專利名稱：離子交聯(lián)聚磷腈微球的凝聚制備法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚磷腈(polyphosphazene)微球的制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及通過凝聚聚磷腈來制備聚磷腈微球。
水溶性聚合物和高分子水凝膠(例如聚磷腈水凝膠)通常可以用于微囊包封抗原以將抗原釋放到粘膜表面并控制抗原在粘膜表面的釋放，或者用于注射。這種包封的抗原也可以通過口服或鼻內(nèi)給藥。
聚磷腈微球可以用作多種預(yù)防劑和/或治療劑的藥物載體。例如，聚磷腈微球可以充當(dāng)免疫佐劑，任意品種的抗原都可以包含在這樣的微球內(nèi)，所述抗原可以來自細(xì)胞、細(xì)菌、病毒顆粒或其一部分，而抗原可以是蛋白、肽類、多糖、糖蛋白、糖脂核酸或其組合物，這些抗原在例如哺乳動(dòng)物、鳥類或魚類的動(dòng)物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答。
通常，包囊內(nèi)抗原可以與聚磷腈溶液混合，形成聚磷腈和抗原的微粒，聚磷腈通過離子交聯(lián)或共價(jià)交聯(lián)而成為可生物降解的穩(wěn)定微粒。微粒附著在粘膜表面，例如胃腸道粘膜內(nèi)層，從而提高網(wǎng)狀內(nèi)皮組織對(duì)抗原的攝取，這樣抗原被超時(shí)釋放。聚磷腈可以與多離子或二價(jià)陽離子(例如氯化鈣)進(jìn)行離子交聯(lián)。
含有聚電解質(zhì)水凝膠微球的合成型聚合物微球的制備方法業(yè)已公開；但是，這些方法需要使用有機(jī)溶劑及表面活性劑。Bohm等人在其已授權(quán)的美國專利4,948,586中描述了此類方法的例子。
利用天然聚電解質(zhì)(例如明膠)及某些合成的聚電解質(zhì)并通過簡單凝聚過程可以在水溶液中制備水凝膠的微球或毫微球。凝聚層的形成是由高濃度的鹽及升高的溫度引發(fā)的。但是，由上述方法制備微球需使用液體或固體形式的水不溶性“芯”材，例如油、石蠟或水不溶性藥物。(Deasy等人，微囊包封及相關(guān)藥物的制備過程，Marcel Dekker,Inc.,紐約，61-95頁(1984)；Lapka等人的已授權(quán)的美國專利4,622,244)。富含聚合物的凝聚滴沉積在分散的水不溶性芯材表面并隨后融合成包衣，通常這種包衣再以化學(xué)方式交聯(lián)。
Cohen等人在其已授權(quán)的美國專利5,149,543中教導(dǎo)，將聚磷腈水溶液噴涂在含有多價(jià)陽離子的溶液中可制備離子交聯(lián)的聚磷腈水凝膠微球。此后改進(jìn)該方法以生產(chǎn)出大小在微米范圍內(nèi)的微球。(Payne，等人，粘膜免疫學(xué)進(jìn)展，Mestecky等人編輯，Plenum Press，紐約，1475-1480頁(1995))。但是，該方法需要復(fù)雜的噴涂設(shè)備并難于控制微球大小的分布，尤其無法獲得較高的產(chǎn)率以及微米級(jí)大小的微球的窄范圍分布。
Cohen等人的專利還教導(dǎo)說，離子交聯(lián)的聚磷腈水凝膠微球在一價(jià)離子存在時(shí)不穩(wěn)定，并且用pH7.5的過量氯化鉀水溶液處理時(shí)將導(dǎo)致離子交聯(lián)解離。在磷酸緩沖的鹽水中還可以觀察到微球崩解(Bano等人，生物技術(shù)，9卷，468-471頁(1991))。Allcock等人在美國專利5,053,451中還描述了KCl存在下的離子交聯(lián)解離。Axelos等人在大分子，27卷，22期，6594-6602頁(1995)中證明一價(jià)鹽(例如氯化鈉)通過聚電解質(zhì)和二價(jià)金屬的離子交聯(lián)來溶解或沉淀形成的水凝膠。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種制備離子交聯(lián)聚磷腈水凝膠微球的方法，該方法能控制微球大小分布而無需采用升高的溫度、有機(jī)溶劑、水不溶性芯材或復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備。在這種方法中，用一價(jià)離子的鹽使含聚磷腈溶液發(fā)生水凝聚作用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種微囊包封生物材料的方法，該方法是將生物材料在制備微球前與聚磷腈溶液混合，或?qū)⑸锊牧吓c制成的聚磷腈微球混合。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種生產(chǎn)聚磷腈微球的方法，在該方法中，將含聚磷腈溶液進(jìn)行凝聚。
