專利名稱：一種抗病毒和抗腫瘤藥－白細(xì)胞介素－8的制作方法
背景技術(shù)：
a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素-8(IL-8)的抗病毒和抗腫瘤活性及其在人和動物病毒引起的病毒感染和致腫瘤病毒引起的癌癥治療中的應(yīng)用。
b)現(xiàn)有技術(shù)描述一些使人類遭受痛苦的嚴(yán)重感染性疾病由某些致命的病毒引起，其中有鼠疫、天花、脊髓灰質(zhì)炎、肝炎、黃熱病、免疫缺陷和各種腦炎。有一些疾病例如流感、麻疹、流行性腮腺炎、水痘和呼吸道-胃腸道功能紊亂以其高度傳染性和急性不適癥狀著稱。還有一些例如風(fēng)疹和巨細(xì)胞病毒會導(dǎo)致先天異常。最后還有一些病毒，稱為致腫瘤病毒，能引起人和動物腫瘤和癌癥。
這些病毒中，皰疹病毒科家族最為引人注目。皰疹病毒在自然界中具高度傳播性并對人具高度病原性。例如，Epstein-Barr病毒(EBV)被認(rèn)為導(dǎo)致少年兒童或青春期或青年人傳染性單核細(xì)胞增多癥。急性傳染性單核細(xì)胞增多癥的標(biāo)志為咽喉腫痛、發(fā)燒、頭疼、淋巴結(jié)病、扁桃體腫大和非典型性外周血淋巴細(xì)胞的分離。其它表現(xiàn)常包括輕度肝炎、脾腫大和腦炎。EBV也通常與兩種形式的癌癥相關(guān)伯基特淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)。赤道非洲區(qū)，BL是最常見的兒童惡性腫瘤，約占兒童癌癥的80％。NPC在中國南部25到55歲的人中是最常見的癌癥之一，而北美高加索人中發(fā)病率卻很一般。象巨細(xì)胞病毒一樣，EBV也與移植后淋巴組織增生疾病有關(guān)，這種疾病是在固體器官或骨髓移植后潛在致命的慢性免疫抑制綜合癥。
另一種皰疹病毒稱為I型單純皰疹病毒(HSV-1)，可能是齦口炎的病原體。感染表現(xiàn)為發(fā)燒、咽喉腫痛和口腔潰瘍性泡狀損傷。HSV引起的最嚴(yán)重的臨床疾病是原發(fā)性生殖器皰疹病毒感染。HSV-1能引起生殖器皰疹病毒感染，HSV-2是與這種病毒有關(guān)的主要病毒。HSV感染伴隨著使生殖器損傷的水泡、膿皰、和潰瘍。也可能發(fā)生尿潴留綜合癥。超過80％的人為HSV-1和HSV-2血清陽性，研究顯示復(fù)發(fā)或病毒再活化的幾率高達60％。其它疾病也與HSV有關(guān)，包括皮膚和眼睛感染，例如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或角結(jié)膜炎。美國每年診斷眼部HSV感染的病歷約300000件。
人皰疹病毒6(HHV-6)對免疫系統(tǒng)細(xì)胞有顯著嗜性，因此HHV-6感染可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)改變?，F(xiàn)已清楚HHV-6是兒童原發(fā)性疹病感染的起因。最近研究表明，移植前血清陽性的器官移植受體病毒活化的優(yōu)勢比例提供了免疫抑制之后激發(fā)病毒再活化的血清學(xué)證據(jù)。嗜異性陰性單核細(xì)胞增多癥樣疾病和非A非B型肝炎也與活化HHV-6感染有關(guān)。HHV-6常在人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染病人中分離出。HIV和HHV-6能夠保留在同一個靶細(xì)胞中的事實得出這樣的推論，既HHV-6感染可能是HIV血清陽性病人過度到AIDS綜合癥的輔助因素。最近研究也表明，人皰疹病毒與HIV疾病密切相關(guān)。事實上，卡波西肉瘤(KS)，一種多發(fā)于HIV感染人群的腫瘤，發(fā)現(xiàn)具有傳染原性。這種病毒被命名為KS相關(guān)皰疹病毒，它的正式分類類似HHV-8。
在所有感染性疾病中，治療效能常依賴于宿主的免疫反映。對于皰疹病毒尤其如此，事實上，所有皰疹病毒的潛伏感染能力導(dǎo)致免疫妥協(xié)病人再活化感染的極高發(fā)生率。對腎移植受體，40％到70％的潛伏HSV感染會重新激活，80％到100％的CMV感染重新激活。HIV陽性病人(AIDS)也觀察到有這種病毒的再活化現(xiàn)象。
今天，用于病毒感染的治療藥物相對有限。例如，用于治療皰疹病毒感染主要有四種化合物碘苷、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋。它們的效能有限并會產(chǎn)生一些副作用。曾報道碘苷用于治療眼HSV感染的病人35％有過敏反應(yīng)。阿糖腺苷最常見的副作用是胃腸道功能紊亂(15％的病人)。阿昔洛韋的主要副作用是腎功能的改變，由于阿昔洛韋是一種核苷類似物，故能插入病毒和宿主細(xì)胞的DNA，從而影響宿主細(xì)胞的正常分裂。更昔洛韋最重要的副作用是約40％的AIDS病人發(fā)生中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥。
因此，迫切需要研究治療病毒感染的有效治療方法。
疾病組織白細(xì)胞堆積認(rèn)為是炎癥過程的標(biāo)志。局部產(chǎn)生趨化細(xì)胞因子能誘導(dǎo)炎癥區(qū)白細(xì)胞恢復(fù)正常。表現(xiàn)這種性質(zhì)的蛋白質(zhì)按照前兩個半胱氨酸的位置分為兩個亞族，或者被一個氨基酸分開(CXC蛋白)或者連接型(CC蛋白)。這兩個亞族的成員按照其對靶細(xì)胞的選擇性和其基因的染色體位置區(qū)分(Baggiolini等綜述，免疫學(xué)進展，55:97,1994)。這些趨化細(xì)胞因子中，白細(xì)胞介素-8(IL-8)屬于CXC家族，最初從受激的人血單細(xì)胞培養(yǎng)物上清夜中分離得到。IL-8是一種非糖基化蛋白，它首先被合成99個氨基酸的前體，剪切掉一段20氨基酸的序列后被分泌。形成的成熟分子有79個殘基，進一步在N末端水解，產(chǎn)生幾個有生物活性的N末端類似物，主要兩種形式是72氨基酸型和77氨基酸型。IL-8的結(jié)構(gòu)、序列和生物學(xué)性質(zhì)由Baggiolini M.等綜述(免疫學(xué)進展，55:97,1994)。
