專利名稱：在培養(yǎng)物中復制流感病毒的方法
相關申請的交叉引用
本申請要求2006年12月15日申請的美國申請60/875287和2006年12月28日申請的美國申請60/882412的優(yōu)先權，二者均納入本文作為參考。
背景技術：
人們已認識流感流行和大流行達數(shù)個世紀，并且它已經導致了相當多的生命喪失。流感病毒是一種分段的含有RNA的病毒，屬于正黏病毒科。流行和大流行是由具有在人群中很少有免疫性的新包膜成分的病毒引起的。這些新成分通常為人類和動物流感病毒突變和/或混合的結果。
然而，流感病毒的衣殼為略微多晶的，其外表面與所有病毒一致，由脂質包膜組成，從脂質包膜上伸出兩種突出的糖蛋白棘血細胞凝集素(HA或H)和神經氨酸酶(NA或N)。有三種類型的流感病毒A、B和C型。僅A型流感病毒基于兩種主要的表面糖蛋白HA和NA進一步分類為亞型。A型流感亞型根據病毒株進一步分類。B型流感病毒僅感染哺乳動物并在人中致病，但一般不如A型嚴重。C型流感病毒也僅僅感染哺乳動物，但僅在兒童引起非常輕的呼吸道疾病。它們在遺傳學上和形態(tài)學上與A和B型不同。
A型流感病毒感染很多種動物，包括哺乳動物，如，人、馬、狗、豬、白鼬、鳥類，如鴨、雞和火雞。有16種已知HA血清型和9種已知NA血清型。鳥類為特別重要的儲存庫，其生成遺傳學上/抗原學上不同的病毒的庫，所述病毒通過人和動物之間的近距離接觸轉移到人群中。豬可感染人類和鳥類流感株。因為這種不尋常的特征，當同一細胞感染兩種類型的病毒時，豬被認為是允許鳥類和人類病毒之間基因交換的“混合容器”。
流感病毒基因組由分成8段的單鏈(-)有義RNA組成(C型流感為7段)。因為已經作出了大量遺傳學研究(傳統(tǒng)和分子)基因組結構是詳知的。每段編碼一種或兩種病毒蛋白。人們相信流行和大流行是因為流感病毒HA和NA蛋白的兩種不同的方式的遺傳改變而引起抗原漂移和抗原轉變。抗原漂移經常發(fā)生，而抗原轉變僅僅偶爾發(fā)生。A型流感病毒進行兩種變化，B型流感病毒僅通過更漸進性的過程抗原漂移而變化。
抗原漂移是指通過兩個基因中的點突變發(fā)生的小而漸進的變化，所述兩個基因包含產生主要表面蛋白HA和NA的遺傳物質?？乖D變是指在人中產生目前不在人群中流行的新的A型流感病毒亞型的突然而大的變化?？乖D變可通過動物(家禽)與人的直接傳播發(fā)生，或通過A型人流感和A型動物流感病毒基因混合而通過被稱為遺傳重配的過程產生新的A型人流感病毒亞型?？乖D變產生新的A型人流感亞型。當兩種不同的流感病毒感染相同細胞并平分或交換一個或多個RNA片段時發(fā)生遺傳重配。例如，如果轉移的片段是HA，則可導致新的病毒株出現(xiàn)，所述病毒株在抗原上為新型，并且進入人群時具有很少或沒有免疫性。這個結果可導致流行和/或大流行。
流感病毒進入細胞能通過HA棘與含有N-乙酰神經氨酸(NANA＝唾液酸)端基的粘蛋白結合而變容易。結合后，顆粒通過內吞作用經包被的凹陷卷入形成內吞囊泡，最后形成核內體。這些被細胞酸化并且在約pH5.0下，HA單體在核內體中被類胰蛋白酶裂解以激活它們內化。一旦內化，則發(fā)生病毒復制并產生流感癥狀。
人們對最近的流感爆發(fā)相當關注。業(yè)已在狗中鑒別出因犬流感病毒(CIV)所致的一種嚴重呼吸道疾病。這種呼吸道疾病已被證實有高度傳染性。而且，CIV可引起100％的感染率和80％的發(fā)病率，以及在嚴重感染中高達5-8％的死亡率。自從2004年在靈提賽犬中首次檢出(Crawford等人，Science 310(5747)482-485(2005))，CIV已經很快蔓延至全美國，其中至少25個州報道CIV爆發(fā)，并且二十七個州報道CIV血清陽性。
引起最近爆發(fā)的CIV血清型是H3N8。這種CIV血清型最初在馬中發(fā)現(xiàn)， 認為它是越過種屬障礙進入犬類?？赡芸谷鞲胁《居行б呙绲娜狈υ谶@種病毒在狗中快速而廣泛的傳播中起重要作用。
A型流感(H5N1，禽流感)病毒也稱為“H5N1病毒”，是一種A型流感病毒亞型，主要在鳥類中發(fā)生，在鳥類中有高度傳染性，對鳥類可致死。H5N1病毒不經常感染人類，但這些病毒感染在人類中發(fā)生過。迄今為止，已在10個國家(主要在亞洲)報道了超過200例的人類確診病例，這些病例導致了150余人死亡。幸運的是，這種病毒還不容易從鳥類傳播至人類或在人類之間互相傳播。然而，這有可能發(fā)生，導致流行或大流行。防止與流行或大流行相關的發(fā)病率和致死率的最佳策略是疫苗接種。
目前給予人類的流感疫苗在預防住院治療和死亡方面有很高的性價比，然而，季節(jié)性疫苗的世界年產量有限，并且不能實際地覆蓋全球高風險人群?，F(xiàn)有疫苗是用自世界衛(wèi)生組織(WHO)或疾病控制中心(CDC)獲得的病毒在蛋中制成，WHO和CDC每年為疫苗生產提供病毒種子。流行病毒的HA變化(抗原漂移)需要在流感兩次爆發(fā)期間周期性置換疫苗株。WHO發(fā)表了包括南半球和北半球所包括的半年推薦株。為允許有足夠的時間生產，WHO在二月測定哪個疫苗株應包括在下個冬天的疫苗內。一般來說，成人一個劑量含有45μg HA(15μg每種，3種病毒)的等同物。這個劑量大約為從為一個感染的含胚雞蛋的尿囊液中得到的純化的病毒的量。如果制備1億劑量的滅活的流感病毒疫苗，制造商必須獲得1億個含胚雞蛋。這使得疫苗生產依賴于高質量含胚雞蛋的時間可行性和WHO/CDC提供的種子株。大部分原型種子株甚至在含胚雞蛋中也不容易生長至高效價。要克服這個困難問題，政府機關首先要通過與高產率的實驗室株A/PR/8/34經典重配(以6∶2重配從A/PR/8/34株中得到6個片段)創(chuàng)造出高產率的實驗室株。遺憾的是，這個方法可能很難做到，并且可能影響所得到的疫苗的抗原性。因此，需要提供生產疫苗的替代方法以預防由流感、特別是高度致病株如H5N1引起的臨床疾病。還有，仍然需要提供在快得足以有效預防可能的流行和/或大流行的時間內生產大量救生流感疫苗的方法。本發(fā)明解決這些和其他需求。
本文所引用的任何參考不應被理解為允許這種參考作為本申請的“現(xiàn)有技術”。
發(fā)明簡述 本發(fā)明涉及預防A型和B型流感感染的疫苗。相對于現(xiàn)有技術的疫苗和方法，本發(fā)明的疫苗和相關方法提供大量優(yōu)點。例如，本發(fā)明的疫苗用組織培養(yǎng)細胞代替含胚雞蛋生產。所述創(chuàng)造性生產方法通過省略傳統(tǒng)疫苗生產步驟而節(jié)約了關鍵時間。另外，本發(fā)明的疫苗可用于那些對蛋物質過敏者。本發(fā)明還提供可在疫苗中應用的新型免疫原性組合物。這些新型免疫原性組合物可用于免疫動物，包括鳥類，以抵抗流感。在本法明的具體實施方式
中，疫苗接受者為哺乳動物。在一個方面，本發(fā)明提供保護犬類抵抗犬流感病毒(CIV)所致的犬呼吸道疾病的疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供保護人類抵抗通過遺傳重配自然產生的流感病毒株的疫苗。
本發(fā)明提供流感病毒分離物，其特別適于在組織培養(yǎng)細胞中生長。在一個具體實施方式
中，改造的流感病毒分離物根據其在所選擇的組織培養(yǎng)細胞系中生長的能力，用有限稀釋克隆(limit dilution cloning)選擇。在一個具體實施方式
中，通過將包含大量流感亞群的一些流感病毒通過系列稀釋為大量等分試樣，來選擇適于在培養(yǎng)細胞系中生長的流感病毒亞群。然后大量等分試樣與培養(yǎng)的細胞系接觸，和/或在培養(yǎng)的細胞系中生長。大量流感病毒亞群中的一個流感病毒亞群經檢測被鑒別為以低感染復數(shù)(MOI)在培養(yǎng)細胞中生長的流感病毒亞群，并被選為適于在培養(yǎng)細胞系中生長的流感病毒亞群。在相關實施方式中，本發(fā)明提供如下方法，其包括使所述適于組織培養(yǎng)的分離物與組織培養(yǎng)細胞接觸，使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間。此方法也可包括收獲流感病毒。在一些這樣的實施方式中，所述有限稀釋克隆方法包括系列稀釋流感病毒分離物，并使每種稀釋物與培養(yǎng)細胞接觸，使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間，從致CPE的最高倍稀釋物中收獲病毒，并用收獲的病毒重復所述方法。在一些實施方式中，所述方法也包括使所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶混合，然后與所述培養(yǎng)細胞接觸。在一些實施方式中，孵育所述混合物一段足以允許胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細胞從基底脫離的時間。用于裂解病毒蛋白的胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。在某些情況下，使適于組織培養(yǎng)的分離物與組織培養(yǎng)細胞接觸的步驟在感染復數(shù)(MOI)小于約0.01，包括小于約0.001和/或小于約0.0001的情況下進行。在其他情況下，所述流感病毒分離物首先在組織培養(yǎng)細胞中檢測，以測定最適MOI。所述組織培養(yǎng)細胞可為哺乳動物胚胎腎細胞，如，人胚胎腎細胞。所述流感病毒可為A、B和C型流感病毒。在一個具體實施方式
中，所述流感A病毒為H5N1株。所述流感病毒分離物可從任何來源得到，包括如鼻拭子、肺組織，和/或可由第三方提供，如WHO。在一些實施方式中，所述流感病毒分離物起初在含胚雞蛋中生長，以得到大量適于組織培養(yǎng)的接種物。一些方法包括純化所收獲的病毒。在一個這樣的方法中，所述純化步驟用尺寸排阻層析進行。本發(fā)明的方法也可包括在純化之前、之中或之后將流感病毒第二分離物與第一分離物混合，這種第二分離物是與第一分離物不同的株。在一些方法中，劑量效價研究在混合兩種病毒分離物之前進行以測定病毒蛋白具有相等免疫原性的混合物。在一些實施方式中，流感被滅活。在這種類型的一些實施方式中，流感病毒用能有效滅活病毒的量的二乙烯亞胺(binary ethyleneimine)處理。在一些方法中，當血細胞凝集素蛋白含量最高時進行收獲。
其他實施方式包括通過收獲由以下方法制備的病毒分離物來制備的疫苗選擇在組織培養(yǎng)細胞中生長的流感病毒，其通過用有限稀釋克隆滴定流感病毒分離物以便選擇適應于組織培養(yǎng)細胞的流感病毒分離物。在一些實施方式中，所述病毒通過絨膜尿囊(也稱為尿囊腔)或羊膜接種途徑，由特異性無病原含胚雞蛋接種制備，然后進行有限稀釋克隆。在一個實施方式中，所述流感病毒首先通過含胚雞蛋的羊膜接種復制以得到適于組織培養(yǎng)細胞的接種物。
另外，本發(fā)明提供選擇在人胚胎腎細胞生長的流感病毒的方法。在一個這樣的方法中，流感病毒分離物用有限稀釋克隆滴定以便選擇適于HEK細胞的流感病毒分離物。這種方法可包括適于HEK的分離物與HEK細胞接觸，以及使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間。在這種類型的具體實施方式
中，收獲所得到的流感病毒。本發(fā)明也提供疫苗，所述疫苗包括通過這些方法得到的流感病毒分離物。所述方法也包括使所述流感病毒分離物與有效量的IX型胰蛋白酶混合，然后與所述培養(yǎng)細胞接觸一段足以使胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細胞脫離基底的時間。在一個實施方式中，使適于HEK的分離物與HEK細胞接觸的步驟在MOI小于約0.001的條件下進行。
在一些實施方式中，本發(fā)明進一步提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小于4μg人流感HA配制的人流感病毒。在一個相關的實施方式中，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小于3μg人流感HA配制的人流感病毒。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小于2μg人流感HA配制的人流感病毒。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量1.5-3.5μg人流感HA配制的人流感病毒。在具體的疫苗實施方式中，佐劑為ISCOM。在其他疫苗實施方式中，至少70％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的實施方式中，至少80％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的實施方式中，至少90％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的實施方式中，多于95％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。