此處所用術(shù)語“凝聚”是指大分子溶液成為兩個(gè)不互混液相的分離作用。其中一相是富積有大分子物的稠密凝聚相，而另一相是聚合物缺乏相。凝聚作用是聚合物分子脫水的結(jié)果并且可由溫度變化、非溶劑的加入或小分子鹽的添加(簡單凝聚)引起，或可由加入另一聚合物從而形成共聚體復(fù)合物(復(fù)合物凝聚作用)來誘導(dǎo)。
凝聚物可被描述成為液體結(jié)晶和臺(tái)面晶相(mesaphase)，凝聚物比其它具有高度結(jié)構(gòu)順序的體系(例如膠束)更易于流動(dòng)。這些體系處于動(dòng)力學(xué)平衡之中并且因條件變化而導(dǎo)致一相系統(tǒng)的再生成絮凝物或沉淀物的形成。(Burgess，化學(xué)和生物中的大分子復(fù)合物，Dubin等人編輯，Springer-Verlag，Berlin，第285-300頁(1994))。
利用凝聚作用制備微球的方法的優(yōu)越性在于可避免使用有機(jī)溶劑、加熱、復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備(例如噴涂設(shè)備)以及消除了氣溶膠的生成。與噴涂技術(shù)相比，這種方法重現(xiàn)性高并且所生成的微球具有改善的和窄的微球大小分布。和噴涂法所得微球相反的是，凝聚微球不含大量的大顆粒聚集體或無定形沉淀物。這種結(jié)果對(duì)制備疫苗的釋放微球而言極其重要，這是因?yàn)镸-細(xì)胞對(duì)這些微球的攝取僅限于那些直徑等于或小于10μm的顆粒(Payne等人，1995)。凝聚法的另一優(yōu)越性在于通過簡單改變組分濃度就能夠有效控制微球的大小。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過將含有聚磷腈聚電解質(zhì)的溶液和含一價(jià)離子鹽的溶液混合從而形成凝聚滴來制備聚磷腈微球。此后將分散體和含有多價(jià)離子鹽的溶液混合，從而使微球穩(wěn)定化。若需要，此后可從分散體內(nèi)回收聚磷腈微球。
聚磷腈是具有主鏈的聚合物，其主鏈由交替的磷和氮通過交替的單鍵及雙鍵分開地組成。各個(gè)磷原子以共價(jià)鍵和兩個(gè)側(cè)基(“R”)相連。聚磷腈中的重復(fù)單元具有下列通式
其中n為整數(shù)。
取代基(“R”)可以是可在聚合物范圍內(nèi)改變的任何各種各樣的取代部分，這些取代基包括但不限于脂肪族基團(tuán)、芳香基、芳烷基、烷芳基、羧酸、雜芳基、糖類(包括葡萄糖)、雜烷基、鹵素、(脂族基)氨基(包括烷基氨基-)、雜芳烷基、二(脂肪族)氨基-(包括二烷基氨基-)、芳香基氨基-、二芳香基氨基-、烷芳基氨基-、-氧芳基(包括但不限于-氧苯基CO2H、-氧苯基SO3H、-氧苯基羥基和-氧苯基PO3H)、-氧脂族基團(tuán)(包括-氧烷基、-氧(脂肪族基)CO2H、-氧(脂肪族基)SO3H、-氧(脂肪族基)PO3H和-氧(脂肪族基)羥基(包括-氧(烷基)羥基))、-氧烷芳基、-氧芳烷基、-硫芳基、-硫脂肪族基團(tuán)(包括-硫烷基、-硫烷芳基、-硫芳烷基)、-NHC(O)O-(芳基或脂族基)、-O-[(CH2)xO]y-(CH2)-O-[(CH2)xO]y(CH2)xNH(CH2)xSO3H以及-O-[(CH2)xO]y-(芳基或脂族基)，其中x為1-8并且y為1-20的整數(shù)。這些基團(tuán)可通過，例如，氧、硫、氮或碳原子與磷原子鍵合。
