一種蟲生真菌抗菌肽的制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蟲生真菌抗菌肽制品及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的蟲生真菌抗菌肽制品選用蟲生真菌蟬花蟲草為原料，優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)紗布過濾除菌絲后離心收集上清；上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清經(jīng)硫酸銨鹽析收集沉淀。沉淀溶于滅菌水后經(jīng)SephadexG-15柱層析、DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析和SephadexG-50柱層析純化后得到蟲生真菌抗菌肽制品。該抗菌肽制品主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽類。產(chǎn)品為淡黃色粉末狀，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等具有抑菌活性。本發(fā)明具有簡便快速，制備的抗菌肽純度高、活性強的特點。制備的抗菌肽制品可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥原料、食品、果蔬防腐保鮮以及飼料添加劑和護膚品等領(lǐng)域。CGMCC NO.89892014.04.03
【專利說明】一種蟲生真菌抗菌肽的制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蟲生真菌抗菌肽制品及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及生物活性 物質(zhì)分離純化的【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 青霉素等抗生素的發(fā)現(xiàn)給病原菌感染性疾病的治療帶來了革命性飛躍。與此同時 人們也意識到病原微生物將最終會產(chǎn)生抗性。但令人驚訝的是病原菌抗性產(chǎn)生的速度和抗 性的廣泛性。近年來，在臨床治療中結(jié)構(gòu)新穎的抗生素發(fā)現(xiàn)匾乏，抗藥菌群迅猛發(fā)展，使某 些感染性疾病成為臨床治療的難題?？股?、化學防腐劑作為病原菌抑制劑添加到食品、飼 料和化妝品中由來已久。但隨著抗生素和化學防腐劑的廣泛使用和人們對食品質(zhì)量和環(huán)境 質(zhì)量的要求不斷提高，它們的副作用也就日益表現(xiàn)出來，面臨著被淘汰的局面。據(jù)美國衛(wèi)生 基金會和國家癌癥研究所新公布的一份報告表明在全世界每年罹患癌癥的500萬人中，有 50%左右與食品污染有關(guān)，而其中有30%左右受害于食品中的抗生素或化學防腐劑。為了應(yīng) 對以上種種問題，人們在不斷研究和開發(fā)新型天然抗菌藥物和抗菌防腐添加劑。近年來出 現(xiàn)的抗菌肽就是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬?、食品防腐保鮮添加劑和飼料添加 劑。
[0003] 抗菌肽是一類小分子陽離子肽類生物活性物質(zhì)，廣泛存在微生物、植物、動物及人 體內(nèi)。到目前為止，已從生物界分離得到800多種抗菌肽。雖然抗菌肽具有廣泛的抗性(抗 細菌、真菌、病毒、原蟲等活性)，但是對正常的哺乳動物細胞無毒性?？咕牟⒉徽T發(fā)抗性 突變的產(chǎn)生，多數(shù)抗菌肽的水溶性較好，對熱穩(wěn)定，對較大離子強度、較低或較高的pH都有 較強的耐受性。因而抗菌肽可以作為醫(yī)用和食品方面抗菌性的抗生素的替代藥物或添加 齊U。抗菌肽的開發(fā)與應(yīng)用研究已成為國內(nèi)外研究的熱點。
[0004] 基于抗菌肽的重要作用，許多學者開展新型抗菌肽的尋找及制備研究。尋找和制 備抗菌肽有三種途徑：化學合成，生物工程(重組技術(shù))和從生物中篩選天然的抗菌肽類?；?學合成常受到合成起始點的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的限制。生物工程也存在如不正確轉(zhuǎn)錄而導致折疊不 準確的蛋白質(zhì)等問題。從生物中篩選抗菌肽具有來源豐富、物質(zhì)天然等優(yōu)點，因而倍受抗菌 肽研究工作者的青睞。