本發(fā)明還提供組合疫苗，以產生保護性免疫來抵抗流感病毒，如犬流感病毒(CIV)和其他疾病，如其他犬類傳染病。本發(fā)明還提供免疫哺乳動物例如，狗、貓或馬抵抗流感的方法。也提供制備和使用傳染病(如犬類傳染病)的疫苗的方法。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的免疫原性組合物包括含有滅活CIVH3N8和佐劑的免疫原性組合物。所述佐劑通常包含水包油乳液。在一個這樣的實施方式中，所述佐劑還包含氫氧化鋁。在這種類型的一個具體實施方式
中，所述佐劑是
在另一個實施方式中，所述免疫原性組合物是疫苗。
疫苗組合物可包括每劑量約100血細胞凝集單位(HAU)至1500HAU。這可根據接受治療的個體大小和其他健康因素而變化。所述組合物通常在每劑量250和750HAU之間。在一個實施方式中，所述疫苗組合物包括每劑量約500HAU。
本發(fā)明的疫苗可任選包括藥學上可接受的免疫刺激劑，如細胞因子；生長因子；趨化因子；來自淋巴細胞、單核細胞或來自淋巴器官的細胞的細胞培養(yǎng)物的上清液；植物、細菌或寄生蟲的細胞制劑和/或提取液；或促細胞分裂劑。
本發(fā)明的疫苗可通過如下途徑給藥胃腸外給藥、肌肉注射、皮下注射、腹膜注射、皮內注射、口服、鼻內給藥、劃痕及上述的組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，疫苗通過肌肉注射給藥。
本發(fā)明還提供含有與CIV H3N8結合的抗體的來自接種動物的血清，以及純化抗體本身。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，與CIV H3N8結合的純化抗體是嵌合抗體。
本發(fā)明還提供組合疫苗，所述組合疫苗包括一種或多種滅活CIV株(如CIV H3N8)與一種或多種包括下列的其他犬病原體和/或免疫原相組合，如對以下產生免疫的免疫原犬瘟病毒；犬腺病毒；犬腺病毒2型；犬細小病毒；犬副流感病毒；犬冠狀病毒；犬流感病毒；和/或鉤端螺旋體(Leptospira)血清型，如感冒傷寒型kirschneri血清型鉤端螺旋體(Leptospira kirschneriserovar grippotyphosa)、犬型問號血清型鉤端螺旋體(Leptospira interrogansserovar canicola)、出血性黃疸問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogansicterohaemorrhagiae)和/或波蒙納問號血清型鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans serovar pomona)。可加入本發(fā)明的聯(lián)合疫苗的其他犬病原體包括支氣管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；利什曼(Leishmania)生物，如成人利什曼蟲(Leishmania major)和嬰兒利什曼蟲(Leishmaniainfantum)；包柔氏螺旋體(Borrelia)屬螺旋體，包括狹義上的(ss)博氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、博氏疏螺旋體ss、博氏疏螺旋體加利尼(B.garinii)和博氏疏螺旋體阿滋利(B.afzelii)；支原體屬(如犬支原體)；狂犬病病毒和犬艾希體(Ehrlichia canis)。
本發(fā)明提供在培養(yǎng)細胞中生長CIV H3N8的方法。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)細胞是非犬的哺乳動物腎細胞。在一個實施方式中，所述細胞為馬-達氏(Madin-Darby)牛腎(MDBK)細胞。在另一個實施方式中，所述細胞為Vero細胞。
在一些實施方式中，本發(fā)明還提供包含以小于每劑量500HAU配制的CIV H3N8的疫苗。在這些實施方式中，佐劑通常為氫氧化鋁，并且至少70％，通常至少90％的HA具有相同氨基酸序列。在其他疫苗實施方式中，至少80％的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。在另外的疫苗實施方式中，多于95％的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。
本發(fā)明的這些和其他方面將通過參考以下附圖和實施方式得到更好的理解。
圖1顯示CIV感染狗之后的平均臨床評分。用CIV感染非接種對照和接種的狗，并從感染后-2天至10天每日監(jiān)測臨床征象，如眼和鼻排出物、噴嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困難。所述臨床征象根據實施例1所述的指南評分，并將每個處理組的臨床評分對天數(shù)作圖。
圖2證明感染后狗的鼻CIV釋出。用CIV感染非接種對照和接種狗。在感染前一天(-1天)收集鼻拭子以證實狗沒有感染CIV。通過每天收集鼻拭子10天(感染后1天至10天)在感染狗中監(jiān)測鼻病毒釋出，并在單層MDCK上進行滴定。每個處理組的平均病毒效價以Log10 TCID50/mL表示，計算并對感染后天數(shù)作圖。
發(fā)明詳述 生產流感疫苗的傳統(tǒng)方法包括在含胚母雞蛋中分離株的生長，這至少部分是因為雞蛋廉價且有效，并且因為沒有大量生長流感的明顯替代選擇。在人流感的情況下這尤其確切，因為很多可用于繁殖流感病毒的細胞系還沒有經FDA認證用于人類疫苗生產，并且在組織培養(yǎng)中僅得到了很低的效價。
當疫苗在雞蛋中生產時，一般如下制備。最初，從咽拭子或相似的來源回收病毒，在雞蛋中分離。最初在雞蛋中的分離很困難，但病毒適應雞蛋宿主并且其后在雞蛋中的繁殖相對較容易。在雞蛋中生長后，純化病毒，并用福爾馬林或β-丙內酯滅活。生長跡象表明雞蛋不是最適于病毒繁殖的。例如，用于基于雞蛋的生產的常規(guī)產蛋雞群具有使病毒制劑受到在這些裝置中常見的內生病毒污染的較高風險。而且，成千上萬的雞蛋的分離接種和收集以及復雜的下游加工步驟導致大量時機能將環(huán)境污染物引入病毒制劑，這很有可能是2004年某次疫苗召回的原因。如前所述，很難完全移除雞蛋物質，而這可能導致對疫苗的敏感性。此外，所述加工完全缺乏在需要突然增加時的靈活性，這是因為沒有大量適合的雞蛋可用而造成的物流問題。也有證據表明在雞蛋中生長可降低病毒的抗原性。一致的，在雞蛋中生長A或B型流感病毒會生成具有HA突變譜的異源病毒產物。相反，在哺乳動物宿主細胞中相應生長的病毒則生成結構與最初分離的那些相同的流感病毒(Rocha，等人，J.Gen.Virol 1993；742513-2518)。而且，在哺乳動物細胞中生長的流感病毒更容易得到在人血清中中和并且HA抑制的抗體，且抗體效價高于雞蛋中生長的對照(Oxford，等人，Bull WHO 1987；65181-187)。
遺憾的是，所有流感病毒株看來均在雞蛋中生長，而迄今很多流感病毒株在組織培養(yǎng)細胞中生長不佳，且其中在組織培養(yǎng)細胞中生長的那些經常不能以產生有效疫苗所需的量生長。本發(fā)明人現(xiàn)在公開了當用有限稀釋克隆(limiting dilution cloning)使病毒在組織培養(yǎng)細胞中生長時，可產生適于組織培養(yǎng)的分離物。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在組織培養(yǎng)細胞(如，Vero細胞)中繁殖時，由通過含胚雞蛋的羊膜接種得到的病毒的復制能產生可以復制并產生高水平HA的病毒群。所得到的病毒分離物產生的HA效價幾乎與用含胚雞蛋得到的效價相等，而HA效價為疫苗效力的一個重要量度。因此，本發(fā)明的一個重要方面涉及生產適于組織培養(yǎng)和適用于流感疫苗(尤其是哺乳動物疫苗)生產的流感病毒分離物的方法。所述方法涉及使用有限稀釋克隆來分離和鑒定適于組織培養(yǎng)的病毒。所得到的分離物可經處理以生產疫苗。因此，本發(fā)明也涉及生產改進的流感病毒疫苗的方法。
為此，本發(fā)明提供選擇適于組織培養(yǎng)的流感病毒的方法，該方法通過用有限稀釋克隆滴定病毒并重復該過程2次或更多次來達成。在一些方法中，所用組織培養(yǎng)細胞是HEK細胞?？捎靡鹊鞍酌富虻韧鞍酌冈黾硬《具M入細胞的效率。其他方法包括滴定胰蛋白酶以確定所使用的胰蛋白酶批次和所用細胞的最佳濃度。對所用的每一種流感病毒以及對具體細胞最佳感染復數(shù)(MOI)的測定也有助于組織培養(yǎng)繁殖成功。分離的適于組織培養(yǎng)的病毒可用來根據標準方法生產疫苗。在一些實施方式中，所述疫苗包括佐劑ISCOM的使用。在一些實施方式中，所述疫苗包括佐劑氫氧化鋁的使用。當疫苗中包括超過一種的病毒株或分離物時，所述方法可包括以免疫學等量混合兩種物質。本發(fā)明提供適于組織培養(yǎng)的病毒分離物和由此制成的疫苗的方法和組合物。
I.選擇適于組織培養(yǎng)的病毒的方法 用于本發(fā)明方法的病毒來源對本發(fā)明不重要。例如，病毒可從感染的動物或患者分離得到；作為WHO的種子病毒原液，可從適當?shù)慕M織(如，ATCC)購買得到；或從科研實驗室得到。具體來說，已知CIV引起包括肺炎的嚴重呼吸道疾病。因此，顯示這些癥狀的狗是可用的來源。分離病毒的適合標本包括鼻洗滌物/抽出物、鼻咽拭子、咽喉拭子、支氣管肺清洗物、氣管抽出物、胸膜穿刺液、唾液、泄殖腔涂片和尸體解剖標本。來自活體動物的標本優(yōu)選早期收集，且在某些情況下，在發(fā)病后4天內收集。標本可用適合的運輸介質收集，并貯存在該介質中直至使用，或者立即使用。如果貯存，則病毒可在較低溫下保存，如在4℃下，以保證其存活力。要從標本中分離流感病毒，可以移除大量污染物(如，通過離心)并將上清液接種到各種稀釋倍數(shù)的各種細胞。或者，來自動物的病毒最初可在母雞雞蛋中生長?？捎梅椒ㄗC實在過程中的任何時間點的病毒分離物確實是流感。
可用各種篩選方法證實所需流感病毒存在于制備適于組織培養(yǎng)的分離物的過程中的任何時間?？赏ㄟ^使用任何已知和/或適合的測定流感病毒的測定來篩選病毒。這種測定包括(單獨或組合)用如逆遺傳學、重配、互補和/或感染的方法進行的病毒復制、定量和/或定性滅活測量(如，通過抗血清)、轉錄、復制、翻譯、病毒體合并、病毒力、HA或NA活性、病毒產率和/或形態(tài)發(fā)生。
A.組織培養(yǎng)細胞 允許流感病毒生長的任何哺乳動物宿主細胞可用于本發(fā)明的方法。通常，所述宿主細胞適合排除外源因子，具有可根據WHO對疫苗生產的要求確認的傳代數(shù)。很多細胞系可用于分離和繁殖流感病毒。已使用的一些細胞系包括Vero細胞(猴腎細胞)、MDCK細胞(馬-達氏犬腎細胞))、BHK-21細胞(幼倉鼠腎)和BSC(猴腎細胞)和HEK細胞(人胚胎腎細胞)。因此，可用允許流感病毒生長的任何組織培養(yǎng)細胞。適合的細胞包括但不限于Vero、MDBK、BK21、CV-1和任何哺乳動物胚胎腎細胞(如，HEK)。在一些實施方式中，使用Vero細胞或哺乳動物胚胎腎細胞。在一些實施方式中，使用人胚胎腎細胞(HEK細胞)。
本領域的技術人員熟知用于上述細胞系繁殖的適合組織培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基可含有濃度高達20％v/v的適合血清(如，胎牛血清)。本領域的技術人員應理解，可以使用含有少于20％v/v血清(2-5％v/v)的培養(yǎng)基來繁殖上述細胞系。
B.優(yōu)化用于細胞的胰蛋白酶 為了在細胞培養(yǎng)物中生長出高效價的病毒原液，可用適量的蛋白酶活化血細胞凝集素，使之內化至細胞內。含有蛋白酶的溶液可直接加入到分離物中，或分離物可稀釋至用于疫苗生產的分離物生長的蛋白酶中。所述蛋白酶可用來將病毒稀釋至適合生長的MOI。
蛋白酶可為能激活HA內化而不破壞病毒蛋白使其不能生長和/或感染細胞的任何蛋白酶。這些蛋白酶包括但不限于原核生物蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶和枯草菌蛋白酶(A)，例如，IX型胰蛋白酶。
