專利名稱：：對A型流感病毒復制有抑制作用的siRNA及其編碼序列的制作方法對A型流感病毒復制有抑制作用的siRNA及其編碼序列
技術領域：
本專利涉及對流感病毒有干擾作用的siRNA序列的設計和干擾作用的鑒定
背景技術：
流行性感冒(Influenza),簡稱流感，被稱為最古老和最致命的人類瘟疫之一。據(jù)歷史記載，早在1510年英國就發(fā)生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美國每年有2萬人死于流感，俄羅斯每年也有1萬人死于流感，英國每年有5萬人由流感發(fā)展成肺炎，其中約20%死亡。據(jù)估計，全球每年流感患者死亡人數(shù)高達60萬人，多于艾滋病患者死亡的人數(shù)。美國已將流感列為繼心臟病、癌癥、中風、肺氣腫之后的威脅生命的第五大"殺手"。流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus)分別引起的急性呼吸道傳染病。甲乙丙不僅反映了病毒被發(fā)現(xiàn)的年代及前后順序，更主要的是反映了對人類危害程度的順序。甲型變動常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性流感大流行，在動物中分布廣泛，并也能在動物引起流感流行和造成大量動物死亡。盡管由死病毒、減毒毒株或重組表面糖蛋白組成的抗流感疫苗能夠有效地保護約7080%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能針對一小部分毒株，對于新的潛在爆發(fā)的毒株可能沒有作用。而且，對于高風險人群如嬰孩、老人、孕婦和其它各種免疫力低下的人群，疫苗的保護作用是非常有限的，保護率低于40%。由于大部分的死亡都是發(fā)生在高風險人群中，疫苗對于這些最需要它們的人卻不能起到很好的保護作用。正在應用的幾種抗流感藥物也能夠降低流感感染的發(fā)生和減輕流感感染時的癥狀。但是，藥物的副作用、病人的承受能力、可能出現(xiàn)的抗藥性變異限制了這些藥物的大規(guī)模使用。所以，對于預防和治療流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特別是在高風險人群中和爆發(fā)流感時。因此，流感的防治至少在今后50年內(nèi)仍然是一個嚴重的問題，尋找更有效的預防和治療途徑是醫(yī)學研究的重大課題。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是1998年首先在線蟲發(fā)現(xiàn)的由雙鏈RNA介導的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。RNAi—經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學研究領域中最為活躍的熱點之一，Science雜志在2001年將其列為十大科學成就之一，2002年又將其列為十大科技之首；Nature雜志也將小RNA評為2002年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一；AndrewZ.Fire禾卩CraigC.Mello因RNA干擾的發(fā)現(xiàn)而獲得了2006年諾貝爾生理醫(yī)學獎。隨著廣泛深入的實驗研究的進行，人們對RNAi的機制有了更多的了解。目前認為RNAi的主要過程為①siRNA形成階段。RNAi的誘導物在細胞質(zhì)內(nèi)被RNaseIIIDicer切割成為21-23nt的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)，siRNA的結構特征是5'端單磷酸，3'端羥基，而且3'端有23-nt的堿基突出；②RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedSilencingComplex,RISC)的形成階段。siRNA與RNAi特異性酶(如Ago-2)結合，形成RISC，具有特異性的核酸內(nèi)切酶活性能特異性地降解與siRNA同源的mRNA;③效應階段。RISC中siRNA變性，雙鏈解開，卸下正義RNA，反義RNA仍結合在復合物上，并引導RISC與同源的靶目標mRNA結合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶目標mRNA切斷(切割位置在siRNA的中央，距離5'端lO-nt)，從而阻斷了其翻譯成蛋白質(zhì)，表現(xiàn)為基因沉默。miRNA導致基因沉默的機制與此稍有不同，它們與靶mRNA3'非編碼區(qū)(untranslatedregion,UTR)通過不完全互補結合，抑制翻譯過程和蛋白質(zhì)的合成。RNAi能夠被迅速應用于多種生物和功能的研究，得益于它的實驗方法相對簡單，周期短，表型易于觀察。RNAi實驗中最關鍵的因素是干擾靶點的選擇、siRNA的制備和基因?qū)敕椒ㄗ鳛橐环N快速、有效、特異的抑制基因表達的工具，尤其是發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞也存在這一機制后，RNAi被廣泛用于基因功能的研究以及腫瘤、病毒性疾病和遺傳性疾病的治療研究。自2003年以來RNAi抗IAV的已經(jīng)有很多，有細胞水平的，也有動物水平的，有用合成的siRNA的，也有用載體的。Ge等針對A型流感病毒病毒的八個基因設計并合成了20個siRNA，與H1N1共轉(zhuǎn)染MDCK細胞和十日齡雞胚，結果提示以NP和PA基因為靶點的siRNA對A型流感病毒病毒感染有較好的抑制作用。EricKa-WaiHui等通過研究指出以病毒的M基因為靶點的化學合成siRNA能夠特異性地抑制293T細胞中流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml的表達，并且利用慢病毒載體來表達針對M基因的siRNAs同樣能夠特異性地抑制MDCK細胞中Ml的表達和流感病毒的復制。