[0005] 微生物在人類的生產(chǎn)和生活中具有廣闊的應(yīng)用范圍，如治療藥物、精細化工、農(nóng)用 藥物、發(fā)酵及食品工程等。近年來微生物來源的生物抗菌物質(zhì)已經(jīng)逐步得到開發(fā)和利用， 這些抗菌物主要來源于細菌、真菌及放線菌。真菌是由不同進化途徑的類群組成，現(xiàn)已發(fā) 現(xiàn)69000種。真菌被用作藥物，在我國已有悠久的歷史，它不僅是我國天然藥物資源和中草 藥的一個極為重要的組成部份，而且已成為當今探索和發(fā)掘新藥的重要領(lǐng)域。目前國內(nèi)外 學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有新穎結(jié)構(gòu)和抗菌活性的真菌抗菌活性物質(zhì)，主要包括萜類及其皂 苷、生物堿類、芳香類、留體類、酚類和酚酸類以及肽類等。
[0006] 這些抗菌物質(zhì)多為從植物內(nèi)生真菌中分離純化出來的，而從蟲生真菌中分離報道 的則還沒有。蟲生真菌是指那些在正常生理條件下就能直接侵入寄主體內(nèi)，增殖和快速引 起死亡以及一些不引起昆蟲致命疾病，但可降低寄主活力并使其衰弱的真菌類群。蟲生真 菌種類多，數(shù)量大，代謝類型復雜，可以產(chǎn)生多種生理功能特異的生物活性物質(zhì)，這種代謝 產(chǎn)物的多樣性為人類開發(fā)新的藥品及其它領(lǐng)域的利用提供了重要的新資源途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種蟲生真菌抗菌肽 制品及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明具有制備的抗菌肽純度高、活性高的特點。
[0008] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種蟲生真菌抗菌肽制品的制備方法：本發(fā)明選用蟲生真菌蟬花蟲草為 原材料，優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)紗布過濾除菌絲后離心收集上清；上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 濃縮后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清經(jīng)硫酸銨鹽析收集沉淀。沉淀溶于滅菌水后經(jīng)柱 層析純化后得到蟲生真菌抗菌肽制品。
[0009] 在一些優(yōu)選的方式中，本發(fā)明使用的蟲生真菌為保藏于中國普通微生物菌種保藏 管理中心，保藏號為 CGMCC NO. 8989 的蟬花蟲草（QoAiocor辦ceps ^0^///6^3) 022007-9 號菌株。蟬花蟲草又被稱作為蟬擬青霉，是一種蟲生真菌。
[0010] 在另一些優(yōu)選的方式中，一種從保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏 號為CGMCC NO. 8989的蟬花蟲草（QMiocor辦SoAoBfera) 022007-9菌株提取抗菌 肽的方法，包括：（1)菌種活化及種子制備：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培養(yǎng)， 25±1°C活化7?IOcL用滅菌蒸餾水加入斜面中，將孢子沖洗下來，用力震搖3?5min，制 成孢子懸浮液(種子)，血球計數(shù)法計算孢子濃度待用； (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將孢子濃度為6X IO7的孢子懸浮液1毫升接種到篩選出的250毫升的 發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖床轉(zhuǎn)速120rpm/min，25土 1°C條件下培養(yǎng)7d ;其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的 為：蛋白胨 5g/ L，蔗糖 20g/ L，KH2PO4 lg/ L，MgSOJH2O 0.5g/ L，溶劑為蒸餾水。
[0011] (3)發(fā)酵液的處理：經(jīng)過步驟（2)發(fā)酵的發(fā)酵液經(jīng)雙層紗布過濾除菌絲后，在4°C 下，12 000 rpm/ min離心30 min除去發(fā)酵液中較大顆粒物質(zhì)；按10 : 1體積比加入無 水乙醇，64°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50倍；按1 : 3體積比加入無水乙醇，充分攪拌后，在4°C 冰箱內(nèi)靜置過夜沉淀多糖，后在4°C下，12 000 rpm / min離心30min;收集上清，64°C下旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用滅菌蒸餾水重溶；其中紗布的孔徑為100目。