通常，當(dāng)聚磷腈具有不止一種類型的側(cè)基時(shí)，這些基團(tuán)將在整個(gè)聚合物中隨機(jī)改變并且聚磷腈因此而成為無規(guī)共聚物。磷可以和兩個(gè)相同的或不同的基團(tuán)鍵合。帶有兩種或多種類型側(cè)基的聚磷腈可通過聚(二氯磷腈)和一種或多種所需的親核試劑按預(yù)定比例反應(yīng)而制成。聚磷腈中側(cè)基的比例將取決于多種因素，這些因素包括生產(chǎn)聚合物所用起始材料的配比、進(jìn)行親核取代反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)溫度以及所用的溶劑體系。雖然確定聚合物產(chǎn)物中側(cè)基的準(zhǔn)確取代方式是極其困難的，但決定聚合物中側(cè)基的比例對(duì)于該領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是容易的。
磷腈聚電解質(zhì)在此定義為聚磷腈，該聚磷腈含有已電離的或可電離的可賦予聚磷腈陰離子、陽離子或兩親性的側(cè)基。離子基團(tuán)可以是鹽形式或是相應(yīng)的酸或堿，所述酸或堿是或至少部分是解離的。任何可藥用一價(jià)陽離子都可以用作鹽的抗衡離子，其中包括但不限于鈉、鉀和銨。磷腈聚電解質(zhì)還可以含有非離子側(cè)基。磷腈聚電解質(zhì)在使用狀態(tài)下是可生物降解或非生物降解的。電離的或可電離的側(cè)基在使用狀態(tài)下優(yōu)選不易受到水解的影響。
優(yōu)選的磷腈聚電解質(zhì)是聚陰離子并且含有包括羧酸、磺酸、羥基或磷酸鹽部分在內(nèi)的側(cè)基。雖然酸性基團(tuán)通常位于非水解側(cè)基上，但它們還可以位于水解側(cè)基上或兩者情況都存在。以羧酸基團(tuán)作為側(cè)鏈的磷腈聚電解質(zhì)實(shí)例如下式所示
其中n是整數(shù)，優(yōu)選10-300,000，更優(yōu)選1,000-300,000之間的整數(shù)。該聚合物的化學(xué)名稱是聚[二(甲羧基苯氧基)磷腈]或聚[雙(甲羧基苯氧基)磷腈](PCPP)。
磷腈聚電解質(zhì)優(yōu)選是可生物降解的，以防止聚合物分子在體內(nèi)遠(yuǎn)處〔例如脾)發(fā)生最終的沉積或蓄積。此處所用術(shù)語“可生物降解”是指一旦聚合物暴露在溫度約25-37℃pH6-8的生理溶液下時(shí)可以在一定時(shí)期內(nèi)發(fā)生降解，該時(shí)期是其預(yù)期應(yīng)用所能接受的，通常少于約5年，最優(yōu)選少于約1年。
聚磷腈包括磷腈聚電解質(zhì)可以通過聚(二氯磷腈)與各種各樣的化學(xué)試劑或它們的混合物、按照本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員的已知方法進(jìn)行大分子親核取代反應(yīng)來制備。磷腈聚電解質(zhì)優(yōu)選通過聚(二氯磷腈)與適當(dāng)?shù)囊环N或數(shù)種親核試劑的置換出氯的反應(yīng)來制成?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)和聚(二氯磷腈)反應(yīng)的相應(yīng)親核試劑的量和按需要調(diào)節(jié)反應(yīng)條件來獲得聚合物中水解側(cè)鏈相對(duì)于非水解側(cè)鏈的所需比例。優(yōu)選的聚磷腈具有超過1,000，優(yōu)選約500,000-約1,500,000的分子量。
聚磷腈可存在于一種適當(dāng)?shù)娜芤褐?，例如，磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)、無機(jī)或有機(jī)緩沖液、生物材料(例如蛋白、抗原)的水溶液或它們的混合液。聚磷腈可以以任意的濃度、pH及離子強(qiáng)度存在于溶液中，優(yōu)選的濃度約0.01％-約1.5％并且pH為7-8。
聚磷腈溶液與至少含有一種一價(jià)離子鹽的溶液混合，所述一價(jià)離子的鹽例如是第Ⅰ主族元素的鹽，如鈉鹽或鋰鹽。其它可以采用的一價(jià)鹽包括但不限于是銨鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，一價(jià)離子的鹽為第Ⅰ主族元素的鹽。優(yōu)選第Ⅰ主族元素的鹽是鈉鹽，如氯化鈉，硫酸鈉，或磷酸鈉，優(yōu)選的鈉鹽是氯化鈉或NaCl。一價(jià)離子的鹽在溶液中可以以任意濃度和pH存在，優(yōu)選濃度為約0.1％-約40％并且pH為7-8。