許多細(xì)胞能產(chǎn)生IL-8，例如角質(zhì)化細(xì)胞、上皮細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和肝細(xì)胞。外周血白細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)IL-8的主要細(xì)胞源是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞而不是淋巴細(xì)胞。
IL-8在體內(nèi)體外均產(chǎn)生許多生物活性。IL-8的公知活性是它的趨化性和人中性粒細(xì)胞的脫粒能力。IL-8處理中性粒細(xì)胞可立即觀測到形狀改變、能動系統(tǒng)的活化和胞液游離Ca2+的增多。同時觀察到特異性顆粒釋放維他命B12結(jié)合蛋白。IL-8還能導(dǎo)致嗜苯胺藍粒脫粒和彈性蛋白酶及其它水解酶的釋放。這種脫粒伴隨著細(xì)胞膜大量粘連分子的上調(diào)。脫粒也導(dǎo)致Ⅰ型補體受體(CR1)和Ⅲ型補體受體(CR3)的增強表達。IL-8也是嗜酸細(xì)胞和人淋巴細(xì)胞尤其是T細(xì)胞的趨化因子IL-8的生物學(xué)作用通過7種跨膜區(qū)域和G蛋白結(jié)合受體介導(dǎo)。已描述了IL-8受體的兩種形式，并被定義為A型和B型。IL-8的A型受體對IL-8有高度親合性，但對Groα(具有黑素瘤生長刺激活性)親合性較低，而B型對兩種細(xì)胞因子都有高度親合性。外周血白細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞大量表達這兩型IL-8受體，單核細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞表達IL-8受體水平較低。B細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞未檢測出IL-8受體的表達。
不斷積累的證據(jù)支持IL-8在許多病理發(fā)炎過程中起重要作用，事實上，IL-8已在炎癥組織和滲出物中檢測到，例如，銀屑病的鱗片提取物、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或痛風(fēng)病人的滑膜液、肺氣腫病人的胸膜液和呼吸窘迫綜合癥的支氣管肺泡洗液。而且近來也發(fā)現(xiàn)C-C趨化因子亞族的RANTES和MIP-1α和β具有抗病毒的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它們能夠抑制HIV-1、HIV-2和SIV病毒蛋白的體外合成。
最近進一步報道了IL-8的抗病毒作用(Mackewicz和Levy，愛滋病研究和人逆轉(zhuǎn)錄病毒，8:1039-1050,1992)。顯示IL-8在特異條件下能夠抑制HIV在CD4+淋巴細(xì)胞的復(fù)制。事實上，發(fā)現(xiàn)IL-8能影響自然感染的CD4+細(xì)胞的病毒復(fù)制，而不能影響急性感染細(xì)胞的病毒復(fù)制。
存在幾種假定的抗病毒活性機制，其中一些也許對阻斷特異病毒對其靶細(xì)胞的附著具有高度的選擇性。碘苷、阿糖腺苷、阿昔韋洛和更昔韋洛專屬性用于治療皰疹病毒感染，對其它病毒例如HIV沒有作用，由此組成了選擇性抗病毒活性藥物的例子。
按照Mackowicz和Levy提供的IL-8抗HIV作用的數(shù)據(jù)不能推斷出IL-8具有抗所有病毒的活性。目前使用的大多數(shù)治療病毒感染的藥物對特異病毒的選擇性極為支持這一結(jié)論。目前為止，無其它IL-8抗病毒活性的令人信服的報道。
最后，TALMADGE的PCT申請PCT/US95/12099,1996年3月28日出版，公開號為WO96/09062，描述了IL-8的多肽類似物，并聲稱這一類似物能用于治療一些病原性疾病，例如病毒感染、細(xì)菌感染、真菌感染、酵母、宿主寄生感染。然而，TALMADGE并沒有提供任何數(shù)據(jù)以證明這一結(jié)論，其是基于該多肽具有這些功效的推斷或僅僅是愿望。
因此，迫切需要研制出一種抗病毒藥物，其具有較好的功效而不會表現(xiàn)出已知抗病毒藥的不良副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了預(yù)防和治療病毒感染和致腫瘤病毒引起的癌癥的方法。
按照這些方法，給需要這種治療的人或動物服用藥物學(xué)和生理學(xué)可接受的治療有效量的IL-8制劑。
本發(fā)明的一個目的是提供一種抗病毒藥物以及用于預(yù)防和治療病毒感染的更有效方法，而且該方法不會產(chǎn)生已知抗病毒藥物的不良副作用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗病毒藥物以及用于預(yù)防和治療致腫瘤病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒(除了HIV-1和HIV-2)、乳頭瘤病毒、腺病毒和皰疹病毒引起的癌癥的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種抗病毒藥物以及用于免疫抑制病人和動物病毒感染的預(yù)防和治療的方法。
