專利名稱：：昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗菌肽衍生物，具體地說涉及一組有抗菌作用的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽，以及它的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：抗生素的發(fā)現(xiàn)在人類醫(yī)學(xué)史上具有重要的意義，它的使用挽救了無數(shù)的生命，使人的預(yù)期壽命增加了十年以上。但是隨著人們對抗生素的廣泛使用，細(xì)菌也逐漸適應(yīng)并對其產(chǎn)生了耐藥性。雖然目前臨床上使用的抗生素有上百種之多，但都屬于化學(xué)小分子，新研制的抗生素一般也是其結(jié)構(gòu)修飾物，很難解決細(xì)菌對抗生素耐藥的問題。隨著耐藥菌問題的出現(xiàn)，新型的抗耐藥菌的抗生素的研發(fā)已成為國際上廣泛關(guān)注的問題。自然界中的許多生物，如昆蟲、兩棲類動物、植物和哺乳類動物都會產(chǎn)生保護(hù)機(jī)體的具有抗菌活性的小分子肽。這些抗菌肽能與生物體的細(xì)胞膜發(fā)生作用，從而達(dá)到殺死細(xì)菌、真菌和病毒的作用。昆蟲抗菌肽都帶有不同數(shù)量的正電荷，其作用機(jī)制在于，它所帶的正電荷能與細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層的負(fù)電荷結(jié)合，從而影響膜上的離子通道，增加通透性，使細(xì)菌死亡，同時，抗菌肽還可以和膜上的脂多糖結(jié)合，減輕由細(xì)菌感染引起的臨床癥狀。昆蟲抗菌肽Thanatin是一種從昆蟲中提取的有較好抗菌活性的抗菌肽。美國專利USP6770798公開了如何利用基因工程技術(shù)在植物中表達(dá)Thanatin(21個氨基酸)，增強(qiáng)植物對病原微生物抵抗能力的方法，專利保護(hù)其10個氨基酸的核心序列，以及其上游10個氨基酸和下游5個氨基酸序列，其氨基酸全長核心序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中的Gly為甘氨酸，Ser為絲氨酸，Lys為賴氨酸，Pro為脯氨酸，Val為纈氨酸，Tyr為酪氨酸，Cys為半胱氨酸，Asn為天冬酰胺，Arg為精氨酸，Thr為蘇氨酸，Gln為谷氨酰胺，Met為曱硫氨酸。目前，國際上已經(jīng)報道的抗菌肽有數(shù)百種，其抗菌范圍很廣，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒都有抑制作用，由于抗菌肽是利用生物體自身免疫機(jī)制而達(dá)到抗菌作用，與抗生素的作用有很大不同，故其對目前臨床上的耐藥菌仍具有殺菌作用，被國際上認(rèn)為是一類具有廣闊應(yīng)用前景的新型抗菌藥。但是直接利用天然抗菌肽作為抗菌藥物的嘗試很少。主要原因有很多天然抗菌肽的抗菌活性不高；化學(xué)合成天然抗菌肽的成本高，而且收率低；很多抗菌肽有很強(qiáng)的溶血副作用。如從蜜蜂毒液中提取的蜂毒肽，它具有很強(qiáng)的抗菌活性，但同時也具有溶血副作用，而使蜂毒肽作為抗菌藥物的應(yīng)用受到很大的限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是通過基因工程方法，以較低的生產(chǎn)成本合成了一組具有較高抗菌活性、較低溶血副作用的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物。同時，將這些抗菌肽應(yīng)用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染的藥物中。本發(fā)明涉及一組具有如下結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽①Gly隱Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr隱Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met;②Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met;③Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met;④Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys隱Gln-Arg-Met;⑤Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr陽Ala-Lys匿Cys-Gln-Arg-Met;⑥Gly-Ser-Lys隱Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser隱Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met。本發(fā)明的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物與美國專利USP6770798公開的Thanatin的差別如下:①Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys畫Gln-Arg-Arg-Thr-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,將Thanatin第12位氨基酸Asn突變?yōu)镚in;②Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-$er-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met，將Thanatin第15位氨基酸Thr突變?yōu)镾er;③Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Aia-