將聚磷腈溶液與含有一價(jià)離子鹽的溶液的所得混合物靜置一段時(shí)間，使其充分形成凝聚相；即，在混合物中形成聚磷腈的凝聚微滴?；旌衔镏猩纱罅课⒌魏?，將該混合物加入到至少含有一種多價(jià)離子(例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳或鎘)鹽的溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)離子的鹽是鈣鹽，例如氯化鈣、溴化鈣或醋酸鈣。優(yōu)選的鈣鹽是氯化鈣或CaCl2。多價(jià)離子的鹽在溶液中可以以任意濃度及pH存在，優(yōu)選濃度約1％-約25％并且pH為7-8。溶液中的Ca2+離子充當(dāng)交聯(lián)劑(cross-linker)，當(dāng)微球與含鈣鹽溶液接觸時(shí)便使之穩(wěn)定。
聚磷腈微球存在于含一價(jià)離子鹽及多價(jià)離子鹽的溶液內(nèi)，將這種聚磷腈微球的懸浮液攪拌一段時(shí)間以充分形成穩(wěn)定微球的懸浮液，若需要，隨后可以從上述懸浮液中回收微球，回收的方式是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如通過離心法。
在另一實(shí)施方案中，通過制備聚磷腈與另一種水溶性聚合物的水溶性共聚體復(fù)合物來制成微球，所述水溶性聚合物通過靜電的、氫或疏水反應(yīng)可形成水溶性共聚體復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該聚合物是聚(環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷)。共聚體復(fù)合物可以在任何不引起沉淀作用的分子比例、任意的pH、任意的離子強(qiáng)度及任意的溫度下形成，優(yōu)選在pH7-8和室溫下形成。隨后加入含一價(jià)離子鹽(例如上文所述的)的溶液以有效引發(fā)凝聚作用而生成共聚體復(fù)合物的凝聚滴。此后，將含有微球的分散液加入到含多價(jià)離子(如上所述)鹽的溶液中以穩(wěn)定微滴。
通過凝聚制備聚磷腈微球能夠回收到較高收率的聚磷腈微球，這種微球具有微米級(jí)的顆粒大小(以體積計(jì)高達(dá)90％的微分百分比和以數(shù)量計(jì)高達(dá)95％的微分百分率)，并且如果需要生產(chǎn)其它尺寸的微球也無需使用加工設(shè)備。
如上所述，的通過凝聚作用形成的微球可以用作各種預(yù)防劑或治療性劑的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些微球可以用作生物材料(例如抗原)的載體，該抗原能夠在動(dòng)物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答?？乖蓙碜约?xì)胞、細(xì)菌、病毒顆?；蛩鼈兊囊徊糠?。在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的抗原可以是蛋白質(zhì)、肽類、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或它們的組合物，所述動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物、鳥類及魚類。所述免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答。最終，免疫應(yīng)答所針對(duì)的材料是缺乏抗原性的，利用標(biāo)準(zhǔn)的共價(jià)結(jié)合技術(shù)(例如用一種市售的試劑盒)可將這種材料結(jié)合到載體(例如白蛋白)或半抗原上。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用微球釋放核酸序列，該核酸序列將抗原編碼到粘膜表面并且在表面上表達(dá)核酸。
包含在聚磷腈微球內(nèi)的特定抗原實(shí)例包括但不限于病毒蛋白，例如流感蛋白、人免疫缺損病毒(HIV)蛋白、皰疹病毒蛋白以及甲型和乙型肝炎的蛋白；和來自輪狀病毒、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和脊髓灰質(zhì)炎的抗原；細(xì)菌蛋白和脂多糖，例如革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁；和來自生物體的抗原，例如來自流感嗜血桿菌、破傷風(fēng)桿菌、白喉?xiàng)U菌和淋病雙球菌的。