本發(fā)明提供了IL-8藥物作為抗病毒藥抗包括但不局限于EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7和HHV-8的皰疹病毒，以及預(yù)防和治療這些皰疹病毒引起的感染的方法。
本發(fā)明還提供了IL-8藥物作為抗其它人和動物病毒藥物的應(yīng)用，這些病毒包括但不局限于屬于小RNA病毒科的豬腸道病毒或?qū)儆谂げ《究频呐８篂a病毒或?qū)儆诟闭巢《究频呐：粑篮习《尽?br> 本發(fā)明還提供了IL-8藥物作為抗病毒藥物的應(yīng)用，該應(yīng)用用于與其它抗病毒藥物，包括但不局限于干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子α、更昔洛韋、阿昔洛韋、阿糖胞苷、碘苷和前列腺素或前列腺素類似物聯(lián)合使用治療人和動物病毒感染。
本發(fā)明還提供了IL-8作為抗病毒藥物用于預(yù)防和治療致腫瘤病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒(除了HIV-1和HIV-2)、乳頭瘤病毒、腺病毒和皰疹病毒引起的癌癥的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了IL-8作為抗病毒藥物在抗致腫瘤病毒引起的癌癥的治療中與其它抗癌藥物，包括但不局限于阿霉素、環(huán)磷酰胺和甲氨喋呤的聯(lián)合使用。
本發(fā)明還提供了IL-8作為抗病毒藥物用于預(yù)防和治療免疫抑制病人和動物的病毒感染的應(yīng)用。
免疫抑制病人包括器官或組織移植病人和用免疫抑制劑包括但不局限于硫唑嘌呤、皮質(zhì)類甾醇、阿霉素、環(huán)磷酰胺和甲氨喋呤治療的病人。免疫抑制病人還包括任何形式的癌癥和腫瘤用或不用抗癌化療藥包括但不局限于阿霉素、環(huán)磷酰胺和甲氨喋呤治療的病人。免疫抑制病人還包括用抗炎藥物包括但不局限于皮質(zhì)類甾醇、甲氨喋呤、硫唑嘌呤和環(huán)磷酰胺治療的炎癥病人。免疫抑制病人還包括嚴(yán)重?fù)p傷包括但不局限于灼燒損傷的病人，或慢性血液透析病人。
本發(fā)明還提供了IL-8藥物作為抗病毒藥在治療人和動物免疫抑制下的病毒感染中與其它抗病毒藥的聯(lián)合使用。
本發(fā)明還提供了一種抗病毒藥物配方，包括藥理可接受的治療有效量的IL-8，和藥物可接受的載體的組合。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和治療人和動物病毒感染的方法，包括給需要這種治療的人或動物服用藥理可接受的治療有效量的IL-8藥物。
附圖簡介圖1A-1F顯示了IL-8對EBV誘導(dǎo)的SCID鼠腫瘤生長和脾腫大的抑制作用。
圖2A、2B和2C顯示了IL-8和Groα對EBV誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞中Ca2+移動的影響。
圖3A和3B顯示了百日咳毒素對EBV誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞Ca2+移動的影響(A)和對RNA合成的影響(B)。
參考


較佳實施例ⅰ)IL-8藥物本發(fā)明的IL-8藥物是IL-8的72氨基酸型[Ser IL-8]72或77氨基酸型[AlaIL-8]77，以及[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77的衍生物或類似物。本領(lǐng)域公知IL-8少量氨基酸的增加或減少可能輕微改變即增強或減弱IL-8的活性。按照這一結(jié)論，IL-8的衍生物和類似物也包括改變的肽，其在許多生物系統(tǒng)顯示類似于IL-8的明顯生物活性。本發(fā)明所述的明顯的生物活性包括但不限于類似于IL-8的抗病毒活性。術(shù)語“IL-8藥物”包括[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77的該生物活性變異體。
蛋白修飾[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77的類似物或衍生物(變異體)被確定為[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77本身的氨基酸序列或其它性質(zhì)被共價或非共價修飾的分子。因此，變異體可能有也可能沒有約10KD的分子量(無還原劑例如β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇的SDS-PAGE檢測)。變異體氨基酸序列不僅包括[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77的等位相對物，而且包括其預(yù)先確定的突變體。一般地，變異體的氨基酸序列與[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77本身有至少80％的同源性，更典型的至少約90％。因此，術(shù)語“IL-8藥物”意味著或者是天然序列或者是變異體形式，除非另有理解。
