本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)負(fù)染檢測(cè)技術(shù)，具體地說，涉及蛋白質(zhì)檢測(cè)的一種新的負(fù)染染料。

背景技術(shù)：

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)是銜接二維電泳和下游質(zhì)譜分析的關(guān)鍵技術(shù)。當(dāng)前先進(jìn)的質(zhì)譜儀已能夠分析pg級(jí)別的痕量蛋白。常規(guī)的凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、熒光染色等?？捡R斯亮藍(lán)染色法靈敏度低，銀染法操作復(fù)雜、質(zhì)譜兼容性差，熒光染色法價(jià)格昂貴。這些因素嚴(yán)重地制約了高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。雖然，近年來開發(fā)了不少新的染色技術(shù)，但仍存在著如下一個(gè)或幾個(gè)缺點(diǎn)：靈敏度低、重現(xiàn)性差、毒性大、質(zhì)譜兼容性差、價(jià)格昂貴、操作繁瑣等。尋找新的染色方法以適應(yīng)當(dāng)前先進(jìn)的質(zhì)譜分析技術(shù)已成為后基因組時(shí)代推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。4′，5′-二溴熒光素為凝膠蛋白染色提供了一種快速、靈敏的方法，其靈敏度達(dá)0.025ng/band，可以和銀染相媲美。而且4′，5′-二溴熒光素負(fù)染方法是對(duì)凝膠背景進(jìn)行著色，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)沒有修飾或破壞作用，有良好的質(zhì)譜兼容性，彌補(bǔ)了銀染法質(zhì)譜兼容性差的缺陷。4′，5′-二溴熒光素負(fù)染將很好地銜接二維電泳和下游質(zhì)譜分析，推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供4′，5′-二溴熒光素及其衍生物在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的相關(guān)化合物是指以4′，5′-二溴熒光素陰離子為母核的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽等。

4′，5′-二溴熒光素母核為：

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種電泳凝膠上蛋白質(zhì)負(fù)染的方法，包括如下步驟：

1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)樣品置于染色液中染色5～15min，其中染色液為含重量體積比0.05～0.5％的4′，5′-二溴熒光素或其衍生物、按摩爾濃度比20～100μM的氯化鋅、按溶液體積比5～20％的甘油及按溶液體積比30％～70％的甲醇水溶液；優(yōu)選的染色時(shí)間為8min，優(yōu)選的4′，5′-二溴熒光素及其衍生物的濃度為0.3％，優(yōu)選的氯化鋅濃度為50μM，優(yōu)選的甘油濃度為10％，優(yōu)選的碳酸優(yōu)選的甲醇濃度為40％。

2)棄去染色液，加入顯影液顯影1～5min，其中顯影液為按摩爾濃度比100mM的醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH＝4.6。優(yōu)選的顯影時(shí)間為2min。

3)檢測(cè)，凝膠染色后，可放在黑色背景下直接肉眼觀察；或在愛普生V700掃描儀下，反向掃描模式掃描，其靈敏度更高。

前期研究表明該技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)靈敏度高：4′，5′-二溴熒光素負(fù)染靈敏度高于考馬斯亮藍(lán)染色法數(shù)百倍，和銀染法靈敏度相當(dāng)；

2)操作簡(jiǎn)單迅速：操作步驟少，可在10min內(nèi)完成；

3)重現(xiàn)性好：受溫度、搖床擺動(dòng)頻率等外部條件影響??；

4)可逆性好：容易脫色；

5)質(zhì)譜兼容性好：由于4′，5′-二溴熒光素負(fù)染是對(duì)凝膠背景進(jìn)行染色，不和凝膠上的蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完全不受影響，所以可與LC-MS等質(zhì)譜儀高度兼容；

6)使用安全：采用毒性低的染料，提高實(shí)驗(yàn)操作的安全性，對(duì)環(huán)境污染??；

7)成本低。

附圖說明：

圖1. 4′，5′-二溴熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2. 4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法染色和顯影條件的優(yōu)化。(A)染色液中4′，5′-二溴熒光素濃度的篩選；(B)染色液中甲醇濃度的篩選；(C)染色液中甘油濃度的篩選；(D)染色液中氯化鋅濃度的篩選；(E)染色時(shí)間的篩選；(F)顯影液中pH值的篩選。

圖3.在一向SDS-PAGE上，(A，E，I)4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法；(B，F(xiàn)，J)曙紅負(fù)染法；(C，G，K)SYPRO Ruby熒光染色法；(D，H，L)鋅咪唑負(fù)染法。(A-D)為Sigma公司的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，(E-H)為小鼠腦總蛋白，(I-L)為大腸桿菌Escherichia coli BL21總蛋白。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣量如下(A-D)：帶1，12.8ng；帶2，6.4ng；帶3，3.2ng；帶4，1.6ng；帶5，0.8ng；帶6，0.4ng；帶7，0.2ng；帶8，0.1ng；帶9，0.05ng；帶10，0.025ng。小鼠腦總蛋白和大腸桿菌Escherichia coli BL21總蛋白上樣量(E-L)從左至右倍倍稀釋。