通常，抗原在凝聚前就與聚合物溶液混合，這樣可以保證抗原均勻分散在微球內(nèi)。
含有抗原的微球可作為疫苗以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法給藥來引起免疫應(yīng)答，給藥方式包括腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)等)、口服、舌下或經(jīng)粘膜給藥。疫苗優(yōu)選經(jīng)粘膜方式給藥。粘膜表面途徑釋藥的非限定例子是鼻內(nèi)(或，通常是與淋巴組織有關(guān)的鼻部)、呼吸道、陰道或直腸。
劑量取決于抗原的載量，并且用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以確定出劑量以及各種抗原的給藥時(shí)間表，而上述這些都基于微球抗原給藥所誘發(fā)的抗體的效價(jià)。
現(xiàn)描述本發(fā)明的附圖

圖1是通過將PCPP溶液及氯化鈉溶液混合制成的凝聚體系的相圖，其中，以氯化鈉濃度相對(duì)于聚合物濃度作圖。
圖2是制備聚磷腈微球的路線3是凝聚法與噴涂法制備的微球直徑以體積和數(shù)量計(jì)的微分百分率圖。
圖4是由凝聚法制得的離子交聯(lián)PCPP微球的電子顯微照片；圖5是在不同濃度的氯化鈉中，凝聚滴形成期間離子交聯(lián)PCPP微球的顆粒平均直徑圖；圖6是由不同濃度氯化鈣制備的離子交聯(lián)PCPP微球以體積和數(shù)量計(jì)的微分百分率圖；和圖7是以不同濃度PCPP制得的離子交聯(lián)PCPP微球以體積和數(shù)量計(jì)的微球微分百分率圖。
現(xiàn)描述本發(fā)明的下列實(shí)施例，但這些實(shí)施例不打算對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。實(shí)施例1聚磷腈凝聚滴的制備用PCPP和氯化鈉來驗(yàn)證聚磷腈水溶液形成凝聚體系的能力。將PCPP(分子量為106g/mol)溶解在等當(dāng)量的0.25％氫氧化鈉溶液中，此后用去離子水稀釋成濃度為0.01-1.11％(pH7.4)的溶液。同時(shí)還制備濃度為2-30％的氯化鈉水溶液。隨后將聚合物與氯化鈉溶液按照0.4ml∶0.74ml的比例混合并振搖攪動(dòng)。用顯微鏡觀測該溶液或分散體內(nèi)是否有凝聚滴或沉淀物存在。以氯化鈉在混合物中的濃度相對(duì)于聚合物濃度繪制出相圖(圖1)。該相圖包含三個(gè)主要區(qū)域-凝聚物、沉淀物和均勻溶液。實(shí)施例2離子交聯(lián)聚磷腈微球的制備離子交聯(lián)PCPP微球的制備是通過首先使聚磷腈水溶液與氯化鈉水溶液發(fā)生凝聚，隨后用氯化鈣水溶液處理上述混合物，如附圖2所示。將4ml PPCP(分子量-1.1×106g/mol)在PBS中的0.2％溶液與7.4ml6.2％的氯化鈉水溶液混合、振搖并在室溫下放置6分鐘或直至形成平均大小約為4-6μm的凝聚滴。隨后將所得凝聚分散體傾入800ml 8.8％的氯化鈣水溶液中。用磁攪拌器攪拌該懸浮液20分鐘，隨后離心(300rpm,10min)分離出微球。用去離子水洗滌微球，以和上面相同的條件離心收集微球并儲(chǔ)存在常溫下。在光學(xué)顯微鏡下檢測到所得微球?yàn)榍蛐尾]有檢測出無定形沉淀物。用Coulter LS 100粒度器來分析以數(shù)量和重量計(jì)的顆粒大小分布，結(jié)果表明顆粒大小分布在小范圍內(nèi)。10μm以下的微球百分?jǐn)?shù)為90％(以體積計(jì))和99.7％(以數(shù)量計(jì))(圖3)。電子顯微鏡照片還揭示了干燥微球均勻的顆粒大小分布并且微球?yàn)榍蛐涡螤?圖4)。