因此，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的[Ala IL-8]77具有發(fā)表在《免疫學(xué)進展》(免疫學(xué)進展，55:97,1994)上的人[Ala IL-8]77氨基酸序列，和來源于其它種例如牛、馬、豬、羊、狗、鼠、貓等[Ala IL-8]77的[Ala IL-8]77蛋白類似物等，和這些[Ala IL-8]77分子的生物活性氨基酸序列變異體，該變異體包括等位的和體外合成的能表現(xiàn)其生物活性的[Ala IL-8]77蛋白的共價衍生物。
IL-8的衍生物和氨基酸序列變異體的生物活性決定了其治療效用，就向本文其它地方提及的那樣。
共價修飾本發(fā)明范圍內(nèi)包括了通過體外合成方便的進行IL-8藥物的共價修飾。這種修飾可以通過將純化或粗蛋白的目標(biāo)氨基酸殘基與能和選擇側(cè)鏈和末端的殘基反應(yīng)的有機衍生化試劑反應(yīng)引入分子。產(chǎn)生的共價衍生物可能具有改變的生物活性和/或生物有效性。因此，共價修飾的IL-8可以是降低生物活性的前藥，給藥后體內(nèi)緩慢轉(zhuǎn)化成較高活性的分子(原始IL-8藥物)。變異體也可能是IL-8代謝更穩(wěn)定和更有生物活性的類似物，該改變將導(dǎo)致該化合物延遲分布(降低代謝和/或清除)。
序列修飾也可以制備[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77的氨基酸序列變異體。這種變異體包括，例如，[Ser IL-8]72或[Ala IL-8]77自身氨基酸序列殘基的缺失、或插入、或替代。任何缺失、插入、和替代的組合也可以產(chǎn)生理想活性的變異體。
在基因水平，這些變異體一般由編碼[Ala IL-8]77DNA的核苷酸的定位誘變產(chǎn)生，由此產(chǎn)生編碼變異體的DNA，接著在混合細(xì)胞培養(yǎng)中表達該DNA。該變異體典型表現(xiàn)同自然發(fā)生的類似物同樣效量的生物活性。
因為[Ala IL-8]77可以聚合成二聚體，本文范圍內(nèi)提供了雜二聚體和均二聚體，其中之一或二亞基均為變異體，若其中兩個亞基都是變異體的，每一亞基鏈氨基酸序列的改變可以相同也可以不同。用編碼兩個亞基的DNA共同轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以方便地產(chǎn)生雜二聚體，如果必要，純化所需的雜二聚體或分離合成的亞基，分解亞基，混合分解的亞基，然后重組亞基。
術(shù)語“IL-8藥物”也包括IL-8受體的抗體，或者抗IL-8或上述IL-8類似物及變異體之一抗體的抗獨特型抗體，這些抗體誘生IL-8樣生物反應(yīng)，例如抗病毒作用。
術(shù)語“IL-8藥物”也包括IL-8受體(A型和B型)或能與IL-8結(jié)合的其它受體，或者該受體選擇區(qū)域相應(yīng)的肽，或者病毒包膜蛋白(糖蛋白或脂蛋白)，或者該蛋白選擇區(qū)域相應(yīng)的多肽，其阻止病毒顆粒與IL-8受體或其它IL-8結(jié)合受體的結(jié)合。
術(shù)語“IL-8藥物”也包括IL-8受體(或與IL-8結(jié)合的其它受體)類似物或變異體，該受體選擇區(qū)域相應(yīng)的肽類似物或變異體，病毒包膜蛋白(糖蛋白或脂蛋白)的類似物和變異體，或該蛋白選擇區(qū)域相應(yīng)的肽。
但是術(shù)語“IL-8藥物”不包括符合下列通式的約17個氨基酸的多肽Glu-Leu-Arg-Cys-Xaa1-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12其中Xaa1為Gln,Met，或Val；Xaa2為Ile，或Val；Xaa3為Lys,Gln，或Ser；Xaa4為Thr，或Ile；Xaa5為Tyr,Leu,Met,His,Val，或Thr；Xaa6為Ser,Gln,Thr,或Ala；Xaa7為Lys,Arg，或His；Xaa8缺失或為Pro,Phe，或Gly；Xaa9缺失或為Phe,Ile，或Val；Xaa10缺失或為His,Lys，或Arg；Xaa11缺失或為Pro,Leu，或Phe；Xaa12缺失或為Lys,His，或Arg。
ⅱ)病毒感染按照本發(fā)明，可用IL-8藥物治療的病毒感染是由人和動物病毒引起的感染。
“人和動物病毒”傾向于包括但不限于普通的DNA和RNA病毒和除HIV-1和HIV-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒。DNA病毒包括但不限于細(xì)小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科和嗜肝DNA病毒科。RNA病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠狀病毒科、呼腸孤病毒科、致腫瘤RNA病毒科和線狀病毒科。
研究了IL-8體內(nèi)抗Epstein-Barr病毒(EBV)的活性。眾所周知，SCID鼠以其缺乏B和T淋巴細(xì)胞為特征，當(dāng)與EBV感染受試體的外周血淋巴細(xì)胞混合常會形成B淋巴。這種感染伴隨著脾腫大、腹膜腔擴增和腹瀉。因此，SCID鼠代表了一種與病毒原性有關(guān)的人致淋巴瘤的值得關(guān)注的體內(nèi)模型。為評價IL-8的抗病毒活性，EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(B95-8細(xì)胞系)腹膜內(nèi)注入SCID鼠，然后按照下表1的不同方案腹膜內(nèi)注射IL-8藥物。
