專利名稱：新型七葉亭衍生物及醫(yī)藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型七葉亭(aesculetin)衍生物以及醫(yī)藥組合物，特別是涉及軟骨保護(hù)劑。
在關(guān)節(jié)癥中，有慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，風(fēng)濕熱或變形性關(guān)節(jié)病等。其中以慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病及變形性關(guān)節(jié)病的患者居多，被認(rèn)為是主要的關(guān)節(jié)病。在變形性關(guān)節(jié)病中，有先天性的或二次性的變形性關(guān)節(jié)病，和由于老化以致關(guān)節(jié)軟骨退化變性而引起的一次性變形性關(guān)節(jié)病。一次性的變形性關(guān)節(jié)病，近年來隨著老齡人口的增多而增加。
慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病和變形性關(guān)節(jié)病，其病因和病態(tài)有很大的差異。然而，它們的共通點(diǎn)是最終都會(huì)由于軟骨破壞而使關(guān)節(jié)功能受到損害。
針對(duì)風(fēng)濕性疾患、例如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、風(fēng)濕熱、全身性紅斑狼瘡或變形性關(guān)節(jié)病的第一選擇藥物是鎮(zhèn)痛消炎劑，例如阿斯匹靈或消炎痛(吲哚美辛)。作為慢性關(guān)節(jié)病的治療藥，還可使用金制劑(例如Shiozol)、免疫調(diào)節(jié)劑、甾類化合物試劑，或D-青霉胺等。
然而，以前的上述鎮(zhèn)痛消炎藥劑對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞沒有效果，在使用軟骨細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，相反還常有惡化的情況產(chǎn)生。而且，也沒有發(fā)現(xiàn)上述慢性關(guān)節(jié)病治療藥對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞有抑制作用。
另一方面，已知七葉亭和4-甲基七葉亭具有降低膽甾醇、補(bǔ)強(qiáng)血管以及抗氧化作用(特公昭42-16626號(hào)公報(bào))。還已知4-甲基七葉亭的碳原子數(shù)為6-25的羧酸二乙酯，特別是辛酸二乙酯、月桂酸二乙酯以及棕櫚酸二乙酯對(duì)治療皮膚病具有有效的消炎作用(FR2276819)。然面是卻不知道這些七葉亭和七葉亭衍生物對(duì)軟骨破壞具有抑制作用。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)了七葉亭化合物，即七葉亭及七葉亭衍生物可以大大地抑制構(gòu)成軟骨基質(zhì)的葡糖胺聚糖(以下稱為GAG)減少，作為抑制關(guān)節(jié)軟骨破壞的軟骨保護(hù)劑是有效的，并完成了本發(fā)明。而且，具有上述活性的七葉亭衍生物的一部分也是新型化合物。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種作為有效成分含有七葉亭化合物的醫(yī)藥組合物，特別是軟骨保護(hù)劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種新型的七葉亭衍生物。
本發(fā)明涉及含有通式(Ⅰ)所示化合物(以下稱為本化合物(Ⅰ))的醫(yī)藥組合物，特別是軟骨保護(hù)劑。

(式中，R1和R2各自獨(dú)立地為氫原子，碳原子數(shù)為2-25的飽和或不飽和脂肪族?；虮锦；琑3是氫原子或烷基。)本發(fā)明還涉及通式(Ⅱ)表示的化合物(以下稱為本化合物(Ⅱ))。
(式中，R11和R12各自獨(dú)立地是氫原子，三甲基乙?；?、辛?；⒃鹿瘐；?、棕櫚?；?、硬脂?；営王；?、二十二碳六烯?；虮郊柞；?，R13是氫原子或甲基。)作為新型化合物的本化合物(Ⅱ)，由于被包含在具有軟骨保護(hù)作用的本化合物(Ⅰ)中，因而有關(guān)本化合物(Ⅰ)的以下說明，在本文所述情況下，也適合于本化合物(Ⅱ)。