在參比試驗(yàn)中，在每平方英寸滅菌空氣30磅的條件下，將PCPP在PBS中的2.5％溶液泵到超聲噴嘴內(nèi)(Medsonic,Inc.,Farmingdale,NY)，形成的微滴噴霧與7.5％氯化鈣溶液發(fā)生撞擊，通過鈣微滴發(fā)生交聯(lián)從而生成微球。微球在氯化鈣溶液中保溫放置30分鐘，離心(2600rpm,15min)收集，去離子水洗滌并在同樣的條件下離心收集。顯微觀測揭示出球形微球連同一些不規(guī)則球狀無定形聚合物聚集體并存。通過用Coulter LS粒度器來分析微球分散體證實(shí)了上述結(jié)果。大小在1-10μm間的微球在以數(shù)量計(jì)時(shí)其微分百分率相對(duì)較高(75％)，當(dāng)同樣大小的微球在以體積計(jì)時(shí)的該百分率較低(10％)，這說明大顆粒的存在(圖3)。這些顆粒在光學(xué)顯微鏡條件下檢測時(shí)可肉眼觀測到它們是無定形的沉淀物。改變參數(shù)，例如PCPP的濃度和空氣壓力，通?？梢詫?dǎo)致更大量無定形聚集體的形成，但在微球大小方面沒有顯著變化。
因此，用凝聚法制備微球的結(jié)果是生成大小分布集中的微球并且沒有無定形聚集體形成。原有的研究表明M-細(xì)胞對(duì)顆粒材料的攝取僅限于那些直徑等于或小于10μm的顆粒(Payne等人，1995)，這使得微球大小的分布成為制備有效疫苗釋放載體的關(guān)鍵。因此，將大小在10μm以下的微球百分率從噴淋法的10％提高到凝聚法的90％是材料上的極大改進(jìn)，事實(shí)上可以將這樣的微球釋放到靶細(xì)胞上。實(shí)施例3不同大小的離子交聯(lián)聚磷腈微球的制備研究氯化鈉濃度以及氯化鈉與保溫放置時(shí)間對(duì)離子交聯(lián)PCPP微球大小的影響。制備一系列的0.2％PCPP(分子量-1.1×106g/mol)溶液并用6.2％的氯化鈉水溶液按照0.4ml∶0.74ml的比例凝聚。用400ml 8.8％氯化鈣交聯(lián)聚合物微滴而在不同的時(shí)間點(diǎn)終止凝聚過程，分離出微球并用實(shí)施例2中的粒度器進(jìn)行分析。隨后將所得微球的平均直徑相對(duì)于在氯化鈉中的保溫放置時(shí)間繪圖(圖5)。在不同濃度氯化鈉(4％,5.5％，和7％)下獲得的動(dòng)力學(xué)曲線也在圖5中表示。在這些條件下用顯微觀察未見無定形沉淀物的形成。結(jié)果表明，改變氯化鈉濃度及保溫放置時(shí)間可以有效控制微球的大小。實(shí)施例4氯化鈣濃度的影響氯化鈣濃度對(duì)微球大小分布的影響是采用與實(shí)施例3中同樣的凝聚制備條件、但僅采用一種濃度為6.2％的氯化鈉溶液來研究的。通過與400ml不同濃度(1％、9％和15％)的氯化鈣溶液混合6分鐘來使凝聚體系交聯(lián)。分離出微球并按照實(shí)施例3所述方法對(duì)微球的顆粒分布進(jìn)行分析。結(jié)果表明(圖6)很寬濃度范圍內(nèi)的氯化鈣都可以用來制備微球而不對(duì)微球大小產(chǎn)生影響。實(shí)施例5聚合物濃度的影響制備濃度為0.07％、0.2％和1％的PCPP溶液，隨后按照與實(shí)施例3相同的方法制備并分析微球(氯化鈉濃度為6.2％)。如圖7所示，提高聚合物的濃度僅對(duì)微球直徑造成很小的增加。實(shí)施例6含有流感抗原的離子交聯(lián)聚磷腈微球的制備含流感抗原的PCPP微球的制備是通過將聚磷腈-流感抗原的水溶液與氯化鈉水溶液凝聚，并隨后用氯化鈣水溶液處理所得的混合物，如圖2所示。將64mlPCPP(分子量-1.1×106g/mol)在PBS中的0.2％溶液與0.25ml流感病毒抗原的PBS溶液(2mg/ml)混合，隨后加入118ml6.2％的氯化鈉水溶液，振搖并在室溫下放置6分鐘或直至形成平均大小約為4-6μm的凝聚滴。將所得凝聚分散體傾入10升8.8％的氯化鈣水溶液中。用磁攪拌器攪拌該懸浮液20分鐘，隨后離心(300rpm,10min)分離出微球。用去離子水洗滌微球并離心收集。大小在10μm以下的微球的百分率是75(以體積計(jì))和99(以數(shù)量計(jì))。通過將微球在沸水中加熱5分鐘并隨后用凝膠電泳來測定釋放出的變性蛋白量，從而測出包囊抗原的有效性。包封的有效率為94％。實(shí)施例7FITC-BSA的包封將5ml 0.2％PCPP(Mw=1.1×106mol/g)的PBS溶液(pH=7.4)與1ml0.5％的FITC-BSA(異硫氰酸熒光素-牛血清白蛋白)水溶液混合。向該溶液中滴加9.25ml 6.2％的氯化鈉溶液并將混合物振搖。保溫放置20分鐘后或可觀察到大量微球后，將凝聚物緩慢傾入1L 8.8％的氯化鈣中并攪拌10分鐘。按照實(shí)施例3中所述的方法分離出形成的微球。