專利名稱：蟲生真菌菌核的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蟲生真菌菌核的培養(yǎng)方法及其在防治害蟲方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致環(huán)境污染和害蟲抗藥性等問題日益突出，生物防治越來越受到人們的重視。西花薊馬Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera =Thripidae)是世界性的多種經(jīng)濟(jì)作物上的一種重要害蟲。西花薊馬通過銼吸取食和傳播植物病毒對作物造成嚴(yán)重為害。西花薊馬的生活史包括地上取食階段(成蟲，1齡和2齡若蟲)和土棲階段O齡若蟲末期，預(yù)蛹和蛹)。大部分西花薊馬的老熟2齡若蟲都表現(xiàn)出正趨地性和負(fù)趨光性，從植物上轉(zhuǎn)移到土壤或盆栽介質(zhì)中化蛹。依據(jù)寄主植物種類的不同，最多有98%的薊馬在地下化蛹，并分布在1. 5 2. Ocm深的土層中，直到發(fā)育為成蟲后從土壤中羽化出來再轉(zhuǎn)移到地上為害。此外，由于反復(fù)頻繁地施用化學(xué)藥劑，該蟲已發(fā)展出對多種化學(xué)殺蟲劑具抗性的種群。利用昆蟲病原真菌防治害蟲是生物防治的重要手段之一。蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)是地理分布和寄主范圍極廣的病原真菌，具有極大的生防潛力。在對害蟲高致病力的蟲生真菌菌株商品化過程中，通常是將分生孢子加工成各種劑型或者制成有保護(hù)性外殼的微膠囊等。然而，無論是通過改變培養(yǎng)條件來增強(qiáng)孢子的抗逆性，還是通過添加某種化合物使其穩(wěn)定性增加等手段，都不能從根本上改變分生孢子易失活，貨架期短這樣一個現(xiàn)狀。因此，在害蟲生防的實(shí)際應(yīng)用中，有必要發(fā)展和應(yīng)用真菌分生孢子以外的其它發(fā)育階段作為侵染源。菌核(microsclerotia，MS)是由真菌菌絲聚集、絞纏而形成的堅(jiān)硬的休眠結(jié)構(gòu)， 具有極端耐旱等特性。微菌核本身是沒有侵染性的。但是經(jīng)過復(fù)水后，能產(chǎn)生菌絲或萌發(fā)出對靶標(biāo)寄主有侵染性的分生孢子。到目前為止，還沒有蠟蚧輪枝菌在自然條件下或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)形成(微)菌核的任何報道。以昆蟲病原真菌菌核防治西花薊馬等害蟲，可以簡化抗蟲制劑的生產(chǎn)工藝，降低成本，并對環(huán)境沒有污染，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對分生孢子作為昆蟲病原真菌殺蟲劑的繁殖體存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)蟲生真菌菌核的技術(shù)，所述蟲生真菌優(yōu)選為蠟蚧輪枝菌。本發(fā)明所提供的蟲生真菌菌核的液體培養(yǎng)方法，需要將液體培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件控制在一定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)出的菌核經(jīng)過真空干燥后，可以長期貯藏，在適宜的條件下仍然能萌發(fā)出菌絲和有致病力的分生孢子，該技術(shù)成本低，菌核貯藏期長，非常適合推廣普及。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種蟲生真菌菌核的培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟1) 一級平板菌種培養(yǎng)； 2)液體種子培養(yǎng)；幻液體培養(yǎng)菌核；4)菌核的干燥。所述蟲生真菌包括任何昆蟲病原真菌，優(yōu)選為蠟蚧輪枝菌。
所述一級平板菌種培養(yǎng)是將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，待菌絲長滿平板并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)條件按照真菌常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，例如，可放入25°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10-14天。所述液體種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種后于恒溫?fù)u床培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度22-28°C，搖床震蕩頻率150-300rpm，培養(yǎng)時間3_4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖床震蕩頻率150rpm。所述液體培養(yǎng)菌核是將步驟2中培養(yǎng)好的搖瓶種子接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度22-28°C，搖床震蕩頻率150-300rpm，培養(yǎng)時間3-4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C， 搖床震蕩頻率300rpm。