本化合物(Ⅰ)中，R1和R2的優(yōu)選例是氫原子、乙酰基、三甲基乙?；?、辛酰基、月桂?；?、棕櫚?；?、硬脂?；?、亞油酰基、二十二碳六烯酰基或苯甲?；?更優(yōu)選的例子是本化合物(Ⅱ)中的R11和R12為氫原子、三甲基乙?；?、辛?；?、月桂?；?、棕櫚酰基、硬脂?；?、亞油酰基、二十二碳六烯?；捅郊柞；?本化合物(Ⅰ)及(Ⅱ)中更優(yōu)選的例子是氫原子、三甲基乙?；⒂仓；氨锦；?。R3的優(yōu)選例子是氫原子和碳原子數(shù)為1-4的低級(jí)烷基，而更好的例子是本化合物(Ⅱ)中的R13是氫原子或甲基。
作為本化合物(Ⅰ)及(Ⅱ)，例如可例舉以下化合物。
七葉亭，4-甲基七葉亭，七葉亭6，7-雙(乙酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(乙酸酯)，七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)，七葉亭6-單(新戊酸酯)，4-甲基七葉亭6-單(新戊酸酯)，七葉亭7-單(新戊酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)，七葉亭6，7-雙(辛酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(辛酸酯)，七葉亭6，7-雙(月桂酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(月桂酸酯)，七葉亭6，7-雙(棕櫚酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(棕櫚酸酯)，七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)4-甲基七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)，七葉亭6，7-雙(亞油酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(亞油酸酯)，
七葉亭6，7-雙(二十二碳六烯酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(二十二碳六烯酸酯)，七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)，4-甲基七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)，上述例舉的化合物中，七葉亭6-單(新戊酸酯)、七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)、七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(二十二碳六烯酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(亞油酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)屬于本化合物(Ⅱ)，是新型化合物。
七葉亭和4-甲基七葉亭作為藥劑可從市場(chǎng)購(gòu)得。例如，七葉亭可從東京化成工業(yè)株式會(huì)社購(gòu)得，4-甲基七葉亭可從シグマヶミヵンパニ 購(gòu)得。
七葉亭或4-甲基七葉亭的各種羧酸單酯或二酯，可以通過下述方法使七葉亭或4-烷基七葉亭和各種羧酸進(jìn)行反應(yīng)而制得。
1)使用適當(dāng)?shù)娜軇?，在酸催化劑，例如鹽酸、硫酸或磷酸等無機(jī)酸或者乙酸或P-甲苯磺酸等有機(jī)酸存在下，使七葉亭或4-烷基七葉亭進(jìn)行反應(yīng)。
2)在縮合劑，例如二環(huán)己基碳化二亞胺、N，N′-羰基二(2-甲基咪唑)、二苯乙烯酮-N-環(huán)己基亞胺、烷氧基乙炔、聚磷酸乙酯、亞硫酰氯、或草酰氯等存在下，在有機(jī)溶劑例如二甲基甲酰胺、丙酮、二噁烷、乙腈、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃或吡啶等中，使七葉亭或4-烷基七葉亭與羧酸反應(yīng)。在普通冷卻或室溫下進(jìn)行。
3)在堿性化合物例如三乙胺、吡啶、4-(N，N-二甲氨基)吡啶或二乙基甲基胺等存在下，使酸酐和七葉亭或4-烷基七葉亭反應(yīng)。
4)在添加有例如三乙胺、吡啶、4-(N，N-二甲氨基)吡啶或二乙基甲基胺等堿性化合物的溶劑中或例如吡啶的堿性溶劑中，使鹵氧化物(鹵化酰氯化物、溴化物等)和七葉亭或4-烷基七葉亭進(jìn)行反應(yīng)。
