骨保護素衍生的組合物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明大體上涉及生物制藥領(lǐng)域以及在與骨吸收關(guān)聯(lián)的情況中--例如在腫瘤 學(xué)中一的生物制藥的用途。更具體地，本發(fā)明涉及結(jié)合核因子kB受體活化因子配體 (RANKL)的骨保護素衍生的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 在本節(jié)中描述的方法可被實行，并且不一定是先前已經(jīng)構(gòu)思或?qū)嵭械姆椒?。因此?除非另有說明，不應(yīng)假設(shè)在本節(jié)中描述的任何方法，僅僅因為它們包含在本節(jié)中而將其作 為現(xiàn)有技木。
[0003] 人類的骨保護素（0PG;基因庫：U94332. 1)是401個氨基酸的蛋白質(zhì)，其包含21個 氨基酸的信號肽，其在谷氨酸22產(chǎn)生380個氨基酸的成熟的可溶性蛋白質(zhì)之前被分開。OPG 是腫瘤壞死因子受體（TNFR)家族的ー員，在其N-末端部分中包含四個富含半胱氨酸TNFR 樣結(jié)構(gòu)域。OPG已經(jīng)顯示出在骨發(fā)展中發(fā)揮作用，并且缺少OPG基因的小鼠具有骨質(zhì)疏松的 表型和肉眼可見的骨骼異常。
[0004]OPG--其由成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生--充當(dāng)沒有明顯的直接信號功能的 分泌誘餌受體。OPG通過結(jié)合其自然的配體--骨保護素配體（OPGL)起作用，其也被稱為 RANKL(核因子kB受體活化因子配體）。OPG和RANKL之間的結(jié)合阻止了RANKL激活其同源 受體RANK，RANK是對于破骨細胞分化、活化和存活至關(guān)重要的破骨細胞受體。
[0005] 重組體OPG以分別大約55kDa和IlOkDa的表觀分子量的單體和二聚體的形式存 在。N-末端結(jié)構(gòu)域至半胱氨酸殘基185的截斷可能通過破壞TNFR樣結(jié)構(gòu)域的二硫鍵導(dǎo)致 OPG失活，而蛋白質(zhì)的C-末端部分至殘基194的截斷不改變生物活性。
[0006] 在轉(zhuǎn)基因小鼠中的OPG的超表達導(dǎo)致以小鼠中的破骨細胞幾乎完全缺乏為特征 的嚴(yán)重的骨硬化病。相反地，OPG基因的消融導(dǎo)致在小鼠中嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，這顯示了OPG 在調(diào)節(jié)骨吸收中的重要的生理作用。來自于成骨細胞和基質(zhì)細胞的OPG和RANKL的分泌 物由多個激素和細胞因子進行調(diào)節(jié)。OPG和RANKL產(chǎn)量的相對水平被認(rèn)為是用于控制骨吸 收的程度：RANKL的表達增加骨吸收，而過量的OPG具有相反的效果。重組體OPG阻礙體外 和體內(nèi)的刺激破骨細胞的絕大部分因素的影響。OPG也抑制多種動物疾病模型--包括卵 巢切除術(shù)、誘發(fā)型骨質(zhì)疏松、惡性體液性高鈣血癥以及實驗性骨轉(zhuǎn)移--中的骨吸收。因 此，OPG可代表針對與過度的破骨細胞活動關(guān)聯(lián)的疾病的有效的治療選擇（KostenuikPJ， ShalhoubV?，發(fā)表在當(dāng)今制藥（CurrPharmDes. )2001 年 5 月版；7 (8) :613-35)。
[0007] 狄諾塞麥（Denosumab)是高親和力的完全人單克隆抗體，其結(jié)合了人的RANKL并 抑制其與RANK相互作用，因此具有類似于OPG的作用方式。針對絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的 預(yù)防和治療，美國食品和藥物管理局（FDA)批準(zhǔn)了商品名為普羅利亞（Prolia)的狄諾塞 麥。針對具有來自于實體瘤的骨轉(zhuǎn)移的患者的骨骼相關(guān)事件的預(yù)防，美國食品和藥物管理 局（FDA)批準(zhǔn)了商品名為Xgeva的狄諾塞麥。針對其它骨重塑的相關(guān)情況的狄諾塞麥的進 一步的臨床試驗?zāi)壳罢谶M行，即，針對來自于癌癥的其它形式的骨轉(zhuǎn)移。
[0008] 因此，人們希望有ー種治療組合物，其能夠與RANKL結(jié)合并基于自然出現(xiàn)的OPG分 子，當(dāng)具有可接受的藥理學(xué)特性時，其具有更廣泛的治療潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 提供本
【發(fā)明內(nèi)容】
用于以簡化形式介紹以下在【具體實施方式】中進ー步說明的所選 構(gòu)思。本內(nèi)容不g在確定所要求保護的主題的關(guān)鍵特征或必要特征，也不g在被用作確定 所要求保護的主題的范圍的輔助。