表1 IL-8對EBV感染的SCID鼠影響的體內(nèi)研究方案第1組未處理動物第2組0天注射IL-8第3組0天注射B95-8細(xì)胞第4組0天間隔30分鐘注射B95-8細(xì)胞和IL-8第5組0天注射B95-8細(xì)胞，0、1、2、3、4、5天注射IL-8第6組0天注射B95-8細(xì)胞，0、7、1 5、21、28天注射IL-8組1-649天處死動物并尸檢EBV感染的B95-8細(xì)胞(60×106)腹膜內(nèi)(IP)注入SCID鼠。在指定時間，用重組的IL-8處理鼠。49天后，處死鼠并尸檢。每組3只鼠，IL-8配制成包含0.1％BAS的0.9％的NaCl溶液，每只鼠腹膜內(nèi)注射25μg的IL-8。
注射后4周，單獨用B95-8細(xì)胞處理的鼠表現(xiàn)明顯的腹膜內(nèi)炎癥，特征為腹部腫大和腹瀉，為該模型癌癥生長的標(biāo)志。相反，IL-825μg每隔一周處理鼠共5次(第6組)沒有觀察到該癥狀。
25μgIL-8連續(xù)6天處理的鼠(第5組)，感染后第4周觀察到腹瀉，但比感染后未處理鼠(第3組)的程度輕。
僅用25μgIL-8處理一次的鼠(第2組)，觀察到的腹膜內(nèi)炎癥和腹瀉與感染后未處理動物(第3組)同樣嚴(yán)重。
第四周，組1、2和6的動物看起來很正常，不表現(xiàn)上述癥狀。組3的動物在感染后第五和第六周死亡，尸檢顯示脾和肝大出血。感染后第7周所有組存活的動物全部被處死并尸檢。
IL-8處理一次的感染動物(第4組)每只鼠均發(fā)現(xiàn)明顯的脾腫大和直徑約0.7cm的腫瘤(如圖1B顯示)。未感染、未處理的動物(第1組)脾正常并且沒有腫瘤(如圖1A顯示)。IL-8連續(xù)6天處理的動物(第5組)，觀察到脾腫大和腫瘤，但與第4組動物相比癥狀減輕。25μg IL-8每隔一周處理共四次的動物(第6組)，未檢測到腫瘤，脾(和其它器官)與未感染動物(組1和組2)相應(yīng)器官相比無明顯的形態(tài)區(qū)別。
同時也研究了IL-8體內(nèi)抗EBV的抗病毒活性，這是按照下表2的方案用IL-8處理或不處理人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)重建的SCID模型鼠進行。
表2 IL-8對PBMCS-HU-SCID鼠EBV感染影響的體內(nèi)研究方案第1組NaCl葡萄糖+0.1％BSA處理鼠(2)第2組IL-8處理鼠(2)第3組NaCl葡萄糖+0.1％BSA處理EBV感染鼠(10)第4組IL-8處理EBV感染鼠(5)所有動物腹膜內(nèi)注射40×106人PBMCs(0.5ml PBS中)。5天后，第3組和第4組動物用EBV感染(每只鼠腹膜內(nèi)注射0.5×106TFU)然后所有動物在0、6、13、20和27天用鹽水或IL-8處理。IL-8始終為NaCl葡萄糖+0.1％BSA溶液中的25μg大丸劑(腹膜內(nèi)注射)給藥。處理后31天，處死鼠。
結(jié)果顯示在下表3中。感染后第22-23天，組3的一些動物顯示感染癥狀，24-25天起，觀察致死率。25μg IL-8以每周間隔處理(腹膜內(nèi)注射)EBV感染鼠5次(第4組)，出現(xiàn)的癥狀延遲到26-27天，該組中，致死現(xiàn)象也延遲，第28天觀察到第一只動物死亡。到31天，第3組8只動物中的6只死亡，相反，第4組5只動物中2只死亡。31天存活的動物被處死并尸檢。兩組的存活動物無明顯腫瘤尺寸或數(shù)量及脾大小的區(qū)別。第1組和第2組動物不表現(xiàn)任何癥狀。
表3 IL-8對PBMCS-HU-SCID鼠EBV誘發(fā)(Indiced)癥狀(和致死率)的影響<


(1)觀察到的感染相關(guān)癥狀為由于腫瘤生長而導(dǎo)致腹部腫大、消瘦和降低的活力(無生氣)。
(2)本組最初包括10只動物，由于移植人PBMCS(由血清出現(xiàn)IgG和抗病毒抗體評價)，僅可考慮8只，另兩只(2)未成功。
單獨用NaCl葡萄糖+0.1％BSA或單獨用IL-8處理的鼠(第1組和第2組)未檢測到異常(直至31天)。
最近報道EBV能與人中性粒細(xì)胞體外相互作用，并調(diào)節(jié)RNA和蛋白合成。IL-8被認(rèn)為能誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞形狀改變和胞間游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的短暫升高。我們已經(jīng)從分離的人中性粒細(xì)胞得出EBV對[Ca2+]i產(chǎn)生相似但不相同的作用(Ca2+累積的動力學(xué)不同)。因此，我們研究了IL-8對EBV誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞[Ca2+]i升高的影響。檢測了帶有熒光探針FURA-2/AM并在與EBV接觸之前或之后用IL-8或Groα處理的人中性粒細(xì)胞中Ca2+的移動。當(dāng)中性粒細(xì)胞用IL-8預(yù)處理后，EBV誘導(dǎo)的[Ca2+]i的升高被強烈抑制。另一方面，EBV預(yù)處理中性粒細(xì)胞不會抑制IL-8或Groα的作用(圖2A、2B、2C)。既然IL-8受體是G蛋白偶合受體，本發(fā)明人進一步通過百日咳毒素預(yù)處理中性粒細(xì)胞驗證EBV誘導(dǎo)的Ca2+移動和的RNA合成中G蛋白的潛在作用，其中百日咳毒素是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合調(diào)控蛋白(G蛋白)公知的抑制物。獲得的結(jié)果顯示百日咳毒素顯著抑制EBV誘導(dǎo)的Ca2+移動和RNA合成，提示EBV誘導(dǎo)的結(jié)果由G蛋白介導(dǎo)。