所述菌核的干燥是將液體發(fā)酵好的產(chǎn)物抽真空過濾到濾紙上，將其放入抽真空干燥儀中干燥。條件為溫度22-25°C，干燥2小時后取出，測得含水量為2. 5-7. 5%，優(yōu)選 5. 0%。一級菌種培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)時常用的PDA培養(yǎng)基，其成分和含量均是公知的，可通過教科書或?qū)嶒?yàn)手冊查得。液體種子培養(yǎng)時所用的液體種子培養(yǎng)基組成包括玉米粉30_40g，酵母浸膏 5-15g, KH2P042-6g, MgSO4 · 7H20 0. 4-0. 8g, FeSO4 · 7H20 12_16mg，ZnSO4 · 7H20 12_16mg 禾口 1000ml 水，優(yōu)選玉米粉 35g，酵母浸膏 10g, KH2PO4 4g，MgSO4 0. 6g，F(xiàn)eSO4 14mg，ZnSO4 Hmg 和 1000ml 水。液體培養(yǎng)菌核時所用的液體培養(yǎng)基組成包括葡萄5-10g、小于500 μ m的麥麩 10-15g、KH2PO4 2-6g, MgSO4 · 7H20 0. 4-0. 8g, FeSO4 · 7H20 12_16mg，ZnSO4 · 7H20 12_16mg 和 1000ml 水，優(yōu)選 7. 5g 葡萄糖、小于 500 μ m 的麥麩 12. 5g、KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 6g， FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。本發(fā)明還涉及通過上述培養(yǎng)方法獲得的蟲生真菌菌核在制備防治害蟲的生防制劑中的應(yīng)用，所述蟲生真菌優(yōu)選蠟蚧輪枝菌，所述害蟲優(yōu)選西花薊馬。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種防治害蟲的生防制劑，其特征在于，包括通過上述培養(yǎng)方法獲得的蟲生真菌菌核和輔料。所述蟲生真菌菌核優(yōu)選蠟蚧輪枝菌菌核，所述害蟲優(yōu)選西花薊馬；所述輔料是抗蟲制劑制備領(lǐng)域常用的輔助試劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以根據(jù)制劑的類型選擇相應(yīng)的輔料類型。本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲源，如蠟蚧輪枝菌和西花薊馬，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可通過常規(guī)的途徑獲得，如商業(yè)途徑等。例如，實(shí)施例中所用的蠟蚧輪枝菌購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。本發(fā)明首次用液體深層發(fā)酵法能產(chǎn)生蟲生真菌菌核。干燥制備的微菌核能夠保持活力，復(fù)水后能夠萌發(fā)出菌絲和孢子，增加了上述真菌作為西花薊馬土棲階段防治因子的潛力。該生產(chǎn)過程工藝簡單，成本低廉，生產(chǎn)過程中無污染性廢料產(chǎn)生，十分環(huán)保。用該方法獲得的蟲生真菌防治西花薊馬等害蟲，可以減少化學(xué)農(nóng)藥對植物和環(huán)境的污染，對人和動物沒有傷害，因此，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1在搖床上液體深層培養(yǎng)時蠟蚧輪枝菌菌核的發(fā)育。
4
(A) 48h內(nèi)，菌絲密度增加；⑶72h時，菌絲開始聚集形成菌核；(C) 92h時，菌核聚集更加緊密。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲源，如蠟蚧輪枝菌和西花薊馬，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可通過常規(guī)的途徑獲得，如商業(yè)途徑等。實(shí)施例中所用的蠟蚧輪枝菌購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。實(shí)施例1蠟蚧輪枝菌菌核的培養(yǎng)1.方法 1 1. 1 一級平板菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，放入25°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10_14天，待菌絲長滿平板并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)。1. 2液體種子培養(yǎng)在IOOOml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種量為 IOOOml三角瓶接入1/8體積培養(yǎng)好的一級平板菌種，接種后置于恒溫?fù)u床，培養(yǎng)條件為 25°C，150rpm，培養(yǎng) 3-4 天；所用液體種子培養(yǎng)基組成玉米粉35g，酵母浸骨10g，KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 6g ；FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。121°C高壓滅菌 15 分鐘，待冷卻至室溫后接種。1. 