[0010] 在某些方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合了人的RANKL的多肽。該多肽包含第一氨基酸 序列，該第一氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215 (基因庫：U94332. 1)。該多肽 進ー步包含第二氨基酸序列，該第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至 329(基因庫：幾0228.1)。該多肽在具有在100叩/1111的濃度時約501^/1111或不超過10%的 半數(shù)有效濃度（EC50)的體外基于細胞的測定中能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化。該 多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0011] 在某些方面，本發(fā)明提供ー種治療組合物。該組合物包含結(jié)合人的RANKL的多肽。 該多肽包含人骨保護素的生物活性部分和人免疫球蛋白Y-I的Fc部分。該多肽被實質(zhì)上 純化為在溶解狀態(tài)中的同型二聚體形式。該多肽在皮下給藥5mg/kg的劑量之后至少80小 時的小鼠的體循環(huán)中可顯示半衰期。在所述組合物的不超過lmg/kg的劑量、每周三次、至 少6周的皮下給藥的過程中，在鼠科動物的溶骨性模型（bonelyticmodel)中，該多肽能 夠?qū)嵸|(zhì)上抑制由人乳腺癌誘導(dǎo)的骨溶解。
[0012] 在某些方面，本發(fā)明提供ー種治療組合物。該組合物包含第一氨基酸序列，該第一 氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨基酸序列，該第二 氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。該多肽可以被實質(zhì)上純化至在 溶解狀態(tài)中的同型二聚體形式。該多肽在皮下給藥5mg/kg的劑量之后至少80小時的小鼠 的體循環(huán)中可顯示半衰期。在所述組合物的不超過lmg/kg的劑量、每周三次、至少6周的 皮下給藥的過程中，在鼠科動物的溶骨性模型中，該多肽能夠?qū)嵸|(zhì)上抑制由人乳腺癌誘導(dǎo) 的骨溶解。該多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0013] 在某些方面，本發(fā)明提供ー種編碼結(jié)合人的RANKL的多肽的分離的核酸。該多肽 包含第一氨基酸序列，該第一氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步 包含第二氨基酸序列，該第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。 多肽中的第一氨基酸序列可先于第二氨基酸序列。該多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序 列。核酸可針對哺乳動物細胞中的多肽的高效表達使其密碼子使用優(yōu)化。核酸可包含SEQ IDN0.2的序列。核酸可包含表達載體。
[0014] 在某些方面，本發(fā)明提供一種異源表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)隱含包含編碼結(jié)合人的 RANKL的多肽的核酸序列的表達載體。該多肽包含第一氨基酸序列，該第一氨基酸序列包含 人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨基酸序列，該第二氨基酸序列包含 人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。多肽中的第一氨基酸序列可先于第二氨基酸序 列。該多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。表達系統(tǒng)的表達載體可隱含于哺乳動物細 胞中。哺乳動物細胞可以是中國倉鼠卵巣（CHO)細胞。表達系統(tǒng)中的多肽的表達水平可以 是細胞培養(yǎng)的至少125毫克每公升。
[0015] 在某些方面，本發(fā)明提供一種物質(zhì)的用途，該物質(zhì)用于制造針對與骨吸收或重塑 關(guān)聯(lián)的疾病的治療或預(yù)防的藥物。該物質(zhì)包含結(jié)合人的RANKL的多肽。該多肽包含第一氨 基酸序列，該第一氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨 基酸序列，該第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。多肽中的第 一氨基酸序列可先于第二氨基酸序列。該多肽可包含SEQIDN0.1的氨基酸序列。與骨吸 收或重塑關(guān)聯(lián)的疾病可以是癌、乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髄瘤、由于實體瘤的骨轉(zhuǎn)移、骨 質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬關(guān)節(jié)炎。