然而涉及的IL-8的抗病毒和/或抗腫瘤作用機制還不清楚，可以假設(shè)IL-8觸發(fā)或增強了自然抗病毒機制，例如產(chǎn)生腫瘤致死因子α(TNFα)或干擾素?；蛘?，根據(jù)獲得的IL-8對EBV誘導(dǎo)的分離的中性粒細(xì)胞的生物作用的影響，可能EBV與其靶細(xì)胞的相互作用涉及IL-8受體(或可以識別IL-8的結(jié)合位點)，其中IL-8可能通過與結(jié)合區(qū)競爭(位阻效應(yīng))和誘導(dǎo)受體內(nèi)在化阻止病毒與靶細(xì)胞的相互作用?；蛘撸cIL-8接觸的靶細(xì)胞可能下調(diào)了與病毒感染有關(guān)的粘接、內(nèi)在化、復(fù)制和細(xì)胞自然抗病毒機制抑制等受體功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近的報道支持了這些假設(shè)化學(xué)激動素受體相關(guān)蛋白由各種病毒編碼并在感染細(xì)胞的質(zhì)膜上表達。EBV體系，認(rèn)為病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的BLR-1受體(可能等同于EBI-2)和BLR-2受體(等同于EBI-1)。它們是與IL-8受體高度同源的G蛋白偶合受體。EBV感染細(xì)胞中與IL-8受體同源的這些細(xì)胞因子受體的表達可以使感染細(xì)胞、無負(fù)載IL-8受體的B細(xì)胞對假定的IL-8抗病毒活性敏感。這些假設(shè)是為了提供一些IL-8抗病毒活性推測機制的理解并且不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
這些結(jié)果表明IL-8可以用于治療病毒感染和致腫瘤病毒引起的癌癥。
ⅲ)劑量范圍白細(xì)胞介素-8藥物的治療劑量將隨著應(yīng)處理癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、特別的IL-8藥物、聯(lián)合使用的其它活性化合物和其給藥途徑而改變，并基于臨床診斷確定。劑量也隨著個體病人的年齡、體重和反應(yīng)而改變。因此IL-8藥物的有效劑量可通過臨床藥代動力學(xué)研究，考慮所有條件和使用病人行為的最佳判斷來確定。通常，有效劑量約為血中1到100nM。據(jù)此，臨床醫(yī)師將使用能產(chǎn)生這一血藥濃度的劑量。
ⅳ)藥物組合物可以使用任何合適給藥途徑提供給哺乳動物，尤其是人有效量的本發(fā)明IL-8藥物。例如，可以口服給藥、非腸道給藥、局部給藥、動脈給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈給藥、胸膜內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥、注射給藥或皮下給藥等。注射包括灌注和連續(xù)滴注。劑型包括片劑、膠囊、粉劑、溶液劑、分散劑、懸浮劑、擠出劑、軟膏和氣霧劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括作為活性成分的IL-8藥物，和藥物可接受的載體以及任選的其它治療成分。
該組合物包括合適的口服或非腸道給藥的組合物。被方便的制成單位劑量形式并以藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制成。單位劑量形式可以是一種緩釋單位劑量形式。
實際應(yīng)用中，IL-8藥物可以作為活性成分與藥物載體按照常規(guī)的藥物混合技術(shù)徹底混合?？稍谳^寬范圍內(nèi)按照所需的給藥方式選擇載體。制備口服制劑可以使用任何有用的藥物基質(zhì)，例如，水、甘油、油、酒精、調(diào)味劑、防腐劑、染色劑等口服液體制劑例如懸浮劑、酏劑和溶液劑中的成分，或者口服固體制劑例如粉劑、膠囊和片劑中的載體例如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于片劑和膠囊方便使用，故它們代表了最有利的口服劑型單位，其中使用了固體藥物載體。如果需要，片劑可以用標(biāo)準(zhǔn)有水或無水技術(shù)包衣。
適于口服的本發(fā)明藥物組合物可以為分散單位例如膠囊劑、扁囊劑或片劑，每一單位包括預(yù)定量的IL-8藥物，也可以為粉劑或顆粒劑，或者水溶液或非水溶液的溶液劑或懸浮劑，或者水包油型乳劑，或者油包水型乳劑。這些制劑可由一些藥劑學(xué)方法制成，包括IL-8藥物與一種或兩種必要成分的載體混合。通常，首先將IL-8藥物與液體載體或精分的固體載體或與兩者均勻徹底的混合，然后，如果必要，產(chǎn)品形成需要提供的形狀。例如，片劑可以選擇一種或更多輔助成分通過壓片或鑄模制備。壓制片可以通過將非流動態(tài)活性成分例如粉末或顆粒與優(yōu)選的粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合用合適機器壓制而成。模制片可以將用惰性液體稀釋劑潮濕的粉末化合物混合物用合適機器模制成。
應(yīng)該理解IL-8藥物是以藥理和生理可接受的劑量給藥，這一劑量應(yīng)理解為對病人無害，或個別病人的有害副作用可以被該藥物的有益效果超過。同樣，IL-8藥物是以治療有效量給藥，該劑量應(yīng)被理解為滿足計劃治療的客體并在服用IL-8藥物后產(chǎn)生有益效果的量。
