專利名稱：表達(dá)殺昆蟲和殺真菌凝集素的基因工程化棉花細(xì)胞、植株和種子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在棉花細(xì)胞、植株和種子中表達(dá)的嵌合基因，其編碼實質(zhì)性具備大麥、蕁麻和橡膠蛋白(hevein)凝集素之昆蟲毒性和真菌毒性的殺昆蟲劑和殺真菌劑。
背景技術(shù)：
殼多糖結(jié)合蛋白質(zhì)(凝集素)在包括單子葉和雙子葉的許多種植物中存在，盡管這些植物中不含有殼多糖。認(rèn)為它們與防御相關(guān)，其中許多呈現(xiàn)殺昆蟲和/或抗真菌活性(Murdock等，1990；Lerner,D.R.和Raikhel,N.V.,1992)。凝集素表現(xiàn)出特異性的碳水化合物結(jié)合特性。推測植物中的凝集素是防御相關(guān)蛋白質(zhì)，它們通過與易感害蟲類的N-乙酰葡糖胺結(jié)合來發(fā)揮其作用(Schroeder,M.R.和Raikhel,N.V.1992)。
純化形式的大麥、蕁麻和橡膠蛋白凝集素表現(xiàn)出對某些已知的侵害棉花的害蟲(例如實夜蛾屬和鐮孢屬)殺昆蟲和殺真菌活性。用凝集素控制害蟲的方法有很多，但是這些方法都需要提供足夠量和足夠純度的蛋白質(zhì)方可取得控制靶害蟲或病原體的效果。即使有足夠量和足夠純度的蛋白質(zhì)可用，尚須將它們以有效地到達(dá)靶物種的方式應(yīng)用于作物。此外，由于凝集素是蛋白質(zhì)，如果局部提供給作物，在它們發(fā)揮控制作用之前已被光及蛋白酶所滅活。而根部相關(guān)的病原體不容易以這種制劑來處理。因而，凝集素還不能用于控制棉花的許多嚴(yán)重的害蟲，盡管在足夠純度和足夠高濃度時他們可能是有效的。
利用基因工程，可以將負(fù)責(zé)產(chǎn)生有用多肽的基因從天然含此基因的供者細(xì)胞轉(zhuǎn)移至天然無此基因的宿主細(xì)胞中；Cohen和Boyer,U.S.專利號4,237,224和4,468,464。實際上這種轉(zhuǎn)移沒有內(nèi)在限制。基因可以在病毒、細(xì)菌、植物和動物之間轉(zhuǎn)移。在某些例子中被轉(zhuǎn)移的基因是有功能的，或者說可以使它們在宿主細(xì)胞中有功能。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，有時可從轉(zhuǎn)移的細(xì)胞再生出整株植物。
基因一般包含帶啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA序列區(qū)，轉(zhuǎn)錄區(qū)通常包含5′非翻譯區(qū)，編碼區(qū)和3′非翻譯區(qū)。
啟動子包含轉(zhuǎn)錄起始所必須的DNA序列。轉(zhuǎn)錄期間將轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)變成mRNA。在真核細(xì)胞中，啟動子包括RNA多聚酶的識別區(qū)和定位RNA多聚酶在DNA上起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。后者被稱為TATA盒，通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約30個核苷酸處。
啟動子區(qū)后是可轉(zhuǎn)錄成mRNA但不翻譯成多肽的序列。這段序列組成了所謂的5′非翻譯區(qū)，認(rèn)為該區(qū)域含負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的序列，如核糖體結(jié)合位點。
編碼區(qū)是緊接著DNA或相應(yīng)RNA的5′非翻譯區(qū)的下游序列。按照遺傳密碼編碼區(qū)被翻譯成多肽，例如蘇云金芽孢桿菌包含一種帶可翻譯成殺昆蟲的晶體蛋白質(zhì)氨基酸序列的編碼序列的基因。
在編碼區(qū)之后有一段可轉(zhuǎn)錄成mRNA但不能翻譯成多肽的序列，該序列稱為3′非翻譯區(qū)，認(rèn)為此區(qū)包含導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止的信號和，在真核細(xì)胞的mRNA中引起轉(zhuǎn)錄后mRNA鏈聚腺苷酸化的信號。認(rèn)為mRNA聚腺苷酸化具有加工處理和轉(zhuǎn)運的功能。
可將整個天然基因從供者細(xì)胞轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中。但通常優(yōu)選地是構(gòu)建以帶一種啟動子、和任選地帶該基因中本身不存在的5′和3′非翻譯區(qū)的目的編碼區(qū)為編碼區(qū)的基因，這種構(gòu)建體就是所謂的嵌合基因。