按照上述原料的使用比例，可以獲得單酯或二酯。使用七葉亭或4-烷基七葉亭以及等摩爾量或小過剩量的羧酸、酸酐或鹵氧化物時(shí)可得到單酯;使用大過剩量、通常摩爾比在2以上時(shí)則可得到二酯。
后者的情況下，往往得到二酯和單酯的混合物。這種情況下，可通過色譜法等普通的分離法容易地得到二酯和單酯。
作為反應(yīng)產(chǎn)物的精制法，可以利用萃取，色譜法、重結(jié)晶或再沉淀法。精制品的結(jié)構(gòu)可通過紅外線吸收譜、紫外線吸收譜、核磁共振吸收譜、元素分析或質(zhì)譜等來確認(rèn)。
對(duì)本化合物(Ⅰ)進(jìn)行毒性調(diào)查。作為本化合物(Ⅰ)的代表例，以750mg/kg(體重)的量，對(duì)雄小鼠連續(xù)4天進(jìn)行腹腔內(nèi)投藥，沒有死亡例，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性。本化合物(Ⅰ)是極安全的化合物(參看后述實(shí)施例2)。
本化合物(Ⅰ)，作為藥效，對(duì)于培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞(家兔的肩、膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)來說，具有抑制軟骨破壞的作用(參看后述實(shí)施例3)。
因此，化合物(Ⅰ)作為軟骨保護(hù)劑用來治療伴隨有關(guān)節(jié)軟骨破壞的各種關(guān)節(jié)病是有效的。這種關(guān)節(jié)病的例子是慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、變形性關(guān)節(jié)病、肩周關(guān)節(jié)炎、頸肩腕癥候群、腰痛病等。
以本化合物(Ⅰ)作為有效成分的軟骨保護(hù)劑的制劑形態(tài)可以是普通形態(tài)。本化合物(Ⅰ)可以單獨(dú)使用，也可以將本化合物(Ⅰ)和制劑上允許使用的載體或稀釋劑的混合物作為制劑使用。制劑中有效成分的量為0.01-100重量%，優(yōu)選0.1-70重量%。
本發(fā)明的軟骨保護(hù)劑可以口服，或非口服形式投藥。
本發(fā)明的軟骨保護(hù)劑的投藥量根據(jù)對(duì)象(動(dòng)物或人)、年齡、個(gè)人差異或病情而不同，也有超出下述投藥量范圍的情況。然而，一般說來，以人作為對(duì)象時(shí)，本化合物(Ⅰ)的口服投藥量每1天為0.1-500mg/kg(體重)，優(yōu)選0.5-200mg/kg(體重)。通常，1日的投藥量分1次或2-4次投藥。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不限定本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中，TLC是薄層色譜法。
實(shí)施例(Ⅰ)或(Ⅱ)的合成(1)七葉亭6，7-雙(乙酸酯)的合成在茄型燒瓶(50ml)中，加入七葉亭(東京化成;890mg、5mmol)和4-(N，N-二甲氨基)吡啶(1.528g、12.5mmol)后，添加二氯甲烷(10ml)使其形成懸濁液。在該懸濁液中，于10℃緩慢滴加乙酰氯(和光純藥;918mg、12.5mmol)。反應(yīng)是放熱反應(yīng)。于10℃將反應(yīng)液攪拌2小時(shí)，生成了白色沉淀。添加二氯甲烷(25ml)，沉淀完全溶解。
確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，于反應(yīng)液中添加蒸餾水(40ml)，用二氯甲烷(20ml×2)萃取。將集合的有機(jī)層用蒸餾水(20ml×1)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾出溶劑，得到結(jié)晶性粗制產(chǎn)品(1.265g)。將粗制產(chǎn)品用乙醇重結(jié)晶，獲得無色針狀結(jié)晶的標(biāo)題化合物(1.03g，收率78.6)。