實施例體內(nèi)研究實施例1IL-8對EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞感染的SCID鼠體內(nèi)抗病毒作用本研究使用了8周齡的雌性SCID-CB17鼠(Charles River,St.Constant,Canada)。鼠被分成六組每組三只，EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞感染，然后用或不用IL-8處理，如上表1所述(第3到第6組)。第0天，B95-8細(xì)胞(60×106)腹膜內(nèi)注入SCID鼠。按照指示，鼠也被一次或多次注射(腹膜內(nèi))IL-8(第2、4到6組)(每只鼠每次注射25μg)(Peprotech Inc.,Rocky Hid,NJ)。使用的IL-8為72氨基酸型，并在包含0.1％BAS的0.9％的NaCl溶液中使用。處理7周后，鼠被頸脫位法處死并尸檢。腫瘤和其它感興趣的組織被照相(圖1A-1F)，解剖并冷凍保存以便進行免疫熒光研究和病毒DNA分析。圖1A顯示了非感染非處理鼠(組1)。圖1B和1C顯示了B95-8細(xì)胞感染后30分鐘一次注射IL-8(第4組)的EBV感染鼠。圖1B和1C顯示同樣動物的腹膜內(nèi)，其中圖1C為特寫照片(第4組)。圖1D和1E顯示B95-8細(xì)胞感染后30分鐘起每周用IL-8連續(xù)4周處理的EBV感染鼠(第6組)。圖1F顯示IL-8處理一次的EBV感染鼠的腹膜內(nèi)(左)，IL-8處理4次鼠的(中)和未處理鼠的(右)。
實施例2IL-8對人外周血單核細(xì)胞重建的SCID鼠(PBMCs-hu-SCID)的EBV感染抗病毒效應(yīng)對健康人類志愿者進行淋巴細(xì)胞提取。1小時內(nèi)收集細(xì)胞并進行Ficoll梯度離心(750×g)25分鐘純化。然后在PBS中洗PBMCs并腹膜內(nèi)注射(i.p.)(每只鼠注射0.5ml含40×106個細(xì)胞的PBS)到C.B.-17/SCID鼠(4-5周齡)。5天后，鼠被分成4組，動物用EBV(50μl 107TFU/ml/只鼠)腹膜內(nèi)注射感染并用或不用IL-8處理，如表2所示。IL-8配制成包含0.1％BSA的氯化鈉葡萄糖溶液使用。處理4周后，鼠被頸脫位法處死并尸檢。感興趣的組織被取下來并冷凍保存以便進行分子分析。
體外研究實施例3IL-8(和Groα)對EBV誘導(dǎo)的分離的人中性粒細(xì)胞中鈣離子移動的抑制作用中性粒細(xì)胞懸浮液(10×106個細(xì)胞/毫升)與熒光探針Fura-2/乙酸甲酯(分子探針，Eugene,OR)共培養(yǎng)(1μM 37℃30分鐘)。細(xì)胞洗至無胞外探針并再次懸浮于包含1.6mM鈣離子并添加10mM的HEPES的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)。包含F(xiàn)ura-2細(xì)胞的懸液以不同順序用EBV(106個轉(zhuǎn)化單位[TFU]/毫升)和IL-8或Groα(100nM)處理。用Aminco-Bowman，系列2裝置(SLM-Aminco,Rochester,NY)檢測熒光(激發(fā)波長和吸收波長分別為340nm和510nm)(圖2A、2B和2C)。EBV株系B95-8的制備按以前所述的方法進行。簡單地說，未檢測到支原體的B95-8生長在添加10％熱滅活FBS液的RPMI1640培養(yǎng)基中。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力低于20％，收獲無細(xì)胞的培養(yǎng)基上清夜并用0.45mm孔徑的濾器過濾，病毒顆粒用超離心進一步純化。病毒顆粒被懸浮于5mM的磷酸鈉溶液中(pH7.5)并以10-30％(wt/vol)葡聚糖梯度離心純化。濃縮的病毒液再懸浮于RPMI1640，等分后-80℃保存直至使用。病毒效價發(fā)現(xiàn)為1×107轉(zhuǎn)化單位(TFU)/毫升。圖2A、2B和2C顯示的結(jié)果進一步作如下解釋圖2A:a:Groα(100nM)；b:EBV；c:IL-8(100nM)圖2B:a:Groα(100nM)；b:IL-8(100nM)；c:EBV圖2C:a:EBV1/10稀釋，105TFU/ml；b:EBV；c:Groα(100nM)；d:IL-8(100nM)實施例4百日咳毒素對EBV誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞中Ca2+移動和RNA從頭合成的影響人中性粒細(xì)胞(10×106個細(xì)胞/毫升)加入0.5mg/ml百日咳毒素(催化G-蛋白的ADP-核糖化和抑制G蛋白介導(dǎo)的反應(yīng))37℃預(yù)培養(yǎng)2小時之后用EBV(106TFU/ml)或IL-8(100nM)刺激。按照實施例2所述測量鈣離子的移動。圖3顯示了結(jié)果，其中aIL-8刺激bEBV刺激c百日咳毒素預(yù)處理后IL-8刺激d百日咳毒素預(yù)處理后EBV刺激通過測量摻入全RNA的[5-3H]尿苷研究了EBV誘導(dǎo)的RNA合成。百日咳毒素(0.5mg/ml)預(yù)處理或不處理的中性粒細(xì)胞(5×106個細(xì)胞/毫升)懸浮于添加1％熱滅活(1小時，56℃)的自體血漿的HBSS緩沖液中。100毫升的等分細(xì)胞懸液每份加入1mCi的[5-3H]尿苷在96孔的微滴平板上培養(yǎng)隨后用3nM的GM-CSF(陽性對照)或用感染性的EBV(106TFU/ml)處理。平板在含5％CO2的潮濕空氣中37℃培養(yǎng)5小時。隨后，玻璃纖維板過濾收集細(xì)胞，液體閃爍計數(shù)器測定放射活性。百日咳毒素來自Sigma化學(xué)公司(St.Louis,MO)，使用時配制于包含0.01％BSA的0.9％NaCl溶液中。Groα來自Peprotech，同上述百日咳毒素同樣的配制方式使用。