[0016] 在某些方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防與骨吸收或重塑關(guān)聯(lián)的疾病的方法。該 方法包含給予需要治療或預(yù)防與骨吸收或重塑關(guān)聯(lián)的疾病的患者在治療上有效量的藥物 組合物，該藥物組合物包含結(jié)合人的RANKL的多肽。該多肽包含第一氨基酸序列，該第一氨 基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨基酸序列，該第二氨 基酸序列包含人免疫球蛋白Y -IFc的氨基酸103至329。多肽中的第一氨基酸序列可先于 第二氨基酸序列。該多肽可包含SEQIDN0.1的氨基酸序列。與骨吸收或重塑關(guān)聯(lián)的疾病 可以是癌、乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髄瘤、骨肉瘤、由于實體瘤的骨轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)疏松、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬關(guān)節(jié)炎。
[0017] 在此描述的本發(fā)明的這些和其它方面和優(yōu)勢在結(jié)合下述附圖和【具體實施方式】后 將變得顯而易見。
【附圖說明】
[0018] 提供以下附圖和說明書用于幫助理解本發(fā)明：
[0019] 圖1示意性地示出了用在本發(fā)明的多肽的克隆中的PCDNA4-FC質(zhì)粒和帶注釋的序 列的圖譜；
[0020] 圖2示意性地示出了用在本發(fā)明的多肽的克隆中的PKN002質(zhì)粒和帶注釋的序列 的圖譜；
[0021] 圖3示出了在生成用于表達本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定的細胞系的過程中獲得的代表 性的轉(zhuǎn)染生長曲線；
[0022] 圖4示出了在陰離子交換層析純化步驟之后的包含SEQIDNO. 1的多肽的樣品的 尺寸排阻高效液相色譜法（HPLC)分析色譜圖；
[0023] 圖5示出了在陰離子交換層析純化步驟之后的包含SEQIDNO. 1的多肽的樣品的 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析（在還原條件下）；
[0024] 圖6示出了描繪顯示包含SEQIDN0.1的多肽的樣品的優(yōu)良的分辨率 (resolution)的羥基磷灰石層析洗脫的輪廓；
[0025] 圖7示出了來自于羥基磷灰石層析的包含SEQ ID NO. 1的多肽的洗出液的主峰的 樣品的尺寸排阻HPLC分析色譜圖；
[0026] 圖8示出了用于骨溶解的評估的接種后八周時來自組1(制劑緩沖液的皮下注射 給藥）的代表性小鼠的脛骨的X射線圖像（分配的分?jǐn)?shù)在每個圖像下面示出）；
[0027] 圖9示出了用于骨溶解的評估的接種后八周時來自組2 (lmg/kg的SEQIDNO. 1 的多肽的皮下注射給藥）的代表性小鼠的脛骨的X射線圖像（分配的分?jǐn)?shù)在每個圖像下面 示出）；
[0028] 圖10示出了在組1、2和5的每個中的一只代表性小鼠的二維微型CT掃描圖像； 以及
[0029] 圖11示出了在組1、2和5的每個中的一只代表性小鼠的三維微型CT掃描圖像。
【具體實施方式】
[0030] 在此公開的教導(dǎo)是部分地基于包含融合到人IgG的Fc部分的OPG的生物活性 N-末端部分的蛋白質(zhì)分子的工程。為了提供這樣的OPG衍生的蛋白質(zhì)分子的重組生產(chǎn)，DNA 表達載體已經(jīng)被構(gòu)建用于在異源蛋白表達系統(tǒng)中過度生產(chǎn)蛋白質(zhì)分子，并且哺乳動物細胞 已經(jīng)準(zhǔn)備穩(wěn)定地表達蛋白質(zhì)分子至高表達水平。出乎意料地，來自于重組體來源的蛋白質(zhì) 分子形成溶解狀態(tài)中的同型二聚體和同型四聚體。已經(jīng)想出允許獲得生理學(xué)有關(guān)的實質(zhì)上 純的蛋白質(zhì)分子的同型二聚體制劑的蛋白質(zhì)純化程序。因此，在相關(guān)的體外基于細胞的測 定中，純化的蛋白質(zhì)分子顯示出高度抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化。出乎意料地，根據(jù)皮 下動物給藥，蛋白質(zhì)分子顯示出可接受的藥物動力學(xué)特性（pharmacokineticsprofi