熔點(diǎn)133-133.5℃TLCRf0.33(正己烷/乙酸乙酯1∶1)1H-NMR(CDCl3，δppm)2.32(s，3H，Ac)、2.33(s，3H，Ac)、6.43(d，1H，J＝9.62Hz，C3-H)、7.22(s，1H)、7.35(s，1H)、7.64(d，1H，J＝9.62Hz，C4-H)IR(KBr，νmax)1778s、1738s、1636m、1570m、1510m、1436m、1378m、1218s、1128s(2)4-甲基七葉亭6，7-雙(乙酸酯)的合成以4-甲基七葉亭(シグマ社制)作為原料，按與上述實(shí)施例1相同的方法合成標(biāo)題化合物。獲得黃色結(jié)晶的標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3，δppm)7.33(s，3H)、7.40(s，3H)、6.32(s，1H)、7.24(s，1H)、7.44(s，1H)(3)七葉亭6，7-雙(硬酯酸酯)的合成在茄型燒瓶(50ml)中，加入七葉亭(890mg、5mmol)和4-(N，N-二甲氨基)吡啶(1.528g、12.5mmol)后，添加二氯甲烷(20ml)使其形成懸濁液。在該懸濁液中，于10℃緩慢滴加硬脂酰氯(東京化成;3.787g，12.5mmol)。反應(yīng)液變成乳濁狀并固化。可是，當(dāng)再次添加二氯甲烷(20ml)，反應(yīng)液又變成了懸濁液。將該懸濁液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。
確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液注入冰水(20ml)中，用二氯甲烷(100ml×1)萃取。分離出的有機(jī)層用蒸餾水(20ml×1)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾出溶劑、獲得白色的精制產(chǎn)品(3.91g)。將粗制產(chǎn)品用二氯甲烷/正己烷重結(jié)晶，獲得白色粉末狀結(jié)晶的標(biāo)題化合物(2.773g、收率78.0%)。
熔點(diǎn)85-86℃1H-NMR(CDCl3，δppm)0.88(t，6H，CH3)、1.26(m，56H，CH2)、1.72(m，4H，CH2)、2.55(q，4H，CH2CO)、6.42(d，1H，C3-H)、7.21(s，1H，aromatic)、7.33(s，1H，aromatic)、7.63(d，1H，C4-H)(4)4-甲基七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)的合成以4-甲基七葉亭作為原料，按與上述實(shí)施例1(3)同樣的方法合成標(biāo)題化合物。獲得白色結(jié)晶的標(biāo)題化合物。
熔點(diǎn)121-122℃1H-NMR(CDCl3，δppm)0.85(t，6H，CH3)、1.24(m，56H，CH2)、1.48(m，2H，CH2)、1.64(m，2H，CH2)、2.18(m，2H，CH2)、2.34(s，3H，C4-CH3)、2.57(m，2H，CH2)、6.18(s，1H，C3-H)、6.84(s，1H，aromatic)、7.42(s，1H，aromatic)(5)4-甲基七葉亭6，7-雙(亞油酸酯)的合成用亞油酰氯(東京化成)代替硬脂酰氯，按與上述實(shí)施例1(4)同樣的方法合成標(biāo)題化合物、獲得黃色油狀之標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3，δppm)0.90(t，6H)、1.2～1.4(m，32H)、1.4～2.0(m，4H)、2.0～2.2(m，8H)、2.4(s，1H)、2.8(t，4H)、5.3～5.5(m，8H)、6.3(s，1H)、7.2(s，1H)、7.4(s，1H)(6)4-甲基七葉亭6，7-雙(二十二碳六烯酸酯)的合成用二十二碳六烯酰氯(東京化成;二十二碳-4，7，10，13，16，19-六烯酰氯)代替硬脂酰氯，按與上述實(shí)施例1(4)同樣的方法合成標(biāo)題化合物。獲得黃色油狀之標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3，δppm)0.95(t，6H)、2.10(m，4H)、2.2(s，3H)、2.4～2.7(m，8H)、2.7～3.0(m，12H)、5.3～5.7(m，24H)、6.3(s，1H)、7.2(s，1H)、7.4(s，1H)(7)七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)的合成在茄型燒瓶(50ml)中，加入七葉亭(890mg、5mmol)和4-(N，N-二甲氨基)吡啶(1.528g、12.5mmol)后，添加二氯甲烷(10ml)形成懸濁液。