[0012] (4)硫酸銨鹽析：將步驟（3)用滅菌蒸餾水重溶后的樣品在4°C條件下緩慢加入固 體硫酸銨，邊加邊攪拌使硫酸銨的飽和度達到60%，攪拌半個小時，靜置過夜，后在4°C下， 12 000 rpm / min離心30min;最后收集沉淀；沉淀溶于滅菌蒸餾水中，經(jīng)0.45 iiM膜過濾 后，保留濾過液； (5)將經(jīng)過步驟（4)溶于滅菌蒸餾水的沉淀進行S印hadex G-15柱層析、 DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析和Sephadex G-50柱層析分離純化得到所述的蟲生真 囷抗囷膚制品。
[0013] 一些優(yōu)選的方式中，所述的S印hadex G-15柱層析方法是：將上述溶于滅菌蒸 餾水的（ImL)沉淀上樣于Sephadex G-15柱（2. 6 X 10 cm)，以純水作為流動相洗脫，流速 4mL / min，檢測波長為280_，收集第II個峰組分獲得的樣品II)，冷干后低溫下凍存。
[0014] 在一些優(yōu)選的方式中，所述的DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析是：將經(jīng)過 Sephadex G-15柱層析后活性峰樣品（II) ImL上樣于DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱 (2.6\10〇11)，流速3 1111/111111，檢測波長 280"。分別以0.05、0.1、0.3、0.5和1111〇1/1 NaCL緩沖液（pH 6. 5)進行洗脫，收集第1峰組分獲得得樣品1，冷干后低溫凍存。
[0015] 在一些優(yōu)選的方式中，所述的Sephadex G-50柱層析是將ImL生物上述樣品1上 樣于 S印hadex G-50 柱（1.6 X 30 cm)，以 0.05 mol / L NaCL 緩沖液（pH 6. 5)作為流動相 洗脫，流速〇.4mL / min，檢測波長為280_，收集所示標記為Gl組分。冷干后即為所述的蟲 生真菌抗菌肽制品，低溫凍存。
[0016] 本發(fā)明提供的上述制備方法制備的蟲生真菌抗菌肽制品，是由分子量較小的肽類 組成的，主要是一些分子量小于5. 8 kDa的小分子肽類，外在形態(tài)表現(xiàn)為淡黃色粉末狀。 [0017] 本發(fā)明還提供了一種蟲生真菌抗菌肽制品作為原料的應(yīng)用，采用上述方法制備的 抗菌肽制品能用作醫(yī)藥原料，食品、果蔬防腐保鮮劑，飼料添加劑和護膚品。
[0018] 發(fā)明人對本發(fā)明抗菌肽制品進行了以下的檢測或測定： 本發(fā)明采用常規(guī)的高效液相色譜（HPLC)和N-三（羥甲基）甲基甘氨酸聚丙烯酰胺 凝膠電泳（Tricine-SDS - PAGE)對制備的抗菌肽進行組成及純度檢測；利用Lambert等 (1989)的平板打孔穴抑菌法對制備的抗菌肽進行抗菌活性測定； 本制備工藝生產(chǎn)的蟲生真菌抗菌肽制品具有如下特征：該抗菌肽是從蟲生真菌蟬花 蟲草中制備得到的一種由多種肽類組成的混合物，主要是一些分子量小于5. SkDa的小分 子肽類。產(chǎn)品為淡黃色粉末狀，對金黃色葡萄球菌aareys)和大腸桿菌 co/i)等都具有抑菌活性，而且表現(xiàn)出很好的抗菌性。
[0019] 生物保藏說明 該真菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號碼為CGMCC NO. 8989,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，拉丁學名： 辦ce/751 soAo/i/kra，中文名稱為：蝶花蟲草，保藏日期為：2014年4月03日。
[0020] 有益效果 本發(fā)明具有原料來源豐富，價格低廉，簡便快速，制備的抗菌肽純度高、活性高，抗菌效 果好于常用的天然肽類防腐劑（如NiSin)和化學防腐保鮮劑(如脫氫醋酸鈉)。本發(fā)明產(chǎn) 品與化學合成抗菌劑相比具有無毒，無殘留，不受合成起始點的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的限制；選擇可以 食用的蟲生真菌蟬花蟲草作為原材料，具有較高的食用安全性；本發(fā)明制備方法可大規(guī)模 工廠化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本較低，且不受外在環(huán)境的影響。制備的抗菌肽制品可廣 泛應(yīng)用于醫(yī)藥原料、食品、果蔬防腐保鮮以及飼料添加劑和護膚品等領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是蟲生真菌抗菌肽的Sephadex G-15柱層析圖。