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,將Thanatin第16位氨基酸Gly突變?yōu)锳la;④Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,將Thanatin第12位氨基酸Asn突變?yōu)镚in,第15位氨基酸Thr突變?yōu)镾er;Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro畫Ile隱Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,將Thanatin第12位氨基酸Asn突變?yōu)镚in,第16位氨基酸Gly突變?yōu)锳la;Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,將Thanatin第15位氨基酸Thr突變?yōu)镾er,第16位氨基酸Gly突變?yōu)锳la。本發(fā)明還涉及一組昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物的制備方法，該制備方法是基因工程方法，其步驟包括按昆蟲抗菌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段，基因片段連接，質(zhì)粒構(gòu)建，克隆，發(fā)酵，分離純化及冷凍干燥得產(chǎn)品。具體地講，所述昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物的制備方法，包括以下步驟用PCR方法合成帶有凝血酶切割位點(diǎn)的6種Thanatin衍生物基因，導(dǎo)入pET32a(+)載體，獲得含編碼Thanatin衍生物DNA序列的表達(dá)載體；將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子，用8mM乳糖37。C誘導(dǎo)表達(dá)6小時，獲得的融合蛋白表達(dá)量分別占菌體總蛋白的48%(Tq)，50%(Ts)，42%(Ta),31%(Tqs)，27%(Tqa)和56%(Tsa);用10L發(fā)酵罐放大，種子液按5:100的比例接種，37°C,固定通氣量4L/min,培養(yǎng)6小時后補(bǔ)料，0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5小時后放罐，融合蛋白表達(dá)量分別占菌體總蛋白的36%(Tq),32%(Ts)，40%(Ta),42%(Tqs)，21%(Tqa)和37%(Tsa);所得融合蛋白經(jīng)凝血酶切割、陰離子交換柱分離，得到粗品，再經(jīng)高效液相制備儀精制，獲得Thanatin衍生物純品，其純度達(dá)到95%以上。本發(fā)明還涉及昆蟲抗菌肽衍生物Thanatin及其適用于藥用的鹽的用途，將上述結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽衍生物及其適用于藥用的鹽單獨(dú)或組合使用，作為治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染的藥物。本發(fā)明還涉及昆蟲抗菌肽衍生物Thanatin及其適用于藥用的鹽的用途，將上述結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽衍生物及其適用于藥用的鹽單獨(dú)或組合使用，作為其它藥物的輔料，或作為食品、化妝品和飼料的添加劑。有益效益本發(fā)明具有以下有益效益1.它們具有與天然昆蟲抗菌肽相同或者更強(qiáng)的抗菌活性。2.提供了一組昆蟲抗菌肽衍生物，擴(kuò)大了昆蟲抗菌肽衍生物的種類，獲得了一組具有較高抗菌活性的昆蟲抗菌肽衍生物。3.用基因工程技術(shù)制備具有較高抗菌活性的昆蟲抗菌肽衍生物，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。4.采用基因工程技術(shù)制備，對環(huán)境友好，無任何有害物質(zhì)產(chǎn)生。5.生產(chǎn)成本較低?；瘜W(xué)合成每毫克肽(21個氨基酸)需560元人民幣，而用本方法生產(chǎn)每毫克肽只需2元人民幣，大規(guī)模制備時成本甚至更低。6.在昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物表達(dá)載體構(gòu)建中，在目的基因的上游引入了凝血酶切割位點(diǎn)(LVPRGS)，當(dāng)用凝血酶切割后生成LVPR和GS，而GS恰好是Thanatin衍生物的頭2位氨基酸，巧妙的解決了工具酶切割后氨基酸剩余問題，大大簡化了下游的純化工藝。7.殺菌實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)和急性局部刺激實(shí)驗(yàn)表明，Tq對大腸桿菌肺、白色念珠菌，Ts和Ta對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(ESBL)、白色念;朱菌，Tqa對金黃色葡萄球菌及白色念珠菌，Tqs、Tqa、Tsa對白色念珠菌的抗菌活性大于Thanatin;6種昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物的濃度在2.5mg/ml時均未發(fā)生溶血反應(yīng)，產(chǎn)品安全性較高；具有較低的急性毒性刺激反應(yīng)。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例，具體說明本發(fā)明。本發(fā)明所用內(nèi)切酶、連接酶和其他分子生物學(xué)試劑購自Novagen公司。電泳、感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)方法，采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法進(jìn)行(薩姆布魯克(Sambrook,J.)