在該懸濁液中，于10℃緩慢滴加苯甲酰氯(東京化成;1.757g，12.5mmol)。馬上生成白色沉淀，將反應(yīng)液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液注入冰水(20ml)中，用二氯甲烷(20ml×3)萃取。將集中的有機(jī)層用蒸餾水(20ml×1)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾出溶劑，獲得結(jié)晶性粗制產(chǎn)品(2.136g)。將粗制產(chǎn)品用二氯甲烷/正己烷重結(jié)晶，獲得白色粉末狀結(jié)晶的標(biāo)題化合物(1.899g，收率98.4%)。
熔點(diǎn)183-184.5℃TLCRf0.69(正己烷/乙酸乙酯1∶1)1H-NMR(CDCl3，δppm)6.47(d，1H，J＝9.62Hz)、7.38(m，6H，aromatic)、7.44(s，1H)、7.56(s，1H)、7.71(d，1H，J＝9.62Hz)、8.04(m，4H，aromatic)、IR(KBr，νmax)1765s、1745s、1625w、1605w、1570w、1510m、1475m、1430m、1390m、1325w、1255s(8)4-甲基七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)的合成在茄型燒瓶(50ml)中，加入4-甲基七葉亭(960mg、5mmol)和4-(N，N-二甲氨基)吡啶(2.445g、20mmol)后，添加二氯甲烷(10ml)形成懸濁液。在該懸濁液中，于10℃緩慢滴加苯甲酰氯(2.811g，20mmol)。立即生成白色沉淀，將反應(yīng)液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液注入冰水(20ml)中，用二氯甲烷(20ml×3)萃取。將集中的有機(jī)層用蒸餾水(20ml×1)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾出溶劑，獲得結(jié)晶性的粗制產(chǎn)品(2.250g)將粗制產(chǎn)品用二氯甲烷/正己烷重結(jié)晶，獲得白色粉末狀結(jié)晶的標(biāo)題化合物(1.960g，收率98.0%)。
熔點(diǎn)146-152℃1H-NMR(CDCl3，δppm)2.41(d，3H，J＝2.0Hz)、6.34(d，1H，J＝2.0Hz)、7.33～7.64(m，8H)、8.00(d，2H，J＝2.6Hz)、8.09(d，2H，J＝2.3Hz)(9)七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)(Ⅰ)和七葉亭6-單(新戊酸酯)(Ⅱ)的合成在茄型燒瓶(50ml)中，加入七葉亭(200mg、1.12mmol)和吡啶(3ml)。在該混合物中于0℃添加新戊酰氯(283.6mg、2.35mmol)后，于室溫?cái)嚢?6小時(shí)。
用薄層色譜確認(rèn)原料消失并有二種產(chǎn)物(Rf＝0.8及0.23，二氯甲烷/甲醇＝9∶1)后，將反應(yīng)液注入冰水(10ml)中，用乙醚萃取。將集中的有機(jī)層用硫酸鈉干燥后，減壓濃縮，獲得粗制產(chǎn)品。
將粗制產(chǎn)品用硅膠柱色譜法分離精制。用二氯甲烷洗脫，獲得作為第1流出部分的標(biāo)題化合物(Ⅰ)(無色結(jié)晶，收率72%)和作為第2流出部分的標(biāo)題化合物(Ⅱ)(無色結(jié)晶、收率25%)。
標(biāo)題化合物(Ⅰ)熔點(diǎn)148-149℃1H-NMR(90MHz，CDCl3，δppm)1.35(s，18H)、6.40(d，1H，J＝10.3Hz)、7.15(s，1H)、7.29(s，1H)、7.64(d，1H，J＝10.3Hz)標(biāo)題化合物(Ⅱ)熔點(diǎn)159-162℃1H-NMR(90MHz，CDCl3，δppm)1.39(s，9H)、6.26(d，1H，J＝9.5Hz)、6.98(s，1H)、7.18(s，1H)、7.60(d，1H，J＝9.5Hz)實(shí)施例2利用小鼠連續(xù)4日腹腔內(nèi)投藥的毒性試驗(yàn)對(duì)6周齡的CrjCD-1(ICR)雄小鼠(一組5只)，1日1次連續(xù)4日腹腔內(nèi)投藥，該藥是將七葉亭或七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)懸浮在0.5%甲基纖維素水溶液中的懸濁液。投藥量規(guī)定為750mg/kg。任何一種化合物都沒有死亡例，也沒有發(fā)現(xiàn)應(yīng)特別提出的毒性。