所得微球?yàn)榘岛谏那蛐晤w粒并且在熒光顯微鏡下可檢測出熒光。顆粒大小的分析表明以數(shù)量計(jì)時(shí)90％的顆粒小于14.5μm，同時(shí)以體積計(jì)時(shí)50％的顆粒小于9.3μm。實(shí)施例8離子交聯(lián)聚磷腈微球的凍干微球采用凝聚法來制備并按實(shí)施例2所述方法分離。隨后將微球懸浮液冷凍干燥32小時(shí)并將凍干物再分散在去離子水。顆粒大小的分析表明微球的大小分布并未出現(xiàn)明顯改變。實(shí)施例9用氯化鋰制備微球?qū)?.8ml 0.2％PCPP的PBS溶液與1.48ml 40％的氯化鋰水溶液混合、振搖并在室溫下放置5分鐘或直至平均大小約為4-6μm凝聚滴形成。隨后將所得凝聚分散體傾入400ml的8.8％氯化鈣水溶液中。分離出微球并按照實(shí)施例3所述方法分析微球的大小分布。顆粒大小分析表明以數(shù)量計(jì)時(shí)90％的顆粒小于6.6μm，同時(shí)以體積計(jì)時(shí)75％的顆粒小于12.4μm。實(shí)施例10用PCPP-聚(環(huán)氧乙烷-還氧丙烷)共聚體復(fù)合物制備微球水溶性共聚體復(fù)合物的制備是通過將0.25ml 0.5％PCPP的水溶液與0.019ml 10％的聚(環(huán)氧乙烷-還氧丙烷)(摩爾比為3∶1，分子量13,300g/mol)水溶液進(jìn)行混合。隨后將所得溶液加入到0.1ml 10％的氯化鈉水溶液中并用15％的氯化鈣水溶液進(jìn)行交聯(lián)。按實(shí)施例3所述方法分離出微球，經(jīng)光學(xué)顯微鏡檢測為球形。
所有在本說明書中作為參考的專利、公開出版物(包括公開的專利申請(qǐng))、數(shù)據(jù)登記號(hào)以及保藏登記號(hào)的描述都在此引入它們的全部內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)，參見的程度與這些專利、出版物、數(shù)據(jù)登記號(hào)及保藏登記號(hào)分別引入作為參考時(shí)的程度相同。
但是，應(yīng)理解的是本發(fā)明的范圍不僅僅局限于上述具體的實(shí)施方案。實(shí)際上本發(fā)明還包括除上述具體內(nèi)容以外的內(nèi)容并且仍在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種制備離子交聯(lián)聚磷腈微球的方法，該方法包括(a)將含有水溶性聚磷腈聚電解質(zhì)的水溶液與含有一價(jià)離子的鹽的溶液混合，形成含有聚磷腈凝聚微滴的分散體；(b)將上述分散體與含有多價(jià)離子的鹽的溶液混合，從而形成聚磷腈微球的懸浮液。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括(c)將上述離子交聯(lián)聚磷腈微球從所述懸浮液中回收。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述一價(jià)離子的鹽是第Ⅰ主族元素的鹽。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述第Ⅰ主族元素為鈉。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述一價(jià)離子的鹽為氯化鈉。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述多價(jià)離子的鹽為鈣鹽。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述多價(jià)離子的鹽為氯化鈣。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的聚磷腈聚電解質(zhì)為聚〔二(甲羧基苯氧基)磷腈〕。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微球的直徑在約1-10μm范圍內(nèi)。