3液體培養(yǎng)菌核在IOOOml三角瓶中，裝入200ml的液體培養(yǎng)基，將步驟2中培養(yǎng)好的IOOul搖瓶種子接入培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C，搖床震蕩頻率為300rpm，培養(yǎng)時間為4天。所用液體培養(yǎng)基組成7.5g葡萄糖、小于500μπι的麥麩10、12.5或158三個梯度、 KH2PO4,4g, MgSO4 · 7Η20，0· 6g ；FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20,14mg 禾口 1000ml 水。121°C高壓滅菌15分鐘，待冷卻至室溫后接入液體種子。1.4菌核的干燥將液體發(fā)酵好的產(chǎn)物抽真空過濾到濾紙上，將其放入抽真空干燥儀中干燥，溫度為室溫02-25 °C )，干燥2小時后取出，測得含水量為5. 0%。結(jié)果在液體菌核培養(yǎng)步驟中，所用液體培養(yǎng)基中小于500 μ m的麥麩用量分別存在三個梯度，上述不同梯度下菌核產(chǎn)量分別為2. 9 X 105，3. 1 X IO5和33 X IO5個菌核/克菌。 生產(chǎn)周期為4天。2.方法 2 2. 1 一級平板菌種培養(yǎng)與實(shí)施例1中所述方法相同。2. 2液體種子培養(yǎng)與實(shí)施例1中所述方法相同。2. 3液體發(fā)酵培養(yǎng)與實(shí)施例1中所述方法相同，不同的是搖床震蕩頻率為 150rpmo2. 4菌核的干燥方法與實(shí)施例1中所述方法相同。結(jié)果在液體菌核培養(yǎng)步驟中，所用液體培養(yǎng)基中小于500 μ m的麥麩用量分別存在三個梯度，上述不同梯度下菌核產(chǎn)量分別為2. 8X 105，2. 9X IO5和3. 1 X IO5個菌核/克
5菌。生產(chǎn)周期為4天。3.菌核觀察蠟蚧輪枝菌液體種子接到培養(yǎng)液中后培養(yǎng)物的形成遵循這樣一個模式(圖1) :48h內(nèi)，菌絲密度增加；7 時，菌絲開始聚集形成菌核；9 時，菌核聚集更加緊密。形成的蠟蚧輪枝菌微菌核大小不同，直徑范圍為50 300 μ m。實(shí)施例2生測試驗(yàn)(生測效率的檢測)西花薊馬的飼養(yǎng)在0. 5L的筒形玻璃容器中放入3 4根豆莢，將薊馬成蟲轉(zhuǎn)移到容器內(nèi)產(chǎn)卵，容器放置在生長箱中，培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度沈"C，相對濕度60 % 70 %，光周期為L D = 13 11，產(chǎn)卵1 后去除成蟲以確保幼蟲齡期的一致。8d后收集2齡2d 的幼蟲(L2)備用。將蛭石、粘壤土和營養(yǎng)土按2 1 1的比例混合。將MS-DE顆粒均勻加入到混配的土壤中，混合比率為ΙΟΟμ g/100g 土。將上述混合物裝入塑料花盆中，并均勻噴灑無離子水，直到盆底有水份滲出為止。將花盆放入塑料托盤中，經(jīng)常加水保持托盤中持續(xù)有水， 并能被虹吸到塑料盆中。對照土壤同樣處理，但不加入MS-DE顆粒。菌核混合到土壤中7d(以充分產(chǎn)孢)后，用細(xì)毛刷將30頭L2薊馬幼蟲轉(zhuǎn)移到一小段豆莢上(作為食物)，豆莢放到上述裝盆土壤的表面。盆上扣透明的兩端開放的圓筒形塑料容器，塑料容器上端罩有防薊馬尼龍紗(120目)。在塑料容器內(nèi)壁上端加有一塊黃色粘蟲板以誘捕羽化的成蟲。罩有塑料容器的塑料盆放在生長箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置同上。 每個處理重復(fù)次，整個實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，2次重復(fù)分別記為實(shí)驗(yàn)1和2。接入L2幼蟲4d后，薊馬成蟲開始羽化，并粘到塑料容器內(nèi)的粘蟲板上，或者在土壤表面或者在塑料容器的內(nèi)邊，每天用放大鏡觀察成蟲羽化，連續(xù)7d直到再也沒有薊馬成蟲出現(xiàn)。從土壤表面或塑料容器內(nèi)邊收集到的蛹和成蟲都放到粘蟲板上，連同誘到成蟲的粘蟲板一起放在襯有濕濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(25°C )以檢測它們是否是被蠟蚧輪枝菌侵染致死。統(tǒng)計被真菌感染致死的僵蟲和健康成蟲。統(tǒng)計分析用對照的土壤中羽化出的成蟲數(shù)減去處理的土壤中得到的羽化成蟲數(shù)，得到薊馬累積死亡數(shù)。所得的死亡率進(jìn)行正弦轉(zhuǎn)換。培養(yǎng)液中生物量，芽孢和MS產(chǎn)量，干燥的MS-DE 顆粒的分生孢子產(chǎn)量以及薊馬死亡率的平均數(shù)均采用單一變量方差分析——最小顯著差測驗(yàn)(SPSS 10. 0，One-way ANOVA :LSD tests)。結(jié)果用蠟蚧輪枝菌微菌核處理的土壤中西花薊馬土棲階段的死亡率明顯高于對照(表1)，表明蠟蚧輪枝菌微菌核具有殺蟲的潛力。表1用蠟蚧輪枝菌微菌核處理的土壤中西花薊馬土棲階段的死亡率(平均數(shù)士
標(biāo)準(zhǔn)誤)
微丨 核處fl! Trcalcd with MS對照 Control實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)281.2 士 3.8b83.5±5.9b4.8 士 1.3a 注同行不同字母表示在0. 05水平差異顯著(ρ < 005)。