對(duì)4-甲基七葉亭、七葉亭6，7-雙(乙酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(乙酸酯)、七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(亞油酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(二十二碳六烯酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)、七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)以及七葉亭6，7-單(新戊酸酯)也進(jìn)行了同樣的毒性試驗(yàn)，沒有發(fā)現(xiàn)死亡例。
實(shí)施例3培養(yǎng)軟骨細(xì)胞中的軟骨破壞抑制作用(a)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的配制從家兔(Nea Zealand White Rabbit)(體重1-1.5kg，從北山ラベス購(gòu)入)的肩、膝關(guān)節(jié)無菌地取出軟骨。將它用PBS(-)(Ca2+、Mg2+游離)、ハンクス、及0.1%EDTA-PBS(-)充分洗滌后，切成約1mm方塊。在其上添加含有0.1%EDTA的PBS(一)，在37℃的恒溫槽中處理30分鐘。再用胰蛋白酶(0.25%)溶液，于37℃處理1小時(shí)，去除粘附在軟骨上的結(jié)合組織。然后，去除上清液后，將軟骨置于含有牛胎兒血清(FBS)10%及膠原酶0.2%的Ham F-12培養(yǎng)基(ソディウム)中處理約2-2.5小時(shí)。將這種膠原酶溶液離心分離(1500rpm)后，用含10%FBS的均質(zhì)培養(yǎng)基(軟骨培養(yǎng)基)洗2次，最后將軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)成在軟骨培養(yǎng)基中含細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度。將該細(xì)胞液播種于每1ml有24個(gè)穴的板上，4日后達(dá)到合流(コンフルェント)后，在兩周內(nèi)供實(shí)驗(yàn)用。
(b)被驗(yàn)物質(zhì)以及軟骨破壞因子的添加到此為止，去除軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中使用的軟骨培養(yǎng)基;重新添加血清游離的S-Clone培養(yǎng)基800μl(含0.1%人血清白蛋白)，向其中添加各種濃度的被驗(yàn)物質(zhì)100μl(最終濃度的10倍S-Clone培養(yǎng)液，DMSO濃度2.5%)，于二氧化碳(5%)和空氣(95%)存在下培養(yǎng)2小時(shí)后，將軟骨破壞因子PMA(フオルボ ルミリステ ト セテ ト)(最終濃度0.1%μg/ml)或ィンタ ロィキン1α(IL-1α)(最終濃度0.1μg/ml)添加到軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中。
本發(fā)明的化合物七葉亭(東京化成)、4-甲基七葉亭(シクマ社制)、4-甲基七葉亭6，7-雙(乙酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(硬脂酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(亞油酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(二十二碳六烯酸酯)、七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)、4-甲基七葉亭6，7-雙(苯甲酸酯)、七葉亭6，7-雙(乙酸酯)、七葉亭6，7-雙(新戊酸酯)以及七葉亭6-單(新戊酸酯)(以上是由實(shí)施例1合成的化合物)。