圖4.在二向SDS-PAGE膠上，(A)4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法和(B)鋅咪唑負(fù)染法靈敏度的比較。分離樣品小鼠腦總蛋白；IPG膠條長(zhǎng)13厘米，pH4-7；分離膠濃度為11.4％；樣品上樣量為100微克/膠條。(C)4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法和鋅咪唑負(fù)染法檢測(cè)到的蛋白斑點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體地實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1 4′，5′-二溴熒光素負(fù)染染色

圖1是4′，5′-二溴熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2～4的4′，5′-二溴熒光素蛋白質(zhì)負(fù)染實(shí)驗(yàn)采用下述步驟進(jìn)行：

1)將電泳后的凝膠置于0.3％4′，5′-二溴熒光素/40％甲醇/10％甘油/50μM氯化鋅染色液中染色8min。

2)棄去染色液，在100mM的醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH＝4.6)中顯影2min。

3)凝膠染色后，在愛普生V700掃描儀下，反向掃描模式掃描。

按照上述方法分別用4′，5′-二溴熒光素的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，結(jié)果表明用這些衍生物均能夠得到類似于4′，5′-二溴熒光素的檢測(cè)結(jié)果。

圖2是4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法染色法條件優(yōu)化的過程。分別對(duì)染色液中4′，5′-二溴熒光素濃度、甲醇濃度、甘油濃度、氯化鋅濃度、染色時(shí)間及顯影液中pH進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示最佳的染色液條件為0.3％4′，5′-二溴熒光素/40％甲醇/10％甘油/50μM氯化鋅，最佳染色時(shí)間為8min，顯影液最佳pH值為4.6。

圖3是說明在一向SDS-PAGE上，4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法與其它染色法效果的對(duì)比，采用的是蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，小鼠腦總蛋白和大腸桿菌Escherichia coli BL21總蛋白。

按照實(shí)施例1的方法，采用不同的方法進(jìn)行染色，(A，E，I)4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法；(B，F(xiàn)，J)曙紅負(fù)染法；(C，G，K)SYPRO Ruby熒光染色法；(D，H，L)鋅咪唑負(fù)染法靈敏度的比較。曙紅負(fù)染法、SYPRO Ruby熒光染色法和鋅咪唑負(fù)染法均按照文獻(xiàn)記載。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣量如下(A-D)：帶1，12.8ng；帶2，6.4ng；帶3，3.2ng；帶4，1.6ng；帶5，0.8ng；帶6，0.4ng；帶7，0.2ng；帶8，0.1ng；帶9，0.05ng；帶10，0.025ng。小鼠腦總蛋白和大腸桿菌Escherichia coli BL21總蛋白上樣量(E-L)從左至右倍倍稀釋。結(jié)果如圖3所示，4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法靈敏度最高。

小鼠腦總蛋白提取方法如下：用4℃的PBS溶液清洗小鼠腦組織，一共清洗3次。之后用液氮進(jìn)行組織研磨，將研磨所得的粉末裝入事先稱重的EP管中。向EP管中加入裂解液(9.5M urea，0.1DTT，2％CHAPS，0.8％pharmalyte pH3-10)至終濃度為1mg/mL。將樣品超聲破碎3次，每次1分鐘，完畢之后15000rpm 4℃高速離心30min，取上清液。大腸桿菌總蛋白的提取方法如下：取Escherichia coli BL21菌液，12000rpm離心收集菌群，加入0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)重懸菌體。利用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。18000rpm離心30min，收集上清，即得Escherichia coli BL21總蛋白質(zhì)提取液(粗蛋白制品)。

圖4是說明在二向SDS-PAGE上，4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法與鋅咪唑負(fù)染法效果的對(duì)比，采用是小鼠腦總蛋白。

用4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法和鋅咪唑負(fù)染法對(duì)經(jīng)二向凝膠電泳分離的小鼠腦總蛋白進(jìn)行染色，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，相比較鋅咪唑負(fù)染法而言，4′，5′-二溴熒光素負(fù)染法可檢測(cè)到更多的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，具有更高的靈敏度。

圖2～4中的其它染色方法及相關(guān)文獻(xiàn)

曙紅負(fù)染法操作方法參考文獻(xiàn)：Cong WT，Hwang SY，Jin LT，He HZ，Choi JK.High-throughput negative detection of SDS-PAGE separated proteins and its application for proteomics.Electrophoresis 2010，3，411-420.

SYPRO Ruby熒光染色法參考文獻(xiàn)：Berggren K，Chernokalskaya E，Steinberg TH，Kemper C，Lopez MF，Diwu Z，Haugland RP，PattonWF.Background-free，high sensitivity staining of proteins in one-and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.Electrophoresis 2000，21，2509-2521.

鋅咪唑負(fù)染法操作方法參考文獻(xiàn)：Castellanos-Serra L，Proenza W，Huerta V，Moritz RL，Simpson RJ.Proteome analysis of polyacrylamide gel-separated proteins visualized by reversible negative staining using imidazole-zinc salts.Electrophoresis 1999，20，732-737。