[0022] 圖2是蟲生真菌抗菌肽的DEAE-S印harose FF陰離子交換層析圖。
[0023] 圖3是蟲生真菌抗菌肽的Sephadex G-50柱層析圖。
[0024] 圖4是蟲生真菌抗菌肽制品組成及純度Tricine-SDS - PAGE檢測，其中M :蛋白 質(zhì)分子量標準；1 :濃縮發(fā)酵液；2 :鹽析后沉淀；3 :陰離子交換層析后活性組分（圖2中"1" 組分）；4 :S印hadex G-50柱層析后活性組分（圖3中"G1")。
[0025] 圖5是蟲生真菌抗菌肽制品組成及純度HPLC分析。

【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和具體實施例來進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0027] 選用蟲生真菌蟬花蟲草作為原材料，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后制備蟲生真菌抗菌肽的方法包 括以下實施例1、2、3、4和5所述過程。
[0028] 實施例1不同發(fā)酵培養(yǎng)液蟲生真菌蟬花蟲草產(chǎn)生活性肽的影響 (1) 蟲生真菌菌種：蟬花蟲草（022007-9菌株； (2) 菌種活化及種子制備：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培養(yǎng)，25土 1°C活化 7?10d。用滅菌蒸饋水加入斜面中，將孢子沖洗下來，用力震搖3?5min，制成孢子懸浮液 (種子)，血球計數(shù)法計算孢子濃度待用； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：將6X IO7孢子懸浮液體1毫升分別接種到以下三種不同的250mL的發(fā) 酵培養(yǎng)液中，搖床轉(zhuǎn)速120印111/111111，25±11：條件下培養(yǎng)7(1，各3個重復，搖床轉(zhuǎn)速120印111/ min，25 土 1°C條件下培養(yǎng)7d ;各3個重復；選用的發(fā)酵培養(yǎng)液：①馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸 餾水IL ; ② 蛋白胨 5g，蔗糖 20g，KH2PO4 lg，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，蒸餾水 IL ; ③ 蛋白胨 5g，葡萄糖 20g，KH2PO4 lg，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，蒸饋水 1L。
[0029] 搖床結(jié)束后分別取濾液和菌絲體，測定菌絲體干重及濾液對細菌的抗菌活性。不 同的發(fā)酵培養(yǎng)液對發(fā)酵液抗菌活性的影響見表1。從表中數(shù)據(jù)我們可以看出，在①和②發(fā) 酵培養(yǎng)液之間，無論是從抑菌圈直徑，還是從單位重量的菌絲體產(chǎn)生的抑菌圈直徑（即抗 菌效價)，②發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的抗菌肽的效果要優(yōu)于①發(fā)酵培養(yǎng)液，在抗菌效價上提高了 39. 62%。在②和③發(fā)酵培養(yǎng)液之間（即氮源固定，碳源變化)，從表可以看出不同的碳源既可 以影響菌體的生長，又可以影響抗菌效價。從抗菌效價上，②培養(yǎng)液的效果明顯優(yōu)于③培養(yǎng) 液，抗菌效價提高58. 53%。
[0030] 綜合以上分析，我們確定實驗室條件下蟬花蟲草022007-9菌株產(chǎn)生抗菌肽的較 佳發(fā)酵培養(yǎng)液為②發(fā)酵培養(yǎng)液，即蛋白胨5g (0.5%)，蔗糖20g (2%)，KH2PO4 Ig (0.1%)， MgSO4 ? 7H20 0? 5g (0? 05%)，蒸餾水 1L。

【權(quán)利要求】