對(duì)比物質(zhì)消炎痛(indomethacin)(シグマ社制)(c)GAG的定量2天后，除去軟骨培養(yǎng)細(xì)胞上清液后，在殘留的軟骨基質(zhì)層上加0.03%木瓜蛋白酶溶液1ml，于65℃反應(yīng)1小時(shí)，從基質(zhì)層游離出GAG。用1，9-二甲基亞甲藍(lán)法定量測(cè)定處理過的木瓜蛋白酶中的GAG含量(定量法參看R、W·Farndale，Biochim.Biophys、Acta.，Vol.883，pp.173-177，1986.)。將軟骨破壞因子無添加群(對(duì)比例)的軟骨基質(zhì)中GAG含量規(guī)定為100時(shí)，用下述公式求出各樣品的GAG相對(duì)量。對(duì)比例的GAG含量達(dá)到合流(コンフルェント)后，根據(jù)直到供實(shí)驗(yàn)用時(shí)經(jīng)過天數(shù)的不同，示出一個(gè)范圍(10.9-99.9μg/ml)。
GAG相對(duì)量(%)＝(B/A)×100式中，A是軟骨破壞因子無添加群(對(duì)比例)的GAG含量，B是軟骨破壞因子添加群或(軟骨破壞因子+被驗(yàn)物質(zhì))添加群的GAG含量。
將結(jié)果示于表1中。表中GAG含量是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝3)的值。在各實(shí)驗(yàn)中，加入對(duì)比例群以及軟骨破壞因子添加群。有意差的檢定，相對(duì)于各實(shí)驗(yàn)的軟骨破壞因子添加群，是用Student′st-test進(jìn)行。檢定結(jié)果表示如下。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001。
相對(duì)于軟骨破壞因子無添加群(對(duì)比例)的GAG含量，由于添加了作為軟骨破壞因子的PMA和IL-1a，從而導(dǎo)致GAG的減少。在這種條件下，確認(rèn)了本化合物具有抑制GAG減少、抑制軟骨破壞的作用。與此相反，作為先有技術(shù)鎮(zhèn)痛消炎劑的消炎痛卻見不到軟骨破壞抑制作用，相反，卻發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)軟骨破壞的作用。
表1樣品名GAG含量μg/ml(GAG相對(duì)量%)對(duì)比例 72.1±3.20***(100)IL-1α37.8±2.21(52.4)+七葉亭100μM 63.9±3.80**(88.6)對(duì)比例 58.8±2.60***(100)PMA37.9±1.37(64.5)+七葉亭100μM 78.0±2.32***(133)對(duì)比例 99.9±1.10***(100)PMA59.1±0.80(59.2)+4-甲基七葉亭100μM 72.1±0.70***(72.2)對(duì)比例 20.3±2.33***(100)IL-1α14.3±2.57(70.4)+4-甲基七葉亭6,7-雙(乙酸酯)100μM 27.3±3.66*(134)對(duì)比例 39.7±0.55**(100)IL-1α33.0±0.55(83.1)+4-甲基七葉亭6,7-雙(亞油酸酯)100μM 37.3±0.73**(94.0)+4-甲基七葉亭6,7-雙(硬脂酸酯)100μM 43.7±0.37***(110)+4-甲基七葉亭6,7-雙(二十二碳六烯酸酯)
100μM 43.0±0.12***(108)+4-甲基七葉亭6,7-雙(苯甲酸酯)100μM 44.7±0.93***(113)對(duì)比例 10.9±0.23**(100)IL-1α8.71±0.23(79.9)+七葉亭6,7-雙(苯甲酸酯)100μM 9.54±0.15*(87.5)對(duì)比例 24.3±3.33***(100)PMA11.3±1.76(46.5)+4-甲基七葉亭6,7-雙(乙酸酯)100μM 25.4±3.84**(105)對(duì)比例 44.3±0.61***(100)PMA37.9±1.67(85.6)+4-甲基七葉亭6,7-雙(亞油酸酯)100μM 42.3±0.82*(95.5)+4-甲基七葉亭6,7-雙(硬脂酸酯)100μM 47.0±1.10**(106)+4-甲基七葉亭6,7-雙(二十二碳六烯酸酯)100μM 47.6±0.49**(108)+4-甲基七葉亭6,7-雙(苯甲酸酯)100μM 48.1±1.56*(109)對(duì)比例 24.0±0.44***(100)
IL-1α16.0±0.68(66.7)+七葉亭6,7-雙(乙酸酯)100μM20.9±1.86(87.1)+七葉亭6,7-雙(新戊酸酯)10μM19.2±1.58(80.0)+七葉亭6-單(新戊酸酯)100μM 21.8±2.19*(90.8)對(duì)比例 28.0±0.7***(100)-PMA15.4±0.5(55.0)+消炎痛10 13.2±0.6*(47.1)33μM 11.7±0.8**(41.8)