所用的蛋白酶的量應足以激活病毒，并且對細胞的毒效非常小。毒效可通過鑒定對細胞的損傷特征來分析，如脫離平板或基底、存在細胞碎片、出現(xiàn)死細胞和缺乏活力的細胞。因此，“有效量的胰蛋白酶”是指，當其使用足夠時間時，允許胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細胞從基底分離或引起其他毒效者。也可使用蛋白酶滴定來增加組織培養(yǎng)中活性病毒的產量。滴定包括確定引起細胞最小損傷程度的胰蛋白酶的最大量。這個量可隨所用的組織培養(yǎng)細胞以及蛋白酶批次而變化。因此，可在使用之前滴定新的蛋白酶批次以建立最適水平，且每個蛋白酶可對每種組織培養(yǎng)細胞滴定。滴定涉及用所述蛋白酶分步稀釋接種組織培養(yǎng)細胞并將其孵育一段合適的時間。例如，可用蛋白酶半步稀釋(10-0.5)。孵育時間隨細胞系變化，但通常在約2天和7天之間。蛋白酶水平可用所用細胞的通常孵育時間測定。例如，如果4天孵育對流感病毒最好，則蛋白酶可通過在蛋白酶單獨存在下孵育約4天測試。然后可用對細胞沒有毒性或毒性非常低的蛋白酶最低倍稀釋物。可用于哺乳動物組織培養(yǎng)細胞(如Vero細胞)的胰蛋白酶濃度范圍為約0.5μg/mL至約10μg/mL，但更常用約2.5μg/mL培養(yǎng)基。
一旦蛋白酶的最適水平確定，病毒可在含有適量蛋白酶(如，胰蛋白酶)的感染培養(yǎng)基中稀釋，以便當病毒加入到細胞培養(yǎng)基時達到最適水平。最適量的胰蛋白酶可用于有限稀釋克隆以產生適于組織培養(yǎng)的分離物以及用于所述分離物的生長和收獲。
C.有限稀釋克隆 典型的病毒培養(yǎng)物是異源的。因此，例如在微滴定板的孔中的單個病毒顆粒在傳染性、復制等方面可以變化。系列稀釋用于選擇培養(yǎng)中的病毒亞群，例如，最適于細胞的亞群。系列稀釋涉及系列地稀釋病毒培養(yǎng)物直至不含病毒，例如，用來測定最佳MOI。這通常涉及一系列10倍稀釋，但可根據病毒效價變化。
有限稀釋通常用于鑒定對細胞產生病毒效應的最高稀釋倍數(shù)。所述病毒效應可為致細胞病變效應(CPE)。致細胞病變效應為流感病毒感染引起的對細胞的任何效應。這些效應包括但不限于細胞變圓(cell rounding)、退化、脫落、凋亡、活性氧物質(ROS)誘導、細胞變成顆粒狀然后成片段化，以及細胞脫離支持物(如組織培養(yǎng)皿)。收獲最高倍稀釋物的孔。然后將所收獲的病毒稀釋至不含病毒，并且重復該過程。系列10倍稀釋液通常用適合的培養(yǎng)基配制(含或不含胰蛋白酶)，且將0.2mL的每種稀釋液加入含有組織培養(yǎng)細胞的平板或微滴定板的孔中，并孵育一段足以鑒定細胞的CPE的時間。因為血清滅活胰蛋白酶，所以培養(yǎng)基通常不含血清。收獲含有引起CPE的最高倍稀釋物的孔或平板，然后稀釋，并且重復該過程。該過程通常重復至少兩次，但可重復多達5次。在一些情況下，該過程重復3次。
通過本發(fā)明的方法生產的病毒培養(yǎng)物特征在于病毒中HA蛋白序列的同質性。有很多方法可用于測量序列同質性程度。例如，對HA蛋白本身測序或通過對編碼這種蛋白的RNA測序。本發(fā)明的方法生產的病毒制劑通常含有其中至少70％的HA蛋白具有相同氨基酸序列的病毒。在一些實施方式中為80％，或至少90％的HA蛋白具有相同氨基酸序列。
D.檢測流感病毒的方法 可進行檢測以證實在本法明方法的過程中任何時間流感病毒的活性和存在。例如，可如下鑒定血細胞凝集。如果病毒具有表面HA蛋白，其可附著在RBC上并使其凝集。如果樣品中病毒濃度很高，則當樣品與RBC混合時，將形成病毒和RBC晶格。這種現(xiàn)象稱為血細胞凝集。這是一種檢測使血細胞凝集的病毒(如流感病毒)的存在和效價的簡單方法。如果樣品中沒有足夠病毒使RBC血細胞凝集，則它們在孔的底部形成小球。以顯示完全血細胞凝集的最高稀釋倍數(shù)作為終點。病毒效價表達為HA單位(HAU)，為每毫升稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。例如，在50μL中1/32倍稀釋時孔中有完全血細胞凝集，但在下一個最高稀釋倍數(shù)的孔中沒有，則所述病毒效價為每50μL32HAU或每mL 640HAU。
可用于鑒別和定量流感病毒的其他測定包括CPE測定(如本文所討論)，Western印跡(Western blot)、ELISA、PCR和用對病毒某些部分(具體來說，為HA抗原)有特異性的抗體和/或探針鑒別流感病毒的其他方法。
II.生長和收獲方法 在生產病毒分離物之后，收獲所述分離物。可用標準方法。所收獲的分離物可儲存供以后使用，或可用于用標準方法生產疫苗。當產生最大量病毒時；當產生最大量血細胞凝集素時，如用HA測定方法測量；和/或當細胞裂解時，可收獲病毒。
在得到適于組織培養(yǎng)的分離物后，所述分離物可生長并收獲。生長和收獲適于組織培養(yǎng)的病毒的方法對本發(fā)明不重要，并且可用標準方法。然而，在一些實施方式中，病毒在其最適的組織培養(yǎng)細胞中生長。所收獲的病毒分離物可儲存供以后使用，或可用于用標準方法生產疫苗?？赏ㄟ^在適量的蛋白酶(如胰蛋白酶)中以適合的MOI將病毒加入細胞中，使病毒在適合的組織培養(yǎng)細胞中生長一段足以產生高效價的病毒和/或直至細胞裂解的時間。當產生最大量病毒時；當產生最大量血細胞凝集素時；和/或當細胞裂解時，可收獲病毒。本文業(yè)已發(fā)現(xiàn)，病毒在雞蛋中(在尿囊腔或通過羊膜接種)的最適預生長可增強病毒在組織培養(yǎng)細胞中的適應性。
A.在雞蛋中的預生長 雞蛋培養(yǎng)物的傳代顯示能促進病毒在組織培養(yǎng)細胞中的適應性。因此，使病毒分離物在含胚母雞雞蛋中根據標準技術預生長是可取的。例如，所述病毒注射入尿囊腔或通過9-12天齡的含胚雞蛋的羊膜，并且使其擴增約三天。然后收集尿囊液或羊膜液，收集的材料可以適合的MOI在組織培養(yǎng)中生長，用于疫苗生產?；蛘撸占牟牧峡芍苯佑糜谟邢尴♂尶寺?。已發(fā)現(xiàn)，通過羊膜的雞蛋接種能濃集可復制的病毒，并且在Vero細胞中生長時可以產生高水平的HA蛋白。
B.MOI 本文鑒定出低MOI產生較好和/或較高效價病毒分離物。不受具體理論的限制，人們相信低的MOI減少缺陷病毒顆粒的量，并且產生更有效的感染過程。在一些實施方式中，所用的MOI小于0.01(每100個細胞1個病毒)。在其他實施方式中，MOI小于0.003。在一些實施方式中，MOI小于0.001。MOI可選擇在約3至4天中產生高效價病毒和/或裂解細胞的最低MOI。
III.疫苗生產 一旦從適于組織培養(yǎng)的病毒得到所需的分離物，則病毒可用于生產疫苗。已知很多類型的病毒疫苗，包括但不限于減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和片段疫苗。
A.減毒病毒生產方法 減毒疫苗是已經減毒或改變而不再引起疾病的活的病毒疫苗。這些可通過多種方法生產，例如，在組織培養(yǎng)中生長，重復傳代，并且遺傳操作突變或去除涉及致病的基因。適于組織培養(yǎng)的分離物可用于用標準方法生產減毒病毒。例如，一個病毒基因和/或蛋白經鑒定涉及致病或涉及疾病表現(xiàn)，則其可被突變或改變以便所述病毒仍能在細胞內感染和復制，但不引起疾病。一個這樣的實例是誘變HA1/HA2切割位點。所述適于組織培養(yǎng)的病毒可用任何標準方法減毒，例如，冷適應病毒。
減毒病毒生產之后，可用標準方法制備疫苗(如，本文的方法)?？捎脴藴史椒兓《?，例如，用尺寸排阻層析?？捎脴藴首魟┖鸵呙缰苿┲苽湟呙纾鏘SCOM、納米珠、礦物油、植物油、氫氧化鋁、皂甙、非離子去污劑、角鯊烯和嵌段共聚物，可單獨使用或作為輔助劑組合使用。目前美國和歐洲市售的疫苗不含任何佐劑(活疫苗和死疫苗)，這是疫苗中需要如此高濃度的HA(每病毒株15μg的HA，三價配方含45μg的HA)的部分原因。
B.滅活、亞單位和片段病毒疫苗生產方法 一旦得到所需病毒，可將其用于生產免疫原性組合物，例如，疫苗?！八馈币呙绲膶嵗菧缁?、片段和亞單位疫苗。這些可用標準方法制備以治療流感。
例如，亞單位疫苗一般涉及僅分離激活免疫系統(tǒng)的病毒部分。在有流感的情況下，用純化HA和NA制備亞單位疫苗，但病毒蛋白的任何混合物可用于生產亞單位疫苗。一般來說，病毒蛋白(如HA)從重組病毒形式中提取，并且亞單位疫苗經配制含有來自WHO推薦的病毒株的這些病毒蛋白的混合物。例如，1995-1996年的疫苗含有來自兩種A株和一種B株(A/Singapore/6/86(H1N1)；A/Johannesburg/33/94(H3N2)；和B/Beijing/84/93)的HA和NA。對于H3N8 CIV來說，可用H3和/或N8抗原。
一般來說，病毒蛋白從病毒中提取，并且亞單位疫苗經配制含有這些病毒蛋白的混合物。蛋白可用標準方法從適于組織培養(yǎng)的分離物中分離用于亞單位疫苗。或者，蛋白可用重組技術生產。本領域已知生產具體蛋白的技術。
片段疫苗一般涉及用去污劑處理包膜病毒，以使其中的蛋白溶解。在流感病毒的情況下，HA和NA溶解。例如，可用非離子去污劑如Triton X-100生產片段疫苗。
滅活病毒疫苗通過滅活收獲的病毒并用已知方法配制來制備，以用作誘發(fā)哺乳動物免疫反應的疫苗。滅活步驟、亞單位純化和/或片段可在尺寸排阻純化病毒之前或之后進行。例如，滅活疫苗的生產可涉及去除細胞材料、滅活病毒、純化和溶解病毒包膜。其他實施方式可涉及病毒純化，然后滅活，例如，用甲醛。
一旦制備，任何疫苗(如，減毒、片段或滅活)可被檢測以確定所述病毒和/或疫苗保持相似的抗原性，在哺乳動物中產生血清學反應，和/或提供對抗哺乳動物疾病的保護。
C.收獲病毒的進一步加工 1.收獲病毒的凈化 收獲后和/或滅活收獲的病毒后，可以通過例如，沉淀去除微載體并通過滲濾濃縮上清液去除細胞材料和其他干擾材料。在組織培養(yǎng)細胞中生長的流感將含有宿主細胞蛋白。可能需要上清液的一些進一步凈化。細胞DNA可通過酶處理(如，Benzonase)去除。在最初去除干擾材料之后，病毒可用標準方法滅活?；蛘?，可在通過，如尺寸排阻層析進一步純化后進行滅活。
2.病毒滅活 流感病毒可以任何方法和用任何試劑滅活。滅活方法對本發(fā)明不重要。滅活可發(fā)生在污染或干擾材料去除之后。滅活可包括使用任何已知滅活劑。這些滅活劑包括但不限于UV照射、甲醛、戊二醛、二乙烯亞胺(BEI)和β-丙內酯。在一些實施方式中，用BEI是因為已知其破壞病毒核酸而不破壞病毒蛋白。此外，BEI不受蛋白含量和溫度的影響。滅活劑以高至足以滅活溶液中每個病毒顆粒的濃度使用。例如，BEI可以約0.5和10mM之間的終濃度使用，包括但不限于1.5、3、4、5和6mM，并且包括約1至6和1至3mM的范圍。在一實施方式中，BEI以約6mM的濃度使用。BEI通常以約1.5mM的濃度使用并且在37℃下孵育48小時。在CIV的疫苗制備中，BEI可以約0.5和10mM之間，通常為4至8mM，經常為5和7mM之間的終濃度使用。在一個實施方式中，BEI以約6mM的濃度使用。在一些實施方式中，滅活在對滅活劑適合的pH和溫度下發(fā)生。可選擇pH和溫度以保證得到的滅活病毒仍然有免疫原性。滅活可在適當?shù)臄嚢柘逻M行以保證所述試劑與溶液中所有的病毒顆粒相接觸。
滅活后，可用以下方法去除滅活劑，該方法包括但不限于，滅活劑的滅活、滅活劑的沉淀、滅活劑的過濾，以及層析，或這些方法的混合。例如，BEI可通過加入硫代硫酸鈉滅活。殘留的BEI也可通過尺寸排阻方法從病毒/病毒蛋白分離。一旦確定無害(缺乏活病毒)，病毒溶液可進一步加工以生產疫苗。
3.進一步加工 可進一步加工病毒溶液，例如，以去除污染物，進一步濃縮病毒，以提供較強的免疫反應。進一步加工的一些實例包括用標準方法最初去除細胞材料、去除細胞DNA、濃縮和在佐劑中配制。在組織培養(yǎng)細胞中生長的流感含有宿主細胞蛋白。例如，在人胚胎腎細胞(HEK)中繁殖的流感將含有HEK蛋白，或如果在MDBK或VERO細胞中生長，則分別含有牛或猴蛋白。這些蛋白可用本領域的技術人員已知的方法檢測。已知很多去除DNA的方法，包括加入各種已知降解細胞DNA的DNA酶，例如，Benzonase?？蛇M行起始濃縮步驟以提供最適于進一步層析純化的濃度的病毒溶液。這可用任何標準方法進行，包括但不限于用分子量截留為約100K的膜(如MWCO為100K的聚砜膜)進行超濾。病毒溶液可濃縮至約100倍，包括但不限于90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍和5倍。在一些實施方式中，病毒溶液濃縮至約50倍，但更通常包括20倍和30倍。
4.純化 可用標準方法如密度離心純化病毒。在一些實施方式中，病毒通過尺寸排阻凝膠層析純化。使用尺寸排阻的一個優(yōu)點是產率優(yōu)于用密度離心純化?？捎玫玫讲《炯兓娜魏纬叽缗抛枘z?？捎萌魏螛藴誓z，如瓊脂糖凝膠(如Sepharose CL-2B)。在一些實施方式中，柱子長度為約70至120cm以得到所需純化，包括但不限于約80、90、100和110。在其他實施方式中，柱子長度為約80至100cm，例如柱子長度為約90cm。在一些實施方式中，用多個柱子串聯(lián)可得到所述長度，如兩個45cm的柱子或3個30cm的柱子(如，長度為30-32cm，直徑為30cm的柱子)。濃縮的病毒可用標準方法上柱，如，所述病毒可以5-10％的柱體積(CV)，通常5-7％CV上柱。然后可以從柱子上收集病毒峰，用標準方法(例如，超濾)進一步濃縮。在一些實施方式中，用總長度為90cm的2至3個柱子串聯(lián)，聚集最終峰，用超濾濃縮。