1. 一種從蟲生真菌制備抗菌肽制品的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：（1)、 菌種活化及種子制備：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培養(yǎng)，25± 1°C活化7?10d ; 用滅菌蒸餾水加入斜面中，將孢子沖洗下來，用力震搖3?5min，制成孢子懸浮液，血球計 數(shù)法計算孢子濃度待用；其中，所述的菌株為保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心， 保藏號為 CGMCC NO. 8989 的蟬花蟲草（φΑ/ocor辦 so/w/i/era) 022007-9 號菌株； (2)、發(fā)酵培養(yǎng)：將孢子濃度為6 X 107的孢子懸浮液1毫升接種到250毫升的發(fā)酵培養(yǎng)液中， 搖床轉(zhuǎn)速120rpm/min，25土 1°C條件下培養(yǎng)7d;其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的組成為：蛋白胨 5g/ L，蔗糖20g/ L，KH2P04 lg/ L，MgS04*7H20 0.5g/ L，溶劑為蒸餾水；（3)、發(fā)酵液的處 理：經(jīng)過步驟（2)發(fā)酵的發(fā)酵液經(jīng)雙層紗布過濾除菌絲后，在4°C下，12 000 rpm / min離 心30 min除去發(fā)酵液中較大顆粒物質(zhì)；按10 : 1體積比加入無水乙醇，64°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮至50倍；按1 : 3體積比加入無水乙醇，充分攪拌后，在4°C冰箱內(nèi)靜置過夜沉淀多糖， 后在4°C下，12 000 rpm/min離心30min;收集上清，64°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用滅菌蒸饋 水重溶；其中紗布的孔徑為100目；（4)、硫酸銨鹽析：將步驟（3)用滅菌蒸餾水重溶后的 樣品在4°C條件下緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌使硫酸銨的飽和度達到60%，攪拌半個 小時，靜置過夜，后在4°C下，12 000 rpm / min離心30min;最后收集沉淀；沉淀溶于滅菌 蒸餾水中，經(jīng)0. 45 μ Μ膜過濾后，保留濾過液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法還包括：步驟（5)，將經(jīng)過步驟（4)溶于滅 菌蒸饋水的沉淀分別依次進行Sephadex G-15柱層析、DEAE-Sepharose FF陰離子交換層 析和Sephadex G-50柱層析分離純化得到所述的蟲生真菌抗菌肽制品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-15柱層析方法為：將經(jīng)過 步驟（5)的硫酸銨鹽析后沉淀溶于滅菌蒸饋水的lmL樣品上樣于2. 6X 10 cm的Sephadex G-15柱，以純水作為流動相洗脫，流速4mL / min，檢測波長為280?，收集第II個活性峰組 分并獲得得樣品II。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析的 步驟包括：將經(jīng)過Sephadex G-15柱層析后活性峰組分II樣品lmL上樣于2. 6X 10 cm的 DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱，流速3 mL / min,檢測波長280" ;分別以0. 05、0. 1、 0. 3、0. 5和1 mol / L NaCL，pH 6. 5的緩沖液進行洗脫，收集第1峰活性組分獲得得樣品 1〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-50柱層析是將經(jīng)過 DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析后活性樣品1的lmL樣品上樣于1.6X30 cm的 5印1^(^16-50柱，以0.05 111〇1/1^似(^，？!16.5的緩沖液作為流動相洗脫，流速 0. 4mL / min,檢測波長為280_，收集所示標記為G1組分。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5之一獲得的抗菌肽制品在醫(yī)藥原料，食品、果蔬防腐保鮮劑，飼料 添加劑和護膚品的用途。
【文檔編號】A23B7/154GK104277099SQ201410183317
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月3日
【發(fā)明者】黨向利, 柴一秋, 厲曉臘, 劉又高, 金軼偉, 陳官菊, 潘益虎 申請人:浙江省亞熱帶作物研究所