等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)，北京，科學(xué)出版社，2002，8)。質(zhì)粒提取，采用上海生工試劑盒K192，按照使用說明進(jìn)行。實(shí)施例1表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化子的獲得按照常規(guī)方法分別合成引物(表l),根據(jù)引物不同配對用經(jīng)PCR方法合成Tq、Ts、Ta、Tqs、Tqa、Tsa6個基因，瓊脂lt電泳進(jìn)4亍分離，膠回收，得到目的片段。將目的片段依照說明書用BamHI和Xhol分別進(jìn)行雙酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖法回收相應(yīng)片段(《分子克隆》)，按說明書用T4DNA連接酶與相同酶切并回收的pET32a(+)相應(yīng)片段連接，獲得含編碼昆蟲抗菌肽衍生物DNA序列的表達(dá)載體；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選并鑒定轉(zhuǎn)化子，常規(guī)方法提取質(zhì)粒，送上海Invitrogen公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。所構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET32/Tq,apET32a/Ts，pET32a/Ta,pET32a/Tqs，pET32a/Tqa，pET32a/Tsa。表l引物序列引物號_DNA序列_目的基因SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTqNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTCAACGT-3，_SEQID5,-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCTGACCNO.2TACGTTGACAGTAGATTATC-3,SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTsNO.3CTGTCCCGATAATCTACTGTAACCGT-3'SEQID5,-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCGCTCCNO.4TACGGTTACAGTAGATTATC-3，_SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTaNO.3CTGTCCCGATAATCTACTGTAACCGT-3，SEQID5'-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTCCGTGACCNO.5TACGGTTACAGTAGATTATC-3'SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTqsNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTCAACGT-3'SEQID5，-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCGCTCCNO.4TACGGTTACAGTAGATTATC-3，_SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTqaNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTCAACGT-3'SEQID5，-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTCCGTGACCNO.5TACGGTTACAGTAGATTATC-3，_SEQID5，陽GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTsaNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTAACCGT-3'SEGID5，-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTCCGGCTCCN0.6TACGGTTACAGTAGATTATC-3，誘導(dǎo)表達(dá)，檢測鑒定將編碼6個Thanatin衍生物的陽性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子，接種于含Amp(50pg/ml)的LB肉湯20ml中培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD值達(dá)到0.6時，加入乳糖至終濃度8mM,37。C誘導(dǎo)表達(dá)6小時。5000rpm離心10分鐘，取沉淀。將沉淀溶于50mMTris-HCl和10mMNaCl(pH8.0)組成的緩沖液中，超聲破碎20min。將超聲后的溶液12000rpm離心20min，分別保留上清和沉淀用于電泳檢測。在24KDa分子量附近有明顯條帶(分子量約為2.4KDa),即為融合蛋白，主要集中在溶液上清中。融合蛋白的表達(dá)量分別占菌體總蛋白的48%(Tq),50%(Ts),42%(Ta)，31%(Tqs)，27%(Tqa)和56%(Tsa)。發(fā)酵罐中試放大按照下列條件，對工程菌進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)發(fā)酵體系10LLB培養(yǎng)基(AmplOO)ig/mL)。發(fā)酵方案LB平板上(AmplOOpg/mL)保藏菌種單克隆轉(zhuǎn)接至種子液，37°C,200r/min搖床培養(yǎng)7h,種子液按5:IOO的比例轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐；37°C,固定通氣量4L/min,培養(yǎng)約6小時至對數(shù)生長期，補(bǔ)料1LLB,同時加入誘導(dǎo)劑(IPTG0.1mmol/L)后繼續(xù)培養(yǎng)，5小時后放罐。