5.包膜蛋白溶解 濃縮的病毒峰材料可用標準方法溶解，如用非離子去污劑?？梢赃M行溶解以制備ISCOM配方的材料(見下文)。非離子去污劑的實例包括但不限于壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylfucamide)(Mega 9)、TritonX-100、辛基葡萄糖苷、毛地黃皂苷、C12E8、Lubrol、Nonidet P-40和Tween(如Tween 20、80或120)。溶解后，病毒可用于生產疫苗，和/或可加入佐劑。例如，對于ISCOM佐劑生產，可加入脂質混合物，以有助于ISCOM形成。所述脂質混合物可包括磷脂酰膽堿和合成膽固醇。在一些實施方式中，所述病毒在室溫下邊攪拌邊用Mega 9破壞，然后可加入脂質混合物(磷脂酰膽堿和膽固醇)，并繼續(xù)攪拌。
6.佐劑形成 疫苗和/或藥物組合物中可加入適合的佐劑。佐劑的實例包括含有油和水的乳液的那些，以及還包含氫氧化鋁的那些。在后一種情況下，可使用市售的氫氧化鋁，例如，Alhydrogel，(Superfos Biosector，F(xiàn)rederikssund，Denmark)和Rehydrogel(Reheis Inc.)。油和水的乳液通常包含礦物油或可代謝的油(如，植物油、魚油)。非離子去污劑或表面活性劑可用作乳化劑。乳化劑的實例包括Tween 80/Span 80、Arlecel 80/Tween 80和Montanides(Seppic，Paris，F(xiàn)rance)。在佐劑乳液的情況下，一般5-25％的體積是油，75-95％的體積是水。在一些實施方式中，佐劑乳液為20％體積的油和80％體積的水。氫氧化鋁的量一般為水相的約5％和15％之間。在一些實施方式中，
是佐劑。
對于一些實施方式，ISCOM用作輔助劑。ISCOM是免疫刺激復合物的首字母縮合詞，Morein等人(Nature 308457-460(1984))描述了該技術。ISCOM是新型疫苗遞送系統(tǒng)并且與傳統(tǒng)佐劑技術不同。ISCOM可方便地以兩種方式中的一種形成。在一些實施方式中，抗原在其配制期間物理上并入結構中。在其他實施方式中，ISCOM-基質(例如，通過Isconova提供)不含抗原，但通過終端使用者在免疫之前與選擇的抗原混合。在混合后，抗原在溶液中與ISCOM-基質一起存在，但在物理上不并入結構中。
一般來說，在ISCOM中，純化抗原基于在關鍵濃度下Quil A自發(fā)形成膠束，并通過疏水/親水鍵捕獲純化的免疫原的能力以多聚體形式存在。這些膠束結構大小為35nm并很容易被免疫系統(tǒng)識別。與傳統(tǒng)的儲存輔助劑不同，ISCOM很快從注射部位清除和引出局部、體液和細胞介導的免疫反應。在具體的實施方式中，ISCOM如下形成。所述病毒用標準方法溶解，如用非離子去污劑(如Mega-9、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黃皂苷、Nonidet P-40、C12E8、Lubrol、Tween-80)。加入脂質混合物以有助于ISCOM形成。所述脂質混合物可包括磷脂酰膽堿和合成膽固醇。在一些實施方式中，所述混合物首先在室溫下邊攪拌邊用非離子去污劑處理，然后可加入脂質混合物(例如，等份數(shù)的磷脂酰膽堿和膽固醇)，并繼續(xù)攪拌。將Quil A(皂苷的純化糖苷)加至病毒脂質混合物中并繼續(xù)攪拌?？杉尤胨鯭uil A得到最終濃度為約0.01至0.1％的Quil A，包括但不限于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08和0.09的Quil A。在一些實施方式中，所述最終濃度為約0.05％。去除所述非離子去污劑(例如，通過與醋酸銨滲濾)。ISCOM的基質通過Quil A形成。通過電子顯微鏡觀察，ISCOM粒子的形態(tài)學顯示典型的籠狀結構，大小為約35nm。ISCOM形成時期可用切向流滲濾精簡。ISCOM顯示了基于Quil A在關鍵濃度下自發(fā)形成膠束和通過捕獲純化抗原的疏水/親水鍵的能力呈多聚體形式的純化抗原。ISCOM的形成可通過電子顯微鏡證實其已形成的典型籠狀結構而證實。ISCOM呈遞的免疫反應顯示至少比作為凝集膜蛋白膠束單獨呈遞的相似抗原負荷量的免疫反應好十倍。還發(fā)現(xiàn)ISCOM能誘發(fā)細胞介導的反應，這在用傳統(tǒng)的整個病毒疫苗時未發(fā)現(xiàn)。在一些實施方式中，最終濃度為約0.05％。
也可在疫苗和/或藥物組合物中加入免疫刺激劑。免疫刺激劑包括單獨使用或組合使用的細胞因子；生長因子；趨化因子；來自淋巴細胞、單核細胞或來自淋巴器官的細胞的細胞培養(yǎng)上清液；植物的細胞制劑和/或提取物；細菌、寄生蟲的細胞制劑和/或提取物；或促細胞分裂劑，以及從其他病毒和/或其他來源(如雙鏈RNA、CpG)得到的新型核酸；嵌段共聚物；納米珠或本領域已知的其他化合物。
佐劑和其他免疫刺激劑的具體實例包括但不限于溶血卵磷脂；葡萄糖苷(如皂苷和皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100)；陽離子表面活性劑(如DDA)；季銨烴基鹵化物(quaternary hydr℃arbon ammonium halogenides)；復合多元醇；聚陰離子和多原子離子；聚丙烯酸，非離子嵌段聚合物(如Pluronic F-127)；和MDP(如，N-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?降-胞壁酰基-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺、N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺)。
D.疫苗效力 本領域熟知測定亞單位、減毒、片段和/或滅活病毒疫苗是否與臨床分離物或從其中得到的適于組織培養(yǎng)的分離物的病毒維持相似抗原性的方法。這些已知方法包括抗血清或抗體、HA和NA活性和抑制以及DNA篩選(如探針雜交或PCR)的應用，以證實編碼抗原決定簇的供者基因在滅活病毒中存在。本領域也熟知鑒別疫苗是否誘導血清學反應的方法，其包括用疫苗免疫待測動物，然后接種致病病毒，并鑒別疾病癥狀存在還是不存在。因此，流感疫苗效力可在動物中檢測，通常用白鼬、小鼠和豚鼠?？捎醚毎种?HI)或神經氨酸酶抑制(NI)方法檢測抗體效價，或檢測組織培養(yǎng)物中的病毒中和抗體(微中和檢測)，這些方法一般均已知。挑戰(zhàn)性研究可提供評估疫苗的重要信息。
適合治療的藥物組合物和/或疫苗包括病毒或病毒亞單位與無菌水性或非水性溶液混合物。生產藥物組合物和/或疫苗的方法可包括分離適于組織培養(yǎng)的分離物，生長和純化病毒分離物，滅活和/或減毒病毒并以適合的效價與生理上可接受的稀釋劑和免疫刺激劑混合?；蛘撸《镜鞍卓山浖兓杂糜趤唵挝灰呙?，并以適量與生理上可接受的稀釋劑和免疫刺激劑混合。可純化足夠的病毒，以使得沒有可干擾滅活步驟和/或病毒的免疫原性的污染材料或物質。
適合效價的病毒或適合濃度的病毒蛋白可與稀釋劑和免疫刺激劑混合。TCID50測量是一種測量病毒效價的方法(感染50％組織培養(yǎng)物劑量)。例如，可用約105至1012的TCID50(基于預滅活效價)的效價，包括但不限于106、107、108、109、1010和1011。任選所述效價可用HA效價分析，并在疫苗中每個病毒可包含約1至30μg的HA，包括但不限于用于佐劑制劑的1至10μg和用于非佐劑疫苗的1至30μg。在一些實施方式中，效價為約15μg。因此，例如，當未加佐劑疫苗中包括3種病毒時，1個成人劑量含有45μgHA(3種病毒株，每一種15μg)的等同物。在其他實施方式中，每株的量可不同(例如，取決于抗原性)，但最終濃度為約1至約60μg HA，包括2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50和55μg。在另一個實施方式中，預期佐劑疫苗含有的HA量為約1至30μg，包括2、5、10和20μg。疫苗的體積通常為約50μl和5000μl之間，包括100、500、1000、2000和5000μl。
可用生理上可接受的標準稀釋劑，例如，EMEM、Hanks平衡鹽溶液和磷酸鹽緩沖液(PBS)和生理鹽水。
疫苗和/或藥物組合物中可加入適合的免疫刺激佐劑。免疫刺激佐劑的實例包括但不限于單獨使用或組合使用的礦物油、植物油、氫氧化鋁、皂苷、非離子去污劑、角鯊烯、嵌段共聚物、納米珠、ISCOM、ISCOM基質或本領域已知的其他化合物。
除了佐劑外，藥物組合物中也可包括可用于抗流感的任何適合的抗病毒劑。這些抗病毒劑包括例如，金剛乙胺(rimantadine)、金剛烷胺(amantadine)、神經氨酸酶抑制劑(如zanamivir和oseltamivir)、γ干擾素、胍、羥基苯并咪唑、干擾素α、干擾素β、縮氨基硫脲(thiosemicarbarzones)、美替沙腙(methisazone)、利福平(rifampin)、利巴韋林(ribavirin)、嘧啶或嘌呤類似物和磷甲酸鈉(foscarnet)。
含有多于一種病毒或病毒蛋白株的疫苗可用本發(fā)明的方法生產?；旌衔锟擅庖咴缘味ㄒ蕴峁┻m當?shù)牡韧庖咝?。免疫原性滴定意指生產的最終產物平分免疫性的不同。例如，如果制備A株和B株混合物，且A株有5倍的免疫原性，則混合株的比例為A株∶B株為1∶5。
IV.疫苗給藥 疫苗組合物和/或藥物組合物的給藥可用于預防性目的。當預防性提供時，組合物在任何流感病毒感染癥狀明顯出現(xiàn)之前提供。組合物的預防性給藥用于預防或減弱任何后續(xù)感染。藥物組合物和/或疫苗可以本領域已知的任何方式給藥，包括通過吸入、鼻內(例如用減毒疫苗)、口服或胃腸外給藥。胃腸外途徑給藥的實例包括皮內、肌肉內、靜脈內、腹膜內和皮下。在一些實施方式中，疫苗經上臂肌肉內或深層皮下注射給藥。對于之前沒有接種或沒有接觸流感(未致敏)的一些兒童來說，第二劑量可間隔2至4周給藥。一或多個加強劑疫苗可在最初免疫之后的適合的時間給藥。
給藥有效量的疫苗和/或藥物組合物。有效量是足以取得諸如誘導足夠體液或細胞免疫等所需生物學效應的量。這可能取決于疫苗類型、接受者的年齡、性別、健康狀況和體重。所需生物效應的實例包括但不限于無癥狀產生、癥狀減輕、組織或鼻內分泌物的病毒效價減少、完全防止流感病毒感染和部分防止流感病毒感染。
在一些實施方式中，免疫學上有效量的CIV疫苗為每劑量約100HAU至約1500HAU。組合物通常為每劑量250至750HAU之間。在一個實施方式中，疫苗組合物包括每劑量約500HAU。
當以溶液給藥時，所述疫苗可以水溶液、糖漿、酏劑或酊劑的形式制備。這些制劑在本領域已知，并且通過將抗原和其他適合的添加劑溶于適合的溶劑系統(tǒng)中來制備。這些溶劑包括例如，水、鹽水、乙醇、乙二醇、甘油和A1液。適合的添加劑包括經鑒定的染料、香料、甜味劑和抗微生物的防腐劑，如硫汞撒(thimerosal)(乙基汞硫代水楊酸納)。這些溶液可用標準方法穩(wěn)定，例如，通過加入部分水解的明膠、山梨醇或細胞培養(yǎng)基，并可用標準方法緩沖，用諸如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀的試劑。液體制劑也可包括懸浮液和乳液。懸浮液的制備(例如)用膠體磨，乳液的制備(例如)用勻漿器。
V.病毒株和WHO 為了有時間生產足夠疫苗原液，必須在流感季節(jié)來臨之前決定好對于今年的疫苗(冬季用)來說用流感A株和B株的哪一種。有一個世界性的精巧而復雜的流行病學監(jiān)控系統(tǒng)來幫助這些決定。此外，WHO通常制備用于生產疫苗的種子病毒。
有16種已知HA亞型和9種已知NA亞型。HA和NA蛋白的多種不同組合是可能的。目前僅有一些流感A亞型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人群中普遍流行。其他亞型在其他動物種中最常見。例如，在馬中致病的H7N7和H3N8病毒，最近顯示H3N8也在狗中致病。
已知感染鳥類和人類的禽流感A病毒三種顯著亞型為流感A H5-H5感染，如，HPAI H5N1病毒、流感A H7和流感A H9。然而，感染人類并引起流行或大流行的下一批病毒株可來自任何亞型。
可用標準方法得到病毒，例如，從患者樣本、美國菌種保藏中心(theAmerican Type Culture Collection)(或其他保藏中心)，或從研究病毒的其他特定實驗室得到。在一些實施方式中，病毒從WHO或CDC得到，包括季節(jié)性病毒和可能的大流行株。