圖3B顯示的結(jié)果代表六個不同的實驗(GM-CSF，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。
本文描述了本發(fā)明及其相關(guān)的具體實施例，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明能夠進一步修改，本申請力求覆蓋源于本發(fā)明原則的任何改變、應(yīng)用或調(diào)整，本發(fā)明包括那些與本公開文本不同處在于來自本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知或慣用技術(shù)，和在于應(yīng)用上文闡述的實質(zhì)特征，和在本發(fā)明附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)的。
權(quán)利要求
1．白細(xì)胞介素-8藥物在治療人或動物病毒感染中的應(yīng)用。
2．按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的藥物是白細(xì)胞介素-8蛋白或其有白細(xì)胞介素-8生物活性的類似物。
3．按照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所說的病毒感染是DNA病毒或RNA病毒的。
4．按照權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所說的病毒感染是選自細(xì)小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科和嗜肝DNA病毒科的DNA病毒的。
5．按照權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所說的病毒感染是選自逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠狀病毒科、呼腸孤病毒科、致腫瘤RNA病毒科、和線狀病毒科的RNA病毒的。
6．按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的藥物是77個氨基酸的白細(xì)胞介素-8蛋白。
7．按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的藥物是72個氨基酸的白細(xì)胞介素-8蛋白。
8．按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所說的病毒感染是選自EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7和HHV-8的皰疹病毒科病毒的。
9．按照權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所說的病毒感染來自披膜病毒科的牛腹瀉病毒。
10．按照權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所說的病毒感染來自小RNA病毒科的豬腸道病毒。
11．按照權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所說的病毒感染來自副粘病毒科的牛呼吸道合胞病毒。
12．按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的藥物與選自干擾素-α、-β、-γ、腫瘤致死因子-α、更昔洛韋、阿昔洛韋、阿糖腺苷、碘苷、泛西洛韋、前列腺素和前列腺素類似物的抗病毒藥聯(lián)合給藥。
13．按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的人或動物是免疫抑制的人或動物，或者用已知的增加病毒感染發(fā)生率的藥物處理的人或動物。
14．按照權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所說的藥物選自硫唑嘌呤、皮質(zhì)類固醇、阿霉素和甲氨喋呤。
15．白細(xì)胞介素-8藥物在致腫瘤病毒引起的人或動物癌癥治療中的應(yīng)用。
16．按照權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所說的藥物與選自阿霉素、環(huán)磷酰胺和甲氨喋呤的抗癌藥物聯(lián)合使用。
17．一種抗病毒藥物制劑，包括藥理可接受的治療有效量的白細(xì)胞介素-8藥物，以及藥物可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素－8(IL－8)藥物在人和動物病毒引起的病毒感染和致腫瘤病毒引起的癌癥治療中的應(yīng)用。IL－8藥物可以是IL－8蛋白也可以是其有IL－8生物活性的類似物。病毒感染可以是選自細(xì)小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科和嗜肝DNA病毒科的DNA病毒,也可以是選自除HIV－1和HIV－2之外的逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠狀病毒科、呼腸孤病毒科、致腫瘤RNA病毒科、和線狀病毒科的RNA病毒。
文檔編號A61K38/20GK1225016SQ97196176
公開日1999年8月4日 申請日期1997年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月4日
發(fā)明者瓊·戈斯林, 皮埃爾·博吉特, 巴薩姆·達馬吉 申請人:維羅塞爾公司