SDS-PAGE顯示，融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的36%(Tq),32%(Ts),40%(Ta),42%(Tqs)，21%(Tqa)和37%(Tsa)。融合蛋白的酶切，分離純化將融合蛋白加入凝血酶緩沖液中，按1mg/lU用凝血酶進(jìn)行切割，酶切條件為25'C,16h。酶切完成后，用DEAE-sephadexA25陰離子交換柱分離，得到Thanatin衍生物粗品，冷凍干燥后，再經(jīng)高效液相制備儀(HPLC，C18柱)精制，獲得純品，其純度達(dá)到95%以上。以胰島素為對照，將產(chǎn)品按照Tricine-SDS-PAGE電泳方法電泳，檢測其分子量約為2.4KDa。實(shí)施例2抗菌活性的測定用滅菌生理鹽水配制濃度為6mg/ml多肽樣品溶液。試驗(yàn)用菌種分別接種于營養(yǎng)肉湯，于37。C培養(yǎng)24小時，臨用前用無菌生理鹽水作1:105倍稀釋，取12支細(xì)菌培養(yǎng)管并編號，于第1管中加入營養(yǎng)肉湯1.8ml，其余11管中均加入l.Oml肉湯。于第1管加入0.2ml多肽溶液，混勻后取出l.Oml加入到第2管中，如此反復(fù)，依次稀釋到第12管，每管各加菌液0.2ml，輕輕振搖均勻，置37。C培養(yǎng)24小時。以無菌生長的最低多肽濃度，作為抑制細(xì)菌生長的最低樣品濃度(MIC)。表2為實(shí)施例1中制備的Thanatin衍生物對幾種菌的最低抑菌濃度。表2昆蟲抗菌肽Thanatin及其衍生物最低抑菌濃度MIC(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例3多肽溶血活性的測定將人血紅細(xì)胞懸浮在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，得到紅細(xì)胞懸浮液(5。/。v/v)。將多肽溶解在磷酸鹽緩沖液中，配成約5mg/ml儲備液，取14支1.5ml離心管，于第1支離心管中加lml多肽儲備液，其余各管中加0.5ml磷酸鹽緩沖液，從第1管中取出0.5ml多肽儲備液加至第2管中，用微量混合儀混合均勻，再從第2管中取出0.5ml溶液加至第3管中混合均勻，以此類推，即以倍比稀釋法依次稀釋到第14管，棄去0.5ml，各管補(bǔ)加0.5ml配好的5。/。血紅細(xì)胞懸浮液至終體積1.0ml,輕輕搖勻，37。C恒溫箱中保溫60min后，于4000rpm離心10分鐘，取上清液在414nm下比色，以紅細(xì)胞懸浮在磷酸鹽緩沖液中為空白，以紅細(xì)胞懸浮在l%TritonX-100中為100%溶血。溶血百分率用下式計算溶血百分率==，100%溶血樣品的吸光度定義溶血百分率為50%時的多肽濃度為半數(shù)溶血劑量(HC5Q)。結(jié)果表明，Thanatin及其缺失突變體的HC5()>2.5mg/ml。實(shí)施例4兔眼結(jié)膜局部刺激實(shí)驗(yàn)取健康家兔6只，實(shí)驗(yàn)前先檢查眼結(jié)膜血管、角膜透明度及眼分泌物等狀況，選用正常者供試。將供試藥物用生理鹽水配制成等滲。取實(shí)施例1中制備的抗菌肽各0.1ml(5mg/ml)滴入左眼結(jié)膜嚢中，停留2min;右眼滴入同量生理鹽水作為對照。使用放大鏡觀察給藥后1、24、48、72h的眼部情況。結(jié)果顯示，至72h時，兔眼角膜無渾濁，虹膜正常，結(jié)膜無充血水腫，無分泌物出現(xiàn)。表明藥液對兔眼無急性刺激作用。SEQUENCELISTING<110>沈，子龍<120>昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其制備方法與用途<130>USP6770798<160>6<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>21<212>PRT<213>昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物1<400>1GlySerLysLysProValProHelieTyrCysGinArgArgThrGly151015LysCysGinArgMet20<210>2<211>21<212>PRT<213>昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物2<400>2GlySerLysLysProValProlielieTyrCysAsnArgArgSerGly151015LysCysGinArgMet20<210>3<211>21<212>PRT<213>昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物3<400〉3GlySerLysLysProValProlielieTyrCysAsnArgArgThrAla151015LysCysGinArgMet20<210〉4<211>21<212>PRT<213>昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物4<400>4GlySerLysLysProValProlielieTyrCysGinArgArgSerGly151015LysCysGinArgMet20<210>5<211>21<212>PRT<213>昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物5<400>5GlySerLysLysProValProHeHeTyrCysGinArgArgThrAla151015LysCysGinArgMet-20<210>6<211>21<212>PRT<213〉昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物6<400>6GlySerLysLysProValProlielieTyrCysAsnArgArgSerAla151015