權(quán)利要求
1.一種蟲生真菌菌核的培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟1) 一級平板菌種培養(yǎng)；2) 液體種子培養(yǎng)；幻液體培養(yǎng)菌核；4)菌核的干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述蟲生真菌為蠟蚧輪枝菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述一級平板菌種培養(yǎng)是將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，待菌絲長滿平板并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述液體種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種后于恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 22-280C，搖床震蕩頻率150-300rpm，培養(yǎng)時間3_4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖床震蕩頻率 150rpmo
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的培養(yǎng)方法，基特征是所述液體培養(yǎng)菌核是將步驟2中培養(yǎng)好的搖瓶種子接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22-28°C，搖床震蕩頻率 150-300rpm，培養(yǎng)時間3_4天；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖床震蕩頻率300rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的培養(yǎng)方法，其特征是步驟O)中的液體種子培養(yǎng)基組成包括玉米粉 30-40g,酵母浸膏 5-15g，KN2PO4 2. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 4-0. 8g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 12-16mg, ZnSO4 · 7H20 12_16mg 和 1000ml 水；優(yōu)選為包括玉米粉 35g，酵母浸膏 10g, KH2PO4 4g, MgSO4 · 7Η200· 6g, FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的培養(yǎng)方法，其特征是步驟(3)中的液體培養(yǎng)基組成包括 5-10g 葡萄糖，小于 500 μ m 的麥麩 10-15g，KH2PO4 2_6g，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 8g， FeSO4 · 7H2012-16mg，ZnSO4 · 7H20 12_16mg 和 1000ml 水；優(yōu)選為包括 7. 5g 葡萄糖，小于 500 μ m 的麥麩 12. 5g, KH2PO4,4g, MgSO4 · 7H20 0. 6g, FeSO4 · 7H20 14mg, ZnSO4 · 7H20 14mg 和 1000ml 水。
8.用上述權(quán)利要求1-7所述培養(yǎng)方法獲得的蟲生真菌菌核在制備防治害蟲的生防制劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，基特征是所述蟲生真菌為蠟蚧輪枝菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征是所述害蟲為西花薊馬。
11.一種防治害蟲的生防制劑，其特征是，包括通過上述權(quán)利要求1-7所述培養(yǎng)方法獲得的蟲生真菌菌核和輔料。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生防制劑，其特征是，所述蟲生真菌菌核為蠟蚧輪枝菌菌核。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的生防制劑，其特征是，所述害蟲為西花薊馬。
全文摘要
針對分生孢子作為昆蟲病原真菌殺蟲劑的繁殖體存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)蟲生真菌菌核的技術(shù)，所述蟲生真菌可以是蠟蚧輪枝菌。本發(fā)明所提供的蟲生真菌菌核的液體培養(yǎng)方法，需要將液體培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件控制在一定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)出的菌核經(jīng)過真空干燥后，可以長期貯藏，在適宜的條件下仍然能萌發(fā)出菌絲和有致病力的分生孢子。該技術(shù)成本低，菌核貯藏期長，非常適合推廣普及。
文檔編號A01P7/04GK102206586SQ201110101659
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者王海鴻, 問錦曾, 雷仲仁 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所