3^0.5 mL氯金酸溶液一同置于反應容器中，在避光條件下攪拌2~3 h ； (3)將f1.5 mL的水合肼溶液加入反應物中，室溫下將反應物靜置2~3 h ； (4)用去離子水、以離心的方法對產物進行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產物即本發(fā)明的的目標產物，將該產物再次分散于去離子水中，得到含有目標產物的懸浮液，該目標產物即為基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復合材料。
3.根據權利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，其特征在于:步驟(2)中的乙酸溶液的質量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
4.根據權利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，其特征在于:步驟(2)中的水合肼溶液濃度為10-3Μ。
5.根據權利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進行納米金生長的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCP是通過以下方法制備的:①兩條引物被用來擴增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCPFl, GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 His-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC !② PCR 產物使用 T4DNA 連接酶連接進入pET28a載體；③在羧基端含有6*His標簽的含有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達；④上柱純化蛋白時，首先以50 mL預冷緩沖液沖洗柱子，隨后，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白。
【文檔編號】B82Y30/00GK103706800SQ201410018780
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權日:2014年1月16日
【發(fā)明者】劉楠, 張威, 羅安娜, 王英元, 馮曉民, 何聲寶, 閆新甫 申請人:國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心