LysCysGinArgMet20<210>7<211>59<212>DNA<213〉引物l<400>7gcggatccctggtgccgcgcggcagcaagaagcctgtcccgataatctactgtcaacgt59<210>8<211>54<212>DNA<213>引物2<400>8cgctcgagttacatacgctggcacttacctgacctacgttgacagtagattatc54<210>9<211>59<212>DNA<213>引物3<400>9gcggatccctggtgccgcgcggcagcaagaagcctgtcccgataatctactgtaaccgt59<210>10<211>54<212>DNA<213>引物4<400>10cgctcgagttacatacgctggcacttaccgctcctacggttacagtagattatc54<210>11<211>54<212>DNA<213>引物5<400>11cgctcgagttacatacgctggcacttccgtgacctacggttacagtagattatc54<210>12<211>54<212>DNA<213>引物6<400>12cgctcgagttacatacgctggcacttccggctcctacggttacagtagattatc5權(quán)利要求1.一組具有如下結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽①Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tq)；②Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Ts)；③Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Ta)。④Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tqs)；⑤Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tqa)；⑥Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tsa)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽，其特征在于組成上述結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽衍生物的氨基酸是L型或者D型異構(gòu)體。3.昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物的制備方法，該制備方法是基因工程方法，其步驟包括編碼昆蟲抗菌肽衍生物氨基酸DNA序列的合成，基因片段的連接，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，發(fā)酵，分離純化及冷凍干燥得產(chǎn)品。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物的制備方法，其特征在于用PCR方法合成帶有凝血酶切割位點(diǎn)的6種Thanatin衍生物基因，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子，用8mM乳糖3^C誘導(dǎo)表達(dá)6小時，獲得的融合蛋白表達(dá)量分別占菌體總蛋白的48%(Tq)，50%(Ts),42%(Ta)，31%(Tqs),27%(Tqa)和56%(Tsa);用IOL發(fā)酵罐放大，種子液按5:IOO的比例接種，37°C,固定通氣量4L/min,培養(yǎng)6小時后補(bǔ)料，O.lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)5小時后放罐，融合蛋白表達(dá)量分別占菌體總蛋白的36%(Tq)，32%(Ts),40%(Ta)-，42%(Tqs),21%(Tqa)和37%(Tsa);所得融合蛋白經(jīng)凝血酶切割、陰離子交換柱分離，得到粗品，再經(jīng)高效液相制備儀精制，獲得Thanatin衍生物純品，其純度達(dá)到95%以上。5.昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽的用途，其特征在于將上述結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽衍生物及其適用于藥用的鹽單獨(dú)或組合使用，作為治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染的藥物。6.昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽的用途，其特征在于將上述結(jié)構(gòu)的昆蟲抗菌肽衍生物及其適用于藥用的鹽單獨(dú)或組合使用，作為其它藥物的輔料，或作為食品、化妝品和飼料的添加劑。全文摘要本發(fā)明涉及一組有抗菌作用的昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物及其適用于藥用的鹽，以及它的制備方法和用途。殺菌實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)和急性局部刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，昆蟲抗菌肽Thanatin衍生物對大腸桿菌肺、白色念珠菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性大于Thanatin；濃度為2.5mg/ml時未發(fā)生溶血反應(yīng)，無急性毒性刺激反應(yīng)。文檔編號C07K14/435GK101173005SQ20071016520公開日2008年5月7日申請日期2007年10月30日優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日發(fā)明者吳國球,沈子龍申請人:沈子龍