10．一種制備離子交聯(lián)聚磷腈微球的方法，該方法包括(a)將含有水溶性聚磷腈聚電解質(zhì)的水溶液與含有水溶性聚合物的溶液混合，以形成所述聚磷腈聚電解質(zhì)及所述水溶性聚合物的水溶性共聚體復(fù)合物；(b)將上述共聚體復(fù)合物與含有多價(jià)離子的鹽的溶液混合，生成含有聚磷腈的所述共聚體復(fù)合物凝聚微滴的分散體；(c)將上述分散體與含有多價(jià)離子鹽的溶液混合，生成所述共聚體復(fù)合物的微球懸浮液。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，該方法進(jìn)一步包括(d)將所述微球從所述懸浮液中回收。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述水溶性聚合物為聚(環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷)。
13．一種制備含有生物材料的離子交聯(lián)聚磷腈微球的方法，該方法包括(a)將含有水溶性聚磷腈聚電解質(zhì)和生物材料的水溶液與含有一價(jià)離子的鹽的溶液混合，形成含有凝聚微滴的分散體；(b)將上述分散體與含有多價(jià)離子的鹽的溶液混合，從而形成含有生物材料的離子交聯(lián)的聚磷腈微球懸浮液。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，該方法進(jìn)一步包括(c)從所述懸浮液中回收所述的微球。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述一價(jià)離子的鹽為第Ⅰ主族元素的鹽。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述第Ⅰ主族元素為鈉。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述一價(jià)離子的鹽為氯化鈉。
18．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述多價(jià)離子的鹽為鈣鹽。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述多價(jià)離子的鹽為氯化鈣。
20．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的聚磷腈聚電解質(zhì)為聚〔二(甲羧基苯氧基)磷腈〕。
21．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述微球的直徑在約1-10μm范圍內(nèi)。
22．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述生物材料選自蛋白質(zhì)、具有生物活性的合成化合物、核酸、多糖及抗原。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述生物材料為抗原。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述抗原來源于輪狀病毒、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、脊髓灰質(zhì)炎、甲型和乙型肝炎、皰疹病毒、人體免疫缺損病毒、流感嗜血桿菌、破傷風(fēng)桿菌、流感、白喉?xiàng)U菌及淋病雙球菌。
全文摘要
一種制備聚磷腈微球的方法,其中,聚磷腈微球是通過凝聚作用來制備的。在一個(gè)實(shí)施方案中,將含有聚磷腈的溶液與脫水試劑混合,所述脫水劑例如是含有一價(jià)離子的鹽的溶液,該一價(jià)離子的鹽例如是第Ⅰ主族元素的鹽(如氯化鈉),從而生成含有聚磷腈凝聚微滴的分散體。隨后將該分散體與含有多價(jià)離子的鹽的溶液混合,所述多價(jià)離子的鹽例如是第Ⅱ主族元素的鹽(如氯化鈣),生成聚磷腈微球的懸浮液。隨后將聚磷腈微球從懸浮液中回收。該方法能夠獲得高產(chǎn)量的微球并且可控制微球大小的分布。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1226927SQ97196090
公開日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1997年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月2日
發(fā)明者A·K·安德里爾諾夫, 陳建平 申請(qǐng)人:阿萬特免疫治療公司