我國學者郭驍才等采用自己編寫的計算機程序結合系統(tǒng)發(fā)育重建方法，對6101個siRNA分子進行了計算機篩選，結果表明設計的siRNA的分子針對NP和PBl應該是最有效的。在動物水平實驗上，Stephen等證明了針對A型流感病毒H1N1的NP和PA高度保守區(qū)域的特異的siRNA能夠抑制病毒在小鼠體內(nèi)的復制，并且能夠抑制多種H5和H7亞型病毒的體內(nèi)復制。另外，QingGe等發(fā)現(xiàn)將化學合成的siRNAs和一種多聚陽離子載體PEI—起靜脈注射到小鼠后眼窩，可以抑制病毒感染的小鼠的肺部內(nèi)的病毒復制。同樣的結果也可見于小鼠被能夠表達siRNAs前體的慢病毒載體與PEI共注射或與Infasurf共灌輸?shù)叫∈蠓尾俊?br/>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供3條對A型流感病毒復制有抑制作用的siRNA及其編碼序列。所述的3條對A型流感病毒復制有抑制作用的siRNA的序列分別如序列表400<1>、400<2>和400<3>所示。本發(fā)明所述的三條siRNA的動物水平的實驗結果表明，RNAi不但能有效抑制H1N1的病毒復制，而且能夠抑制A型流感病毒其它亞型(如H3N1)的復制，為其用于流感的治療和預防提供了實驗依據(jù)。具體實施方式以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例l:siRNA序列的設計和靶點的選擇設計和合成siRNA應遵循的一般原則是①應避免選擇5'和3'端UTR和起始密碼區(qū)；②應根據(jù)目的基因的mRNA，選擇其AUG起始密碼子下游50100nt區(qū)域處的編碼序列；③GC含量應在30%50%之間；④盡量避免3個同樣的核苷酸連續(xù)出現(xiàn)；⑤每條鏈的3'端要有2個堿基(最好是TT)突出；⑥最后，選擇的DNA片段經(jīng)BLAST査詢，應與其它人類基因無同源性，以避免非特異性抑制。采用這一原則，設計出序列表所述的三條siRNA序列〈4001、<400>2、以及<400>3，并采用常規(guī)方法進行合成，進行以下的試驗。實施例2:shRNA表達載體的構建以129Sv/Ev小鼠基因組DNA為模板進行PCR，擴增出276bp的U6啟動子序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pBluescript載體(美國Stratagene公司)連接得到載體pU6P，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進行測序，以證實插入序列的正確性。實施例3:pU6-siHlNl載體的構建載體pU6P用&0RV-i7^I雙酶切，質(zhì)粒酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠用膠回收試劑盒進行膠回收，與合成的siRNA寡核苷酸鏈進行連接反應。轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆。實施例4:雞胚實驗驗證pU6-siHlNl干擾H1NI流感病毒增殖的有效性同時注射H1N1流感病毒(1000倍稀釋液O.lml)禾卩pU6-siHlN1(5微克)進九日齡雞胚氣室下尿囊腔，33。C培養(yǎng)72小時，取尿囊液,測血凝效價。血凝試驗測定尿囊液病毒滴度，具體過程如下(1)于微量血凝板的每孔中滴加稀釋液1XPBS50UL，根據(jù)被檢樣品數(shù)量定所加排數(shù)。(2)吸取被檢尿囊液分別滴加于第一列孔，每個樣品50pL，然后由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11列孔各吸取50uL棄之。最后一列不加樣品作空白對照。(3)于每孔中加入0.5。/。紅細胞懸液50uL。(4)置微型振蕩器上振蕩lmin，或手持血凝板繞圓圈混勻。(5)放室溫下(182(TC)30min，或37。C下1520min，觀察結果。經(jīng)三次重復實驗，序列表所述的三條序列<400>1、<400>2、以及<400>3對流感病毒復制的抑制率如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>序列表<110>中山大學<120>對A型流感病毒復制有抑制作用的siRNA及其編碼序列<160>3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1aatccgaccgctcttaata19<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2aatctggcgccaagctaataa21<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3gaaatctcactcagttatt19權利要求1.一種對流感病毒復制有干擾作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<1>所示。2.—種對流感病毒復制有干擾作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<2>所示。3.—種對流感病毒復制有干擾作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<3〉所示o4.權利要求l、2、或3所述的siRNA作為治療流感病毒的藥物的應用。5.含有權利要求l、2或3所述的siRNA的表達載體pU6-siHlNl。全文摘要本發(fā)明公開了三條對流感病毒復制有抑制作用的siRNA；針對H1N1的shRNA表達載體pU6-siH1N1的構建及其對A型流感病毒的干擾作用的鑒定技術。本發(fā)明首先利用分子生物學的實驗技術構建了十幾條siRNA的表達載體；然后通過雞胚實驗測HA滴度的方法確定了siRNA對流感病毒干擾的有效性。文檔編號C12N15/11GK101275132SQ20081002665公開日2008年10月1日申請日期2008年3月6日優(yōu)先權日2008年3月6日發(fā)明者任政華,亮周,周俊祺,徐安龍,李榮輝,征謝,鄔明月申請人:中山大學