VI.血清學反應的檢測 本領域也熟知鑒別疫苗是否誘導血清學反應的方法。例如，可將免疫原性化合物/疫苗注射入測試動物，并在血清中鑒定抗病毒抗體。本領域熟知鑒別疫苗是否有保護性的方法，該方法包括用疫苗免疫測試動物，然后用致病病毒接種，并鑒別疾病癥狀存在還是不存在。
可進行血細胞凝集抑制試驗以鑒別對血細胞凝集素的血清學反應的存在?？稍谒袦y試血清樣品上用火雞紅細胞(RBC)進行血細胞凝集抑制(HAI)測定，例如，通過用已知流感亞型如CIV(H3N8)。簡言之，在V形底的96孔微滴定板中的PBS中進行測試血清的兩倍系列稀釋。將含有4-8HAU/50μl CIV的等體積病毒懸浮液加入到含有測試血清的各孔中，并該板在室溫下孵育30分鐘。然后加入等體積的0.5％的火雞RBC懸浮液。然后將該板在室溫下孵育30分鐘并讀取HAI結果。顯示HA抑制的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)被認為是測試樣品的HAI效價。
測定抗流感病毒抗體存在的其他方法包括神經氨酸酶抑制測試、Western印跡、ELISA、PCR和鑒別流感病毒抗體的其他方法。這些測定是本領域已知的。
VII.實施例 如下實施例提供制備用于生產主要種子的均勻病毒群的流感病毒分離、適應和純化步驟。這些實施例使用Vero細胞(美國菌種保藏中心，CCL81)，但可用流感病毒適用的任何細胞類型。
實施例1化學試劑和生物試劑 所用感染培養(yǎng)基含有1L DMEM(Cambrex，目錄號04-096)或等同物，貯存在2-7℃；20mL L-谷氨酰胺(Cellgro，目錄號25-005-CV)或等同物，貯存在-10℃或更低溫度，一旦融解，其可貯存在2-7℃多達4周；以及IX型胰蛋白酶(Sigma產品號T0303，CAS No.9002-07-7)或等同物，分裝并冷凍貯存在-5至-30℃。在感染細胞之前新配制感染培養(yǎng)基。
細胞培養(yǎng)基制備如下1L DMEM、20mL L-谷氨酰胺、50mL胎牛血清(Gibco目錄號04-4000DK)或等同物(注意來自無BSE的國家)。完全培養(yǎng)基制備后在2-7℃下貯存不多于30天。
用于傳代細胞的EDTA-胰蛋白酶(Cellgro目錄號98-102-CV或等同物) 貯存在-5至-30℃，由制造商指示有效日期。
實施例2細胞培養(yǎng)物制備 因為用于病毒感染步驟的蛋白酶稀釋可根據批次變化，在使用之前滴定新的胰蛋白酶批次以建立最適水平。滴定的實施例是在含有L-谷氨酰胺的DMEM中系列稀釋IX型胰蛋白酶，用半對數(shù)稀釋(10-1、10-1.5、10-2、10-2.5等)。用含有新鮮匯合單層Vero細胞的96孔板，用280μL的PBS將板的每個孔洗滌2次。洗滌后立即按行加入200μL每個稀釋倍數(shù)的IX型胰蛋白酶至板中。然后將所述板在37℃加或減2℃下在5％CO2中孵育，并在4天后觀察細胞。選擇那些顯示對細胞健康狀況沒有或很少影響的胰蛋白酶的最低稀釋倍數(shù)作為胰蛋白酶的適合濃度，以用于流感感染的分離和優(yōu)化。令人滿意和常見的是每個濃度內接種的孔之間很少或沒有變化。
對于在Vero細胞中的病毒有限稀釋克隆來說，用單層細胞匯合，通常為3-4天齡的細胞；在96孔Falcon微測定板中生長。所述細胞源自ATCCCCL 81并用第132和156代之間的細胞。
Vero細胞從液氮(LN2)中如下制備從LN2中取出1安瓿Vero細胞并在36℃加或減2℃下水浴融解。將小瓶中的全部內容移至25cm2含有補充10％胎牛血清的10mL細胞培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。該瓶在36℃加或減2℃下，在4-6％CO2中孵育。1小時后輕輕取出上清液和未附著的細胞，并加入10mL新鮮組織培養(yǎng)基。細胞在36℃加或減2℃下，在4-6％CO2中孵育直至達到90-100％的匯合。
Vero細胞傳代如下用10-20mL PBS將單層細胞洗滌約3分鐘。輕輕倒出PBS并換成3mL EDTA-胰蛋白酶(Cellgro，目錄號98-102-CV)，將單層細胞孵育約3分鐘或直至細胞從瓶中脫離。加入17mL制備的生長培養(yǎng)基(含有FBS)稀釋懸浮液，以稀釋并中和胰蛋白酶。然后用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)，測定每mL懸浮液中的細胞數(shù)。瓶的數(shù)量可通過如下計算的懸浮液準備每mL細胞數(shù)(懸浮液)×所需懸浮液的mL數(shù)＝每個容器的板的mL數(shù)。每mL細胞數(shù)(所需)計算懸浮液mL數(shù)的總和，懸浮液總mL數(shù)必須少于可用的體積。如果不是如此，則鋪板細胞密度調節(jié)至適應這個情況，然而，應當注意，鋪板時細胞密度較低時細胞匯合的時間長度將比較長。容器通常以細胞密度為每mL 1×104至1×105個細胞的細胞懸浮液鋪板。細胞孵育3-4天或直至匯合。
這些維持和繁殖Vero細胞的技術可相似地應用于所用的其他細胞系，如馬-達氏犬腎(MDCK)和HEK 293。
克隆尤其適于繁殖病毒分離物的HEK 293細胞。這種HEK 293亞克隆稱為GT-D22(或D22)，從最初的HEK 293細胞(ATCC號CRL-1573；ATCC批號F-11285，第33代)制劑中分離。亞克隆HEK 293細胞，并根據攜帶有表達p53基因的5型重組腺病毒的改進產率選擇。對有正常形態(tài)和足夠的生長率的克隆進行胰蛋白酶消化，并以每孔1-2×106個細胞接種以用于進一步分析。最能產生克隆的克隆經受進一步亞克隆和選擇。最后選擇D22亞克隆。D22亞克隆繁殖流感的能力已用豬流感病毒(SIV)證實。
當研究活的流感病毒時，采取生物安全預防措施。流感是2級病原微生物，并應該遵守CDC-NIH，HS出版號(CDC)88-8395(Biosafety inMicrobiological and Biomedical Laboratories)中對在實驗室中操作病毒的建議。
實施例3有限稀釋克隆 有限稀釋克隆的稀釋管準備和樣品稀釋如下。在試管架上設置測試管(12×75mm)并貼上標簽。每板檢測一個樣品，每個樣品的稀釋系列為10-1至10-10。稀釋培養(yǎng)基用血清移液器以1.8mL的量分裝至每個測試管。第一個試管標為病毒鑒別。其他幾個試管準備用作稀釋對照，并在稀釋期間有誤差發(fā)生的情況下替換。將樣品震蕩混合約5秒，然后將200μL樣品移至10-1稀釋管制備起始稀釋物。繼續(xù)系列稀釋至10-10。對于每個稀釋，樣品震蕩混合并在稀釋物之間更換移液器吸頭。
稀釋物如下轉入細胞平板中。在使用之前即時從細胞平板中按無菌操作倒出培養(yǎng)基。用12道移液器用280μL無菌PBS將每個孔清洗2-3次。將平板無菌倒空，但不能干涸。將平板標上病毒鑒別、日期和稀釋方案。每個稀釋物在加至平板之前都短暫震蕩。用監(jiān)控的Finnpipette或其它合適的移液器和1000μL吸頭，將每孔200μL樣品接種至平板的一行。根據病毒濃度加樣。首先，將2行稀釋對照加入平板，然后是最高稀釋的病毒(10-10)，接著是余下的樣品。從10-10至10-1連續(xù)加樣。
實施例4病毒制劑 收獲病毒并如下評估CPE。孵育4天后，用顯微鏡檢查讀取致細胞病變效應(CPE)。用細胞碎片的存在、死細胞和缺乏活性的細胞的出現(xiàn)來鑒定CPE，因為它們是流感病毒的典型現(xiàn)象。偶爾會在起始病毒稀釋物中觀察到非特異性干擾，因此檢查數(shù)個稀釋物的CPE很重要。當評估CPE時，檢查顯示CPE的最高倍稀釋物的孔中CPE程度很重要。通過選擇呈現(xiàn)CPE的最高倍樣品稀釋物的孔來達成取得最高水平的成功，但在這些孔中，優(yōu)選呈現(xiàn)最小程度的CPE的那些孔。一旦被選擇，通過用單道1000μL移液器吸出液體來收集所述孔中的內容物。通常重復吸出液體，以去除在孔底松散附著的細胞，并幫助打散懸浮液中的細胞或病毒塊。然后用收集的液體進行下一輪或幾輪的有限稀釋克隆，或有時用于接種新鮮單層細胞以生產克隆后種子。一般來說立即連續(xù)地進行2至3輪有限稀釋克隆以產生均一的病毒群。過程中每一步都分析HA效價，結果顯示在表1中。A/Indonesia/05/2005(INDOH5N1)、A/Vietnam/1203/04(VNH5N1)、A/NewCaledonia/20/99(A/NC/20/99(R))和A/Wisconsin/67/05(A/Wis/67/05R)是由CDC提供的重配流感病毒。對于重配病毒，編碼表面糖蛋白HA和NA的基因來自流感株(INDOH5N1、VNH5N1、A/New Caledonia/20/99和A/Wis/67/05)，而其余的內部基因來自A/PR/8/34。有限稀釋克隆也適用于野生型(未進行PR8重配)流感株A/New Caledonia/20/99(A/NC/20/99)、A/Wisconsin/67/05(A/Wis/67/05)和B/Malaysis/2506/04。病毒通過反向遺傳技術產生并在含雞胚的雞蛋中傳代。雞蛋材料直接用于在Vero細胞中的有限稀釋克隆(用于HA效價的步驟顯示在實施例5中)。
表1
＊HA效價表示為單位/mL。＊＊CDC提供的卵胚材料的HA效價。＊＊＊CDC提供的用卵胚材料直接感染的Vero細胞的HA效價。
如上表1所示，細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能產生與蛋中產生的病毒效價同樣高的病毒效價。另外，最初在Vero細胞上顯示不可檢測的生長的病毒株VNH5N1和B/Malaysia/2506/04可通過有限稀釋克隆而適于Vero細胞上生長。有限稀釋克隆之前VNH5N1和B/Malaysia/2506/04在雞蛋羊膜上的繁殖增強了這些病毒在Vero細胞上生長的適應性。
用SRID(單向輻射免疫擴散)定量血細胞凝集素，在濃縮的Vero細胞培養(yǎng)基中的B/Malaysia/2506/04得到多達132μg/mL的血細胞凝集素蛋白。產率(每mL培養(yǎng)物的HAμg數(shù))較公布的用Vero細胞的已知方法高10倍。目前，一個人疫苗的劑量相當于約15μg/病毒株。因此，可從1mL濃縮的Vero細胞培養(yǎng)基中得到約8-9個劑量。
實施例5流感通過羊膜傳代增強病毒在組織培養(yǎng)細胞上生長的能力 從CDC收到流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-RG。這是一種重配病毒，由在PR8病毒骨架上的禽H5N1流感病毒越南株H5和N1基因組成。這種病毒在通過尿囊腔接種的11天齡含胚雞蛋中擴增。接種后2-3天收集尿囊液，病毒產率為2560血細胞凝集素單位(HAU)/ml。
在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀釋尿囊液(～200μl)，并使得匯合單層Vero細胞(ATCC CCL號81，第147代)在36±2℃下吸收60分鐘。將含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的25mL DMEM加入培養(yǎng)物中，孵育3天，收集培養(yǎng)上清液。在收集的液體中沒有可檢測的血細胞凝集素活性。
將含病毒的尿囊液以1∶10,000稀釋，將100μl接種至11天齡的含胚雞蛋的尿囊腔和羊膜上。將雞蛋在約39℃下孵育三天，分別收集尿囊和羊膜液。
Vero細胞(第132至152代)在含5％胎牛血清的DMEM中以1×104至1×105個細胞/ml、200μl/孔接種至96孔板，并在36±2℃、3-5％CO2下孵育3-4天(直至匯合)。在尿囊液或羊膜液中的VNH5N1病毒在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的DMEM中以10-1至10-10系列稀釋。從Vero細胞去除培養(yǎng)基，用280μl的磷酸鹽緩沖液清洗每個孔，然后將200μl的每種病毒稀釋物接種至8個重復的孔中。平板在36±2℃，3-5％CO2下孵育4天。與尿囊來源病毒的10-7稀釋相比，羊膜來源的病毒的致細胞病變效應高達10-9稀釋，其可證實羊膜液導致在Vero細胞上生長的病毒效價更高(見表2)。收獲來自顯示致細胞病變相應的最高稀釋倍數(shù)的孔的病毒，通過第二次有限稀釋進行克隆。再一次，與尿囊來源病毒所見相比，羊膜液來源的病毒顯示了在較高稀釋倍數(shù)下的致細胞病變效應(病毒約多10倍)。
表2 有限稀釋傳代1 尿囊液病毒 ↓稀釋致細胞病變效應(+出現(xiàn)) 收獲H7孔中的病毒 羊膜液病毒 ↓稀釋致細胞病變效應(+出現(xiàn)) 收獲G9孔中的病毒 有限稀釋傳代2 尿囊液H7克隆 ↓稀釋致細胞病變效應(+出現(xiàn)) 收獲H3孔中的病毒 羊膜G9克隆 ↓稀釋致細胞病變效應(+出現(xiàn)) 收獲G4孔中的病毒 有限稀釋傳代3 尿囊H7H3克隆 ↓稀釋致細胞病變效應(+出現(xiàn)) 收獲B4和F4孔中的病毒 羊膜G9G4克隆 ↓稀釋致細胞病變效應(+出現(xiàn)) 收獲C5和G5孔中的病毒 表2中的流感克隆在列名為A-H和行1-10(稀釋系列分別為10-1至10-10)結合的基礎上鑒定。例如，克隆名為B4代表從第B列和第4行發(fā)現(xiàn)的孔中收獲的病毒(10-4稀釋)。