大麥凝集素是一種液泡蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)合成時氨基末端帶有引導(dǎo)其進入分泌通路的信號序列，和引導(dǎo)其正確地靶向液泡所必需的羧基末端前肽(Bednarek,S.Y.，和Raikhel,N.V.,1991)。這個糖基化的羧基末端前肽(CTPP)在成熟、有活性的蛋白質(zhì)于液泡內(nèi)沉積之前或同步被切除(Bednarek等1990)。成熟的大麥凝集素是由兩個分子量為18千道爾頓的相同多肽組成的二聚體蛋白質(zhì)(Wilkins,T.A.,Bednarek,S.Y.和Raikhel,S.V.,1990)。大麥凝集素編碼區(qū)(大麥凝集素cDNA克隆BLc3)的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列已有報道(見Lerner和Raikhel,1989；和U.S.專利5,276,269，在此引入作為參考)。將BLc3編碼區(qū)與CaMV 35S啟動子融合創(chuàng)造嵌合基因構(gòu)建體，并以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將該嵌合基因構(gòu)建體導(dǎo)入煙草植物(U.S.專利號.5,276,269)。據(jù)報道該植物顯現(xiàn)出殺昆蟲和殺真菌的特性。
已從橡膠樹(Hevea brasiliensis)的膠乳cDNA文庫中分離到編碼橡膠樹凝集素的全長cDNA克隆(HEV1)，并測定其序列，分析其性質(zhì)(見Broekaert等，1990；Lee等，1991；U.S.專利5,187,262，在此引入作為參考)。簡而言之，HEV1長度為1018個核苷酸，并包含204個氨基酸的開放閱讀框。推導(dǎo)出的氨基酸序列包含一段17個氨基酸殘基組成的推定信號肽，其后接187個氨基酸的多肽。該蛋白質(zhì)氨基端的43個氨基酸殘基與橡膠蛋白相同，并且與幾種殼多糖結(jié)合蛋白質(zhì)和馬鈴薯及楊樹創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因的氨基端具有同源性。以HEV1 cDNA作為探針進行Northern印跡分析，結(jié)果表明該基因是受創(chuàng)傷、植物激素脫落酸和乙烯誘導(dǎo)的基因。該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積聚見于葉片、莖和膠乳中，而在根中未見到。將橡膠蛋白編碼區(qū)與異源啟動子融合而成的嵌合基因構(gòu)建體未見報道。但橡膠蛋白的實驗表明它具有抗木霉、須霉屬、葡萄孢屬、殼針孢屬、梨孢屬(Pyricularia)和鐮孢屬真菌的活性。所觀察到的活性與麥芽胚凝集素的活性(另一類凝集素)不同。此外，橡膠蛋白的抗真菌活性在90℃加熱后仍然穩(wěn)定，而在此條件下某些殼多糖酶的活性則完全被破壞。
已分離到編碼蕁麻凝集素(Urtica dioica凝集素)的全長cDNA，并測定了其序列和分析其性質(zhì)(Lerner和Raikhel,1992)。該蛋白質(zhì)由374個氨基酸組成，其中21個氨基酸是推定的信號肽序列，84個氨基酸編碼蕁麻凝集素的兩個殼多糖結(jié)合區(qū)，它們與由19個氨基酸組成的“間隔”區(qū)和與殼多糖酶催化域部分相同的244個氨基酸組成的羧基端延伸區(qū)相融合。該基因代表另一種凝集素，迄今未被用作一種抗棉花害蟲和真菌病原體的資源。
上述研究低估了植物凝集素的生物化學(xué)復(fù)雜性。這類蛋白質(zhì)必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)丶庸?，并被轉(zhuǎn)運到適當(dāng)?shù)膩喖?xì)胞區(qū)室，液泡通常是這類蛋白質(zhì)的貯存場所。為了利用這些蛋白質(zhì)消滅棉花害蟲，一種有生命力的方法是用不同的凝集素基因產(chǎn)生嵌合基因構(gòu)建體，并用有效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(如見方法Rangan等，U.S.專利5,244,802)將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至棉花內(nèi)。在異源系統(tǒng)內(nèi)不一定能夠獲得高效的表達(dá)水平。不能保證這些蛋白質(zhì)對棉花作物本身不具有未預(yù)料到的毒性作用，或這些蛋白質(zhì)將顯現(xiàn)預(yù)測的活性。甚至如上所述，一些靶害蟲可攻擊生產(chǎn)凝集素的植物中正常不表達(dá)某些凝集素的組織(如根)。在局部提供給植物組織之后的飼養(yǎng)試驗中(見Cavalier等，U.S.專利5,407,454)表現(xiàn)出抗某種害蟲的活性的凝集素，當(dāng)它們在體內(nèi)表達(dá)時可能不展現(xiàn)相同的活性。