實(shí)施例4制劑例(粒劑)將七葉亭20重量份，乳糖68重量份，低取代羥丙基纖維素10重量份羥丙基纖維素2重量份均勻混合后，用潤(rùn)濕劑乙醇32重量份與其混勻。然后，進(jìn)行濕式造粒，干燥后即獲得粒劑。
如上所述，本化合物(Ⅰ)對(duì)構(gòu)成軟骨基質(zhì)的GAG減少具有很強(qiáng)的抑制作用，顯示出軟骨保護(hù)作用，而且無毒性。因此，本化合物(Ⅰ)可用作軟骨保護(hù)，對(duì)慢性關(guān)節(jié)病、變形性關(guān)節(jié)病、肩周關(guān)節(jié)炎、頸肩腕癥候群、腰痛病的治療極為有效。
以上以特定的實(shí)施方案說明了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的各種變換方案均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)藥組合物，其特征是它含有以下通式(Ⅰ)所示的化合物 (式中，R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、碳原子數(shù)為2-25的飽和或不飽和的脂肪族?；虮郊柞；?，R3是氫原子或烷基。)
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的醫(yī)藥組合物，其中，R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、乙?；⑷谆阴；⑿刘；?、月桂?；?、棕櫚酰基、硬脂?；営王；?、二十二碳六烯?；虮郊柞；?，R3是氫原子或碳原子數(shù)為1-4的低級(jí)烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的醫(yī)藥組合物，它含有以下通式(Ⅱ)所示的化合物 (式中，R11和R12各自獨(dú)立地是氫原子、三甲基乙酰基、辛?；⒃鹿瘐；?、棕櫚?；?、硬脂酰基、亞油酰基、二十二碳六烯酰基或苯甲?；?，R13是氫原子或甲基。)
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥組合物，其中，R11和R12各自獨(dú)立地是氫原子、三甲基乙酰基、硬脂?；虮郊柞；?。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物，它是軟骨保護(hù)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物，它是關(guān)節(jié)病治療劑。
7.通式(Ⅱ)表示的化合物 (式中，R11和R12各自獨(dú)立地是氫原子、三甲基乙酰基、辛?；?、月桂?；?、棕櫚?；⒂仓；?、亞油酰基、二十二碳六烯?；虮郊柞；?，R13是氫原子或甲基。)
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其中，R11和R12各自分別是氫原子、三甲基乙?；?、硬脂?；虮郊柞；?。
9.通式(Ⅰ)所示化合物用于配制醫(yī)藥組合物 (式中，R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、碳原子數(shù)為2-25的飽和或不飽和脂肪族?；虮郊柞；?，R3是氫原子或烷基。)
10.通式(Ⅰ)所示化合物用于配制醫(yī)藥組合物，其中，通式(Ⅰ)所示化合物是除去在R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子、三甲基乙?；⑿刘；⒃鹿瘐；?、棕櫚酰基、硬脂酰基、亞油酰基、二十二碳六烯?；虮郊柞；琑3是氫原子或甲基時(shí)的通式(Ⅰ)所示化合物之外的化合物。
全文摘要
含有通式(I)所示化合物的醫(yī)藥組合物。在通式(I)中，R
文檔編號(hào)A61K31/37GK1101259SQ9410223
公開日1995年4月12日 申請(qǐng)日期1994年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月2日
發(fā)明者渡邊孝壽, 新村浩一, 梅川清則 申請(qǐng)人:吳羽化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社