從第三次有限稀釋收獲的病毒(～100μl)在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀釋并接種在匯合的Vero細胞上(第132-152代)，并在36±2℃下孵育60分鐘。吸收后加入含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的45mL DMEM，在36±2℃下孵育培養(yǎng)物四天。檢測收獲的培養(yǎng)物上清液的血細胞凝集素，從羊膜擴增的病毒得來的兩種克隆得到四至八倍高的HA產率(見表3)。
表3 G9G4C5病毒隨后通過在滾動瓶中(得到5120HAU/ml)和在5L生物反應器中(得到7680HAU/ml)的Vero細胞中生長來擴增。
用B型流感病毒B/Malaysia/2506/04可得到相似結果。當?shù)米阅蚰乙旱牟《驹赩ero細胞中繁殖時，這種病毒也不能產生任何可測的血細胞凝集素。然而，來源于羊膜的病毒擴增在兩次有限稀釋克隆后得到640HAU/ml，并在5升生物反應器中擴增后得到5120HAU/ml。
實施例6血細胞凝集素定量 本步驟的目的是在終產物中的病毒液中定量流感病毒血細胞凝集素活性。
所用的材料包括PBS、Cambrex、517-16Q或等同物；Alsevers溶液、E8085或等同物；在Alsevers溶液中的新鮮公雞紅細胞(1∶1比例)。使其在Alsevers中過夜以穩(wěn)定受體。洗滌2次并以在PBS中的10％懸浮液貯存，或以在Alsevers中的50％懸浮液貯存。用4天之內的采集樣品；微滴定板，F(xiàn)alcon U-底平板，目錄號3911或等同物；8道微量移液器5-50μL或等同物；離心機Beckman TJ-6或等同物；20-200μL微量移液器或等同物；一次性200μL移液器吸頭；已知效價的陽性對照病毒；滅活抗原。貯存在2-7℃并在測試當天使用。
A.制備標準化的在PBS中的0.5％的公雞紅細胞(rRBC)懸浮液，這通過首先使得rRBC溶液與室溫平衡(15-30℃)達成。從采集日起公雞RBC在Alseveres中有效期為4天。將在Alsevers中的足夠體積的rRBC轉移到50mL錐形離心管中。用PBS或Alsevers注入離心管至45mL刻度處并且通過翻轉離心管數(shù)次來混合，然后在4℃下以400×g離心10分鐘，以此洗滌rRBC。用移液器移除上清液。如果上清液中有任何溶血現(xiàn)象，則重復該洗滌步驟多達三次。最后的洗滌之后，將0.25mL聚集的公雞RBC加入49.75mL PBS中并翻轉混合。將細胞懸浮液標上制備日期、所用PBS批號和在PBS中的0.5％公雞紅細胞，并貯存在2-7℃(最長貯存時間為4天)。
B.確定測試樣品材料所需的微滴定板數(shù)量。用兩行分別為1∶2和1∶3的稀釋方案測試所有測試樣品。也用以1∶2稀釋方案的兩行陽性對照病毒和兩行PBS對照。其他樣品根據需要測試。用永久黑色記號筆標記微滴定板上的行名。下表2所示為一個實例。
表2微滴定板
在微滴定板的每個孔中加入50μL的PBS。另外在用1∶3稀釋方案的那些行和PBS對照行的第一個孔中再加入50μL的PBS。每個微滴定板完成從加樣點直至加入RBC完成，然之后再繼續(xù)進行下一個微滴定板。將50μL樣品和陽性對照病毒加入到所稱的指定行的第一個孔中加入50μL樣品和陽性對照病毒。樣品系列兩倍稀釋用多道移液器制備，轉移50μL等分樣品。將適合的吸頭無菌地安裝至多道移液器，以確保將移液量設定為50μL。通過抽吸和排出材料至少七次來混合一列的孔的內容物。丟棄用于混合的吸頭。安裝更多吸頭，將每孔中50μL材料轉移至下一列的孔中。重復這些步驟直至所有行按順序稀釋。確保從微滴定板的第十二行移除50μL。用多道移液器將50μl的0.5％rRBC懸浮液移送至每個孔中。rRBC懸浮液從最高稀釋的孔至最低稀釋的孔中加入。輕輕搖動每個板以混合其中的內容物。在微滴定板頂端放上蓋子，并將板堆起來，在室溫下(大約20-25℃)孵育45-60分鐘。
孵育階段之后，將平板放置在酶標儀上讀取并測定PBS對照孔是否滿足要求(PBS孔不應顯示任何血細胞凝集現(xiàn)象)。也進行定性測定。rRBC必須設定為沒有任何防護的完全按鈕(complete button)。防護反應分散rRBC。如果PBS對照孔滿足要求，則其他孔根據血細胞凝集評分。如果PBS對照孔不滿足要求，則測試無效，重復測試。將血細胞凝集結果記錄為陽性(+)(有血細胞凝集)、部分(+/-)和陰性(0)。陽性反應表明rRBC完全防護或細胞全部分散。陰性反應表明顯示“+/-”的rRBC孔形成的完全按鈕(total button)，為了端點計算的目的認為其是陰性。對每個稀釋(即1∶2和1∶3)的每個重復鑒定凝集發(fā)生(沒有按鈕(no button))的最高稀釋倍數(shù)，并且其效價計算為顯示完全凝集的最后稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。鑒定測定的樣品和陽性對照病毒的效價水平。測定每組重復稀釋倍數(shù)的端點效價的數(shù)學平均值。也測定每0.5mL(50μL)樣品、PBS和陽性對照病毒的HA單位。將0.05mL數(shù)值乘以20計算得到每1mL的HA單位。
按如下計算對每一個1∶2和1∶3的測試樣品稀釋，記錄重復樣品的數(shù)學平均值。記錄最高效價。進行HA/0.05mL×20＝HA/1mL相乘。記錄測試停止日期和每1mL(病毒液)的HA單位的結果或每劑量(終產物)的HA單位結果。母液或終產物的有效測試含有在最低稀釋倍數(shù)下的完全凝集(沒有按鈕(no button))和最高稀釋倍數(shù)下的不凝集(按鈕(button))。陽性對照組應在所建立的范圍內。所列參數(shù)之外的效價范圍組成“未測試”或無效測試，應在無偏差條件下重復實驗。
實施例7疫苗生產 病毒株是WHO、CDC或其他政府組織命名的大流行株或季節(jié)性株。為了驗證人疫苗生產過程，使用CDC提供的流感病毒重配VNH5N1-PR8/CDC-RG參考株。用磷酸鹽緩沖液作為疫苗制備的稀釋劑，ISCOM作為佐劑。用等份數(shù)的膽固醇和磷脂酰膽堿的脂質混合物來促進ISCOM形成中的親水/疏水混合過程。通過滲濾去除用于破壞病毒的非離子去污劑。ISCOM的形成經電子顯微鏡證實。使用二乙烯亞胺(BEI)來滅活病毒，然后用硫代硫酸鈉中和BEI。下面的步驟1-19更詳細地說明所述過程。
在Vero(非洲綠猴腎)中細胞生產流感株，用氮丙啶化合物二乙烯亞胺(BEI)滅活，濃縮，純化，并用過濾和凝膠層析純化。用含有Quil A的佐劑和脂質混合物配制病毒以制備藥物產品。
步驟1A-Vero細胞從工作細胞庫(WCB)復蘇Vero細胞。傳代數(shù)限制在主細胞庫(MCB)的20代，從主細胞庫(MCB)開始。融解1安瓿來自液氮中的WCB，以4-5×104個細胞/cm2在25cm2 Nunc瓶中在含有20％v/v經照射的來源于新西蘭或澳大利亞的胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺(一般地)的Dulbecco的改良極限必需培養(yǎng)基(Modified Minimum Essentialmedium，DMEM)中接種。在36℃加或減2℃下孵育所述瓶，約1小時后去除上清液和未附著的細胞，用新鮮培養(yǎng)基重新加入瓶中并如前孵育。
步驟2A-用胰蛋白酶/EDTA溶液收獲匯合單層細胞，然后將細胞重新接種到更多的靜止瓶或滾動瓶中繼續(xù)細胞擴增?？捎梦⑤d體以20-30g/L在生物反應器中進行進一步擴增。
步驟3A-當在生物反應器或滾動瓶中得到培養(yǎng)底物的所需產物體積時，用Dulbecco的改良極限必需培養(yǎng)基(DMEM)洗滌細胞兩次以去除滅活感染培養(yǎng)基中的胰蛋白酶的殘留血清。
步驟1B-獨立制備工作病毒種(WVS)，并在大量生產之前冷凍。融解并在含有IX型豬胰蛋白酶的病毒感染培養(yǎng)基中稀釋貯存在-70℃的主要種子病毒或工作種子病毒(MSV+1)，以得到所需MOI。將預定體積接種到滾動瓶中或生物反應器中的匯合Vero細胞單層，并在36℃加或減2℃下孵育，一般孵育40-72小時，直至鑒定高達100％致細胞病變效應(CPE)。收獲病毒并在-50℃或更低溫下貯存。
步驟4-融解工作種子病毒(不高于MSV+2代)并在含有0.5-5.0μg/mL的IX型豬胰蛋白酶的病毒感染培養(yǎng)基中稀釋，以得到所需感染復數(shù)。在培養(yǎng)基中用胰蛋白酶有助于貼壁和病毒對細胞的穿透。
步驟4A-用生物反應器生產流感病毒。用SoloHill Plastic Plus微載體以30g/L的密度制備5升生物反應器。在加入含5％v/v經照射的來源于新西蘭或澳大利亞的胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中以2×105個Vero細胞/mL接種生物反應器，并在36℃加或減2℃下孵育。細胞匯合達到80-100％后，靜置含Vero細胞的微載體并洗滌兩次，每次洗滌用2升不含血清的DMEM。將含有2.5μg/mL IX型胰蛋白酶的感染培養(yǎng)基加入到生物反應器中。病毒種子(例如VNH5N1)也以0.0001-0.0003MOI加入到生物反應器中。病毒制備進行5天。每天對生物反應器取樣，用于CPE觀察和HA滴定。CPE達到80-100％后收獲病毒。
步驟5-在收獲的病毒中加入二乙烯亞胺(BEI)，得到1.5mM的終濃度，在36℃加或減2℃和pH7.3加或減0.3下維持1小時(邊攪拌)。
步驟6-完成步驟5后，將收獲物轉移到第二個瓶中，并在36℃±2℃下進行滅活步驟，持續(xù)48小時(邊攪拌)。這段時間后加入硫代硫酸鈉至終濃度為3mM，以中和任何殘留BEI。
步驟7-將培養(yǎng)物通過7μ和1μ過濾器凈化并貯存在2℃-8℃待測安全清除率。安全測試需10天進行。
步驟8-用分子量截留(MWCO)為100K的聚砜膜，用切向流超濾系統(tǒng)濃縮抗原。得到高達約50倍濃縮物。
步驟9-將所得到的濃縮培養(yǎng)液在適合的緩沖液中平衡，用DNA酶(Benzonase)處理以降解細胞DNA。
步驟10-用尺寸排阻凝膠層析純化濃縮物。目前使用的凝膠是交聯(lián)瓊脂糖(CL-2B，Pharmacia)。柱子長度為90cm以得到所需分離。CL-2B是一種“軟”膠，其依靠柱壁的支持。一般90cm長度可用2×45cm或3×30cm(如，高30-32cm，直徑30cm)柱串聯(lián)達到。濃縮病毒以柱體積的約5-7％上柱。
步驟11-用100K MWCO聚砜膜進行實驗室小型切向流超濾來重新濃縮病毒峰材料。
步驟12-通過加入5ml 10％(w/v)的去污劑(壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylglucamide))Mega 9溶液至200ml抗原溶液中來溶解重新濃縮的病毒峰材料。將溶液在20-25℃下，在玻璃容器中邊進行磁力攪拌邊緩慢混合1小時。
步驟13-以每20mL重新濃縮的病毒峰加入50μl脂質混合物。所述脂質混合物含有10mg/mL雞蛋源的磷脂酰膽堿和膽固醇。在20-25℃下繼續(xù)攪拌，確保脂質在重新濃縮的病毒中平均分布。加入Quil A(從10％w/v的貯存溶液中得到)使得終濃度為0.05％。將溶液在20-25℃下攪拌約30分鐘。
步驟14-用50mM醋酸銨通過滲濾從混合物中去除Mega 9去污劑。這使用有100K MWCO聚砜膜的實驗室小型切向流超濾系統(tǒng)來進行。所用醋酸銨的體積最少約為10倍重新濃縮的病毒峰混合物的體積。通過平衡加入和滲透流動以維持全程定容來達到滲濾。去污劑干擾ISCOM形成。電子顯微鏡證實典型籠狀結構形成。
步驟15-重新濃縮ISCOM作為滲濾的最后一步。
步驟16-滿意的QC釋放后，配制數(shù)批ISCOM以制備每1mL劑量含1至20μg人流感HA的疫苗。用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋劑。
步驟17-在A級條件下將共混的疫苗裝入單劑量的最終容器中。取樣檢測無菌性、實驗室動物中的安全、可提取體積和視覺外觀。給疫苗貼上標簽并堆放，在2℃至7℃下隔離放置。
步驟18-最后QA完成后，將產品釋放進行成品冷藏(2℃至7℃)待派送。
實施例8源自Vero細胞的疫苗在白鼬中效力 評估源自Vero得到的流感疫苗對血清轉變白鼬的能力。基于2006-2007季節(jié)性流感株(A/NC/20/99、A/Wis/67/05的兩個PR8重配株和B/Malaysia，都得自CDC)的三價人流感疫苗在有限稀釋克隆后在Vero細胞中生產。將所得到的疫苗，“SPflu0607”(含或不含ISCOM佐劑)，注射入4-6月齡雌性白鼬的左后腿。市售的人流感疫苗