Cavalieri等人提供了稍有啟發(fā)性的證據(jù)，即很多種植物凝集素具有一定的抗某些谷物害蟲的能力。但不幸的是這些研究是以分離的生物化學(xué)性質(zhì)未確定的凝集素制劑來進行的。而一些凝集素是由商家提供的，因而它們的組成也因不同的制劑而變。商家的產(chǎn)品含批號，故以批號為線索，問題可追溯到批號。Cavalier沒有探討制劑的純度，他們也沒有提供如何獲得凝集素的資料，或探討特定的制劑中可能存在的不同凝集素的實際種數(shù)。任何種類的植物都可產(chǎn)生幾種不同的凝集素，蛋白質(zhì)制劑中容易污染多種不同種類的蛋白質(zhì)，盡管這些蛋白質(zhì)是痕量的，但它們可能對所觀察到的活性具有明顯的陰性或陽性影響，因而所試用的制劑實際上可能是多種凝集素的混合物，甚至含有來自所討論植物的其它蛋白質(zhì)。沒有提供有關(guān)所試用凝集素制劑之來源、純度或所觀察到的實際活性是基于特定植物的哪一種凝聚素基因的資料。這種制劑的殺昆蟲活性和殺真菌活性可能明顯區(qū)別于自單個凝集素基因在植物中表達(dá)所提供的純化形式的凝集素之活性。
提供一種純化形式的蛋白質(zhì)并確定其抗特定害蟲活性的最佳方法是，分離該蛋白質(zhì)的基因并在體外系統(tǒng)中表達(dá)該蛋白。由于Cavalier等人研究中引用的多數(shù)凝集素基因迄今還沒有被克隆，在Cavalier等人報道其資料的當(dāng)時，在體外表達(dá)單個純化的凝集素進行試驗是不可能的。盡管就某些谷物害蟲而論他們的資料有啟發(fā)意義，但是Cavalier等人沒有提供一個具抗嚴(yán)重棉花害蟲之活性的例子。因此，Cavalier等人的工作雖然有啟發(fā)性，但是沒有揭示人們可用純化形式的單種凝集素控制嚴(yán)重的棉花害蟲。
相反地，在局部提供給植物組織之后的飼養(yǎng)試驗中沒有活性的蛋白質(zhì)，當(dāng)在體內(nèi)表達(dá)時也可能有活性。在棉花中尤其可能，棉花植株中通常表達(dá)一種稱為棉酚的化合物，已知它可抑制某些昆蟲的攝食。因此，棉酚和凝集素可能具有協(xié)同作用，從而可以加強特定凝集素抗重要棉花害蟲的殺昆蟲活性?；蛘?，棉酚表達(dá)可以抑制害蟲攝食，足以使害蟲不能消耗潛在致死劑量的凝集素，因此，只有在創(chuàng)造出這種棉花細(xì)胞、植株和種子之后，人們才有可能了解一種轉(zhuǎn)化到棉花中的凝集素基因之殺昆蟲或殺真菌效果。
Raikhel(U.S.專利5,276,269)表明在CaMV 35S啟動子控制下的嵌合大麥凝集素基因可以轉(zhuǎn)化到煙草植株中，并產(chǎn)生被正確地轉(zhuǎn)運的單一種類的凝集素蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生一種具有新的殺昆蟲和殺真菌特性的植株。隨著更具實用性的橡膠蛋白(Raikhel,U.S.專利5,187,262)和蕁麻基因的克隆(Lerner和Raikhel,1992)，現(xiàn)在已經(jīng)有可能創(chuàng)造出可表達(dá)高純度的每種凝集素的棉花，并有可能檢測這些細(xì)胞、植物和種子中存在的新的殺昆蟲和殺真菌活性。
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供一種可表達(dá)一定量的嵌合大麥、蕁麻和橡膠蛋白凝集素基因的棉花細(xì)胞、植株和種子，在一定的條件下它們足以實質(zhì)性地賦予所述棉花細(xì)胞、植株和種子如同大麥、蕁麻和橡膠蛋白凝集素的殺昆蟲和殺真菌特性的殺蟲特性。
本發(fā)明更進一步的目的是提供一種以含嵌合基因的棉花細(xì)胞、植株和種子飼養(yǎng)昆蟲害蟲和病原體的殺死棉花昆蟲害蟲和病原體的方法，其中該嵌合基因可表達(dá)殺害蟲(如殺昆蟲和殺真菌)量的實質(zhì)性具有大麥、蕁麻和橡膠蛋白凝集素的昆蟲毒性和真菌毒性的毒素。
本發(fā)明的另一個目的是提供與上述方法相關(guān)的棉花細(xì)胞、植株和種子中的基因和其它DNA片段。
發(fā)明概述通過提供可以在棉花細(xì)胞、植株和種子中表達(dá)一種多肽的嵌合基因，該多肽在培養(yǎng)的植物細(xì)胞和活植株的植物細(xì)胞和種子中實質(zhì)性具有大麥、蕁麻和橡膠蛋白凝集素的殺害蟲毒性(如殺昆蟲毒性)和殺真菌毒性；以及生產(chǎn)在棉花細(xì)胞、植株和種子中實質(zhì)性具有大麥、橡膠蛋白和蕁麻凝集素的殺昆蟲特性(如害蟲毒性和真菌毒性)的毒素的方法；和以包含表達(dá)這些毒素的基因的棉花細(xì)胞、植株和種子飼養(yǎng)害蟲如昆蟲而殺死棉花害蟲的方法，實現(xiàn)