(Sanofi-Pasteur生產)和
(Chiron生產)作為對照比較與SPflu0607一起檢測。用單輻射免疫擴散(SRID)測量疫苗中的血細胞凝集素(HA)蛋白的量。通過血細胞凝集素抑制(HI)測量白鼬的血清轉變的白鼬的血細胞凝集抑制(HI)。認為大于或等于1∶40的HI效價是陽性的。參見表3。
表3
GMT＝幾何平均抗體效價 ％陽性＝HI抗體水平≥1∶40的動物百分比 以上結果表明Vero細胞源的疫苗與市售雞蛋源的疫苗相當。
實施例9制備CIV疫苗的犬流感病毒繁殖方法 從病犬的鼻分泌物中分離犬流感。取鼻拭子并放置在含慶大霉素和兩性霉素的2mL組織培養(yǎng)基中。將0.8mL所得拭子材料接種到在含有1.3μg/mL IX型胰蛋白酶的10mL DMEM組織培養(yǎng)基中的匯合馬-達氏犬腎(MDCK)細胞中，并在36±2℃下孵育2天。通過倒出培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)瓶，用標準抗血清通過美國獸醫(yī)服務實驗室(National Veterinary Serviceslaboratory)用標準抗血清鑒定病毒為H3N8。MDCK傳代病毒含每ml 160血細胞凝集素單位。通過在96孔板中的匯合MDCK細胞上接種10倍系列稀釋，并收獲顯示致細胞病變效應的最高稀釋倍數(shù)的單個孔(組織培養(yǎng)基是含1.3μg/mL IX型胰蛋白酶的DMEM)，以克隆病毒。重復此過程兩次。然后將所述克隆在75cm2瓶中的MDCK細胞上擴增。生成的病毒(第4代)產率為每ml 640血細胞凝集素單位。然后通過所述病毒用300mL含0.8μg/mL IX型胰蛋白酶的DMEM，通過將0.23MOI接種至1050cm2滾動瓶中的匯合單層細胞上，在馬-達氏牛腎細胞上傳代。所述將滾動瓶在36±2℃下孵育3天。收獲的病毒產率為2560HAU/ml。因為在MDBK上的HA產率增加，這種細胞系被選為按比例增加擴增用于疫苗制備的病毒。所述病毒在生物反應器中繁殖。以3.0×105個細胞/mL在5L生物反應器中接種以5g/L附著Cytodex III微載體的MDBK細胞，所述細胞以5g/L附著Cytodex III微載體。細胞在36±2℃下在含5％胎牛血清且沒有抗體的DMEM中生長4天。安置靜置微載體后，去除90％的培養(yǎng)基，以用不含血清的DMEM替換。加入IX型胰蛋白酶至最后的5,000mL中的濃度為10μg/mL。所述細胞用0.01MOI的病毒感染。將病毒與微載體上的MDBK細胞一起在36±2℃下孵育2天，然后收獲上清液。得到的病毒產率為10,240HAU/ml。
實施例10在雞蛋中未傳代的臨床分離物的有限稀釋克隆產生均一群和改進的TCID50/mL和HA效價 犬流感病毒H3N8(野生型)從診斷實驗室得到并從鼻拭子分離。在收到之后處理鼻拭子，并將其用于接種含有匯合單層MDCK細胞的25cm2培養(yǎng)瓶。感染培養(yǎng)基由以下成分組成DMEM、4mM L-谷氨酰胺/ml、1.3μg/mlIX型和慶大霉素。將培養(yǎng)瓶在36±2℃和3-5％CO2下孵育，并在CPE開始時收獲。在收獲液中進行HA測定，其結果是160HAU/ml和TCID50/ml效價為7.94。
MDCK細胞在含5％胎牛血清的DMEM中以1×104至1×105個細胞/ml，200μl/孔種在96孔板中，并在36±2℃，3-5％CO2下孵育3-4天(直至匯合)。在這部分按指定稀釋CIV H3N8病毒有限稀釋第1輪。在含有1.3μg/mL IX型胰蛋白酶、4mM L-谷氨酰胺和慶大霉素的DMEM中進行稀釋。從MDCK細胞中去除培養(yǎng)基，用280μl磷酸鹽緩沖液清洗孔，然后將200μl的每種病毒稀釋接種至8個重復孔中。平板在36±2℃，3-5％CO2下孵育4天。進行兩輪有限稀釋克隆，有限稀釋第2輪緊接著有限稀釋第1輪。所述過程產生的病毒分離物能產生較高TCID50/ml和血細胞凝集效價。收獲顯示最低程度致細胞病變效應的較高稀釋倍數(shù)的孔，第二次用有限稀釋克隆。
有限稀釋第1輪 將第1代材料滴定得到7.5 TCID50/ml的結果。用這個值稀釋病毒產生5個樣品。
A.10-4 B.10-5 C10病毒顆粒/孔(10-6.5) D.3病毒顆粒/孔(10-7.02) E.1病毒顆粒/孔(10-7.5)
收獲孔A11以準備有限稀釋克隆第2輪。
有限稀釋第2輪
收獲孔A5的病毒 使用從有限稀釋克隆(～200μl)第二輪中收獲的病毒接種含匯合單層MDCK細胞和補充1.3μg/mL IX型胰蛋白酶、4mM L-谷氨酰胺/ml和25μg/ml慶大霉素的DMEM的75cm2瓶中。滴定收獲的培養(yǎng)上清液以測定TCID50/ml和血細胞凝集效價(見表4)。
表4 在實驗室實驗中進行免疫原性試驗，病毒在5L生物反應器中在MDBK細胞上生長，得到的血細胞凝集效價為10,240HAU/ml。
實施例11滅活犬流感疫苗對狗的效力 犬流感病毒(CIV)血清型H3N8在狗中引起嚴重的呼吸道疾病。然而，目前沒有抗CIV的有效疫苗可用。本研究的目的是評估通過有限稀釋和CIV在組織培養(yǎng)細胞中繁殖制備的滅活CIV疫苗在預防由有毒CIV感染誘導的臨床疾病和肺損傷中的效力。所述疫苗由二乙烯亞胺(BEI)滅活的CIV抗原輔以
佐劑構成，抗原輸入水平為每劑量500血細胞凝集單位(HAU)。肌肉注射此疫苗接種一組8只7周齡CIV血清陰性狗，并在初次接種后21天給予加強劑。加強接種后兩周，與未接種的對照相比，接種狗顯示顯著較高水平的HA抑制抗體效價，未接種的對照狗顯示有疫苗的免疫反應刺激。未接種的對照和接種狗在加強接種后16天均用異種有毒CIV分離物感染，并在感染后10天內每天監(jiān)測臨床征象、直腸溫度和鼻CIV釋出。所有對照狗(100％)發(fā)展的臨床征象包括表明感染病毒毒性的眼和鼻排出物、噴嚏和咳嗽。與對照組(中值評分＝6.8，p＝0.0051)相比，接種組顯示明顯較低的臨床征象(中值評分＝4.3)。在接種組中僅有一只狗(12.5％)顯示鼻CIV釋出，且其僅存在一天，然而，與接種組相比，對照組的所有狗(100％)有顯著較高的病毒釋出(p＝0.0003)。在對照組中，感染后病毒釋出持續(xù)7天。感染后10天所有狗施以無痛致死，進行尸體剖檢評估肺損傷。對照組中所有狗(100％)顯示不同程度的肺實變，然而，接種組僅有一只(12.5％)顯示輕度肺實變。當與接種狗(中值評分＝0，p＝0.0005)對比時，對照狗肺評分明顯較高(中值評分＝4.9)。這些結果明確證明在此研究中的所測疫苗制劑通過明顯減少臨床征象，降低病毒釋出和預防CIV誘導的肺實變而保護狗抗CIV感染。
研究綜述 本研究的目的是測試
-輔助的CIV疫苗制劑在狗中預防CIV感染的效力。
起初使狗適應環(huán)境8天。對于測試組，第一次接種在第0天進行，加強劑在第21天進行。對照組不接種。在第37天兩組狗均用CIV感染。在研究全程按如下所述監(jiān)測和觀察狗。狗在感染后10天施以無痛致死，進行尸體剖檢。
測試動物 測試動物在第0天平均約48.25天齡。對照組有8只狗，測試組有8只狗。平均重量為1.8kg。研究中所用的狗沒有呼吸道感染病史或CIV接種史。為了證實狗為CIV抗體陰性(HA效價＜10)，在第-1天取血樣，通過血細胞凝集抑制測定檢測。在第-1天也取鼻拭子以確保狗在接種時沒有CIV感染。
預接種監(jiān)測 為了證實狗為CIV抗體陰性，在給藥第一次疫苗前一天取所有狗的血樣，并收集到抽空的血清分離管中。在同一天取鼻拭子以證實狗沒有CIV感染。
第一次接種之前兩天給狗體檢，評估狗的大致健康狀況。從最初接種和加強接種前兩天至接種日進行臨床評估和直腸溫度檢測。
接種 在此研究中用犬流感病毒疫苗CIV H3N8-
犬流感病毒(H3N8)從有嚴重呼吸道疾病的狗中分離。用MCS+19代水平(即主細胞庫中第19代以后)的馬-達氏牛腎(MDBK)-KC細胞，繁殖CIV H3N8。然后在36℃下用6mM BEI滅活病毒60小時。用60mM硫代硫酸鈉中和BEI。
用于本研究的疫苗以用于等分成800個1mL劑量的800mL原液制備。800mL溶液如表5中制備。
表5
滅活的CIV H3N8病毒在生理鹽水中稀釋，然后輔以氫氧化鋁。水相中的殘留成分加入輔助的抗原中。分別制備油相，然后在10分鐘內加至水相中，并持續(xù)混合1小時。用Silverson勻化器勻化系列稀釋30分鐘。
在室溫下平衡貯存在2-7℃的CIV疫苗小瓶至少30分鐘。將疫苗裝入3mL注射器(每個注射器1mL)，用于免疫。在第0天將疫苗的第一劑肌肉內注射至右后腿，在第21天將第二劑肌肉內給藥至左后腿。
接種后步驟 在每次接種后3-6小時內對所有的狗進行完全臨床評估以測量任何直接反應，完全臨床評估包括直腸溫度和注射部位觀察。在每次接種后持續(xù)7天，每天進行臨床評估，并根據以下臨床評估指南評分。在第20天和36天取血樣，并用所述血清樣品通過血細胞凝集抑制測量CIV抗體。
預感染步驟 在感染之前2天(第35和36天)和感染當天(第37天)給予感染之前對所有的狗進行臨床評估并記錄直腸溫度。根據臨床評估指南給臨床征象評分。
感染 感染材料從MDCK細胞分離CIV14-06A病毒，并用其感染接種的狗，這種病毒最初是從經受犬呼吸道疾病的狗中現(xiàn)場收集的樣品中分離。感染病毒的平均效價是7.7 Log10TCID50/mL。在感染當天，感染材料以1∶4在無菌、冷的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中稀釋至每只狗7.4Log10TCID50的目標感染劑量。
給予感染在第37天給予所有的狗感染。四只狗放在Plexiglas小間，并且大約20分鐘內用8mL感染病毒(2mL/狗)在生成噴霧劑。將狗暴露在噴霧劑中共40分鐘。
感染后監(jiān)測 感染后每天對每只狗記錄直腸溫度和進行臨床評估，持續(xù)10天。感染后每天對每只狗收集鼻拭子，持續(xù)10天。每次收集后，鼻拭子按如下所述進行處理和滴定。在感染后第10天將血樣收集在排空的血清分離管中，緊接著進行無痛致死。
尸體剖檢 所有感染狗在感染后第10天(第47天)用AVMA認證的方法(氯胺酮雞尾酒和Beuthanasia-D)無痛處死，進行尸體剖檢。無痛處死后立即進行肺的評估。評估可見的實變區(qū)，并按每個肺葉的實變百分比評分。百分比轉變?yōu)榉Q重評分，計算每只狗的總評分。在尸體剖檢中，收集肺組織，用于病毒分離和滴定，以及組織病理學用途。
病毒滴定 進行病毒效價的血細胞凝集(HA)測定。將病毒在V底微滴定板中系列兩倍稀釋，并將等體積0.5％的火雞紅細胞(RBC)懸浮液加至病毒懸浮液中。將板放置在室溫下孵育30分鐘，讀取HA結果。顯示HA活性的病毒最高稀釋倍數(shù)稱為1HA單位。所有測定重復進行兩次，并測量HA效價端點。
通過在MDCK細胞中滴定測定感染材料、鼻拭子和肺組織中的病毒效價，以證實在給予感染的狗中感染材料的效力并測量病毒釋出。MDCK細胞接種在96孔組織培養(yǎng)板中2天，然后用10倍系列稀釋病毒懸浮液或從肺組織和鼻拭子制備的樣品接種。將板在36±2℃的溫度和5％CO2下孵育。感染七天后，觀察板的致細胞病變效應(CPE)，用Spearman-Karber方法計算50％感染率端點。病毒效價以Log10TCID50/mL表示。
血清學反應檢測 通過血細胞凝集抑制(HAI)測定來測量狗血清樣品中的抗CIV抗體。簡言之，在V底96孔微滴定板中用PBS進行測試血清的系列兩倍稀釋。在含測試血清的每個孔中加入含4-8HAU的CIV25-06B的等體積病毒懸浮液，將板在室溫下孵育30分鐘，使抗原抗體發(fā)生反應。然后，加入等體積的0.5％火雞RBC懸浮液。將板在室溫下孵育30分鐘，讀取HAI結果。顯示HA抑制的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)被認為是測試樣品的HAI效價。所有測試重復進行兩次，并測定端點HAI效價。
結果臨床評分 從感染前兩天至感染后10天，每天監(jiān)測所有狗的臨床征象，包括眼排出物、鼻排出物、噴嚏、咳嗽、呼吸困難和抑郁。對感染后10天的眼排出物、鼻排出物、噴嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困難的每天臨床評分求和，得到每只狗的臨床評分總數(shù)。用Wilcoxon Exact秩和檢驗(Wilcoxon Exact RankSum Test)對比接種組和對照組的臨床評分總數(shù)，并計算雙側P值。
對照組和接種組的狗從感染后2天起均顯示一定范圍的臨床征象(圖1)。對照組的所有8只狗(100％)顯示不同程度的咳嗽，在10天的感染后觀察期內持續(xù)多達5天。另一方面，接種組僅有2只狗(25％)在整個10天的感染后觀察期內顯示輕微咳嗽，并僅觀察到1天?？人允菍φ战M的狗顯示的主要征象。相反，接種組的狗顯示的主要臨床征象僅僅是輕微的眼排出物。與接種狗(中值評分＝4.3)相比對照組的臨床評分(中值評分＝6.8)明顯較高(p＝0.0051)。這些數(shù)據表明CIV疫苗保護狗預防CIV誘導的臨床征象。
結果鼻病毒釋出 通過在感染前一天(第-1天)，然后從感染后第1天至第10天收集和處理鼻拭子，以監(jiān)測所有狗的鼻病毒脫落。測定鼻拭子的病毒效價(Log10TCID50/mL)并對時間作圖。用Wilcoxon Exact秩和檢驗比較對照組和接種組曲線下的面積。將每組的平均病毒效價(表示為Log10 TCID50/mL)對感染后天數(shù)作圖(圖2)。
從感染后第1天的鼻分泌物中，對照組開始釋出病毒。所述病毒釋出在感染后第5天達到高峰(1.25 Log10 TCID50/mL)，然后在第7天急驟下降(圖2)。在10天的感染后觀察期內，對照組中所有的狗(100％)在一或多個時間點為病毒釋出陽性。另一方面，接種組僅有一只狗(ID號CXTAMM)(12.5％)在鼻分泌物中有病毒釋出，并僅持續(xù)一天(第3天)。與接種狗相比，未接種的對照狗顯示明顯較高的鼻病毒釋出(p＝0.0003)。這些結果清楚表明所述CIV疫苗通過接種狗顯著抑制鼻病毒釋出。
結果血清學反應 在初次接種和加強接種后計算從HAI測定所得的計算幾何平均抗體效價(GMT)。記錄免疫之間的效價增加倍數(shù)。用Wilcoxon Exact秩和檢驗比較對照組和接種組之間的抗體效價。在研究中登記的所有16只狗在初次接種時均為健康且血清陰性(即，CIV抗體陰性)(HAI效價＜10)。在接種前一天(第-1天)收集的鼻拭子證實所有的狗均沒有鼻CIV釋出。對照狗在感染時保持血清陰性。
將HAI抗體效價制成表格，并比較對照組和接種組。在初次接種后所有接種狗產生可測水平的抗體效價。HAI抗體效價范圍為10和40之間，且GMT為22，當與對照狗相比時，這些效價是顯著的(p＝0.0070)。第二次接種加強了抗體效價六倍(GMT＝135)，這明顯高于對照組(p＝0.0002)。大部分顯示HAI效價為160(75％)的狗的抗體效價范圍為80和160之間。所有對照狗保持無CIV抗體直至感染時(HAI效價＜10)。感染后，接種狗的抗體效價達到非常高的水平(GMT＝546)，證明了疫苗提供在誘導免疫系統(tǒng)抗有毒CIV的效力。這些狗中的HAI效價范圍為120和1920之間。未接種的對照狗也隨著CIV感染而生成GMT為149的抗體。
結果肺實變、病毒分離和組織病理學 在所有流感感染中，肺實變/肺炎是主要的病理性損傷。在發(fā)展感染模型的先前研究中，我們在感染后第6天和14天在狗中觀察到了嚴重肺實變。因此，為了評估CIV是否預防CIV誘導的肺實變，將對照組和接種組的所有狗在感染后第10天無痛處死，進行尸體剖檢。評估肺損傷并按每個肺葉的實變百分比評分。在尸體剖檢期間，根據狗的肺評分系統(tǒng)(與Diseases ofthe Swine(1999)第8版，第61章，第913-940頁中的豬流感病毒肺評分系統(tǒng)相似)將每個肺葉的肺實變百分比評分轉變?yōu)榉Q重評分。用WilcoxonExact Rank秩和檢驗比較接種組和對照組的中值肺評分，并計算雙側P值。也記錄疫苗效率相對于對照的緩和分數(shù)評估(Mitigated fraction estimate)以及評估的95％置信區(qū)間。
對照組中所有的狗(100％)顯示不同程度的肺實變，而接種組僅有一只狗顯示輕微肺實變(12.5)。未接種的對照狗的肺損傷特征為出血和微紅色實變和肝樣變。對照組肺評分范圍為0.10和14.70之間，其中中值肺評分為4.9。對照組的肺評分明顯高于接種組(p＝0.0005；緩和分數(shù)評估為93.5％)。肺評分清楚證明用于本研究中的CIV疫苗制劑保護狗預防CIV誘導的肺實變。
除了在尸體剖檢中評分損傷之外，也可無菌收集肺組織進行病毒分離和在福爾馬林進行組織病理學檢測。從接種和對照狗的肺組織樣品中均未發(fā)現(xiàn)可檢測的CIV，這與無鼻病毒釋出相關聯(lián)。因為流感病毒引起急性感染在前七天內出現(xiàn)峰病毒脫落和臨床征象，這個現(xiàn)象是預期的。到感染后10天，病毒從肺組織完全清除。這些結果與之前的研究結果一致。組織病理學檢查顯示對照和接種狗有不同程度的表示肺組織炎癥的組織病理學變化。這個發(fā)現(xiàn)并不意外，因為甚至在病原特異性免疫的存在下，對任何病原的免疫反應也可能導致一定程度的炎癥反應。此外，對照和接種狗的組織病理學的肺損傷嚴重性不能進行比較，因為所述組織不是從肺損傷區(qū)域選擇性收集的。因此，組織病理學不能用作評估本研究中的疫苗的效力的標準。
結論 疫苗接種在顯示疫苗引起的免疫反應刺激的初次接種(GMT＝22)和第二次接種(GMT＝135)后誘導顯著較高的抗體反應，如通過HAI方法測定。
疫苗顯著減輕CIV誘導的臨床征象，特別是咳嗽，每只狗的劑量為500HAU，這證實了所述疫苗控制CIV誘導的臨床疾病的效率。
疫苗在接種狗中顯著減少鼻病毒釋出，這證實了所述疫苗減少感染的效力。
疫苗成功地保護狗預防CIV誘導的肺實變，證實了所述疫苗抗最嚴重臨床后果-肺炎的效力。
疫苗對狗不引起主要副作用，證明了所述疫苗的安全性。
臨床評估指南 鼻排出物 0＝來出現(xiàn) 0.5＝漿液排出物從鼻孔流下水性液滴。這里記錄從鼻中流出的液體。
1＝粘液膿性排出物，輕度至中度從鼻至口至少不完全流下混合有粘液的混濁液體。
2＝粘液性膿性排出物，重度粘液流過口。
眼排出物 0＝未出現(xiàn)在眼角有少量干的結痂物，不認為是眼排出物。
0.5＝漿液排出物從眼睛流出清亮液體排出物。
1＝粘液膿性排出物，輕度至中度從眼睛至口至少不完全流下混合有粘液的混濁液體。
2＝粘液性膿性排出物，重度液體或粘液流下鼻部或在眼睛邊緣滾動并且在眼內角或外角滲入頭發(fā)。
咳嗽 0＝未出現(xiàn) 0.5＝輕微僅觀察到短暫咳嗽。
1.0＝中度頑固性咳嗽，在觀察期重復出現(xiàn)。
2.0＝重度咳嗽伴隨呼吸困難或干嘔聲。
噴嚏 0＝未出現(xiàn) 2＝出現(xiàn) 呼吸困難 0＝未出現(xiàn)(正常呼吸) 2＝出現(xiàn)(喘息) 抑郁 0＝未出現(xiàn)(正?；钚? 2＝出現(xiàn)與正常相比，狗的活動或嬉戲較少。當觀察時如果出現(xiàn)昏睡或躺下和站立勉強，則記錄。
盡管為了清楚理解而詳細描述了前述發(fā)明，很明顯可在所附權利要求的范圍內進行某些改動。對所有目的，本文所引用的所有公開物和專利文件都以全文納入作為參考，納入程度如同其中每一個都單獨表示一樣。
從上文顯而易見的是本發(fā)明提供一些應用。例如，本發(fā)明提供任何新鑒別的致病流感病毒株以及已知致病株用于制備適于細胞培養(yǎng)的分離物和/或疫苗的應用。本發(fā)明提供為或能制成允許流感生長的任何新鑒別的細胞培養(yǎng)細胞的應用。本發(fā)明提供適于組織培養(yǎng)的株制備成疫苗的方法，所述疫苗具有至少減毒、亞單位、片段或死病毒；并且還有佐劑、載體、賦形劑、抗流感藥劑和增強對病毒的免疫反應的其它試劑。所述疫苗可在與流感接觸之前或接觸之后應用。
權利要求
1、通過有限稀釋克隆選擇在組織培養(yǎng)細胞中生長的人流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟
系列稀釋流感病毒分離物，和
使每種稀釋物與培養(yǎng)細胞接觸；
使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間；
從引起CPE的最高倍稀釋物中收獲病毒；以及
用收獲的病毒重復所述過程。
2、根據權利要求1所述的方法，還包括在與所述培養(yǎng)細胞接觸之前混合所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶。
3、根據權利要求2所述的方法，其中所述胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。
4、根據權利要求2所述的方法，其中所述使適于組織培養(yǎng)的分離物與所述組織培養(yǎng)細胞接觸的步驟在少于約0.01的MOI下進行。
5、根據權利要求1所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)細胞為哺乳動物胚胎腎細胞。
6、根據權利要求5所述的方法，其中所述哺乳動物胚胎腎細胞為人胚胎腎細胞。
7、根據權利要求1所述的方法，其中所述流感病毒為A、B或C型流感病毒。
8、根據權利要求7所述的方法，其中所述A型流感病毒為H5N1株。
9、根據權利要求1所述的方法，其中所述流感病毒分離物最初在含胚雞蛋中生長，以得到適于組織培養(yǎng)的大量接種物。
10、根據權利要求9所述的方法，其中所述流感病毒分離物最初在羊膜上生長。
11、生產人流感病毒疫苗的方法，包括純化根據權利要求1所述的收獲的病毒。
12、根據權利要求11所述的方法，其中所述純化步驟用尺寸排阻層析進行。
13、根據權利要求11所述的方法，還包括用有效滅活病毒的量的二乙烯亞胺(BEI)處理所述病毒。
14、免疫原性組合物，包括BEI-滅活的人流感病毒和佐劑。
15、疫苗，包括以每劑量少于4μg人流感HA配制的人流感病毒，其中至少70％的HA具有相同氨基酸序列。
16、根據權利要求15所述的疫苗，其中所述人流感病毒通過BEI滅活。
17、根據權利要求15所述的疫苗，其中所述疫苗還包括ISCOM。
18、根據權利要求15所述的疫苗，其中至少90％的HA具有相同氨基酸序列。
19、通過有限稀釋克隆選擇在組織培養(yǎng)細胞中生長的犬流感病毒(CIV)H3N8的方法，所述方法包括
系列稀釋流感病毒分離物，和
使每種稀釋物與培養(yǎng)細胞接觸；
使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間；
從引起CPE的最高倍稀釋物中分離病毒；以及
用收獲的病毒重復所述過程。
20、根據權利要求19所述的方法，還包括在與所述培養(yǎng)細胞接觸之前混合所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶。
21、根據權利要求19所述的方法，其中所述胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。
22、根據權利要求19所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)細胞為哺乳動物胚胎腎細胞。
23、根據權利要求5所述的方法，其中所述哺乳動物胚胎腎細胞為馬-達氏牛腎(MDBK)細胞。
24、免疫原性組合物，包括滅活的犬流感病毒(CIV)H3N8和佐劑。
25、根據權利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑為油和水乳液。
26、根據權利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑為氫氧化鋁。
27、根據權利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述滅活的CIVH3N8為二乙烯亞胺滅活的CIV H3N8。
28、疫苗，包含根據權利要求24所述的免疫原性組合物。
29、根據權利要求28所述的疫苗，還包含免疫學上有效量的一種或多種另外的滅活CIV血清型。
30、根據權利要求28所述的疫苗，還包含另外的病原體，其中所述另外的病原體選自犬瘟病毒、犬腺病毒、犬細小病毒、犬副流感病毒、犬冠狀病毒、鉤端螺旋體血清型、利什曼生物、包柔氏螺旋體屬、支氣管博德特氏菌、支原體屬、狂犬病病毒、犬艾希體及上述的混合物。
31、根據權利要求28所述的疫苗，其中所述CIV H3N8以每劑量500HAU配制，且其中至少70％的HA具有相同氨基酸序列。
32、根據權利要求31所述的疫苗，其中所述佐劑為氫氧化鋁。
33、根據權利要求34所述的疫苗，其中至少90％的所述HA具有相同的氨基酸序列。
34、免疫犬類抗CIV的方法，包括用根據權利要求28所述的疫苗注射犬類。
35、包含與CIV H3N8結合的抗體的血清，所述抗體由根據權利要求34所述的方法免疫的犬類獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇在組織培養(yǎng)細胞中生長的流感病毒以制備適于組織培養(yǎng)的病毒分離物的方法。本發(fā)明還涉及由所述分離物制備的疫苗。
文檔編號A61K39/145GK101610787SQ200780051376
公開日2009年12月23日 申請日期2007年12月14日 優(yōu)先權日2006年12月15日
發(fā)明者T·L·沃斯梅恩, P·高, B·A·埃迪, O·Y·阿布德爾梅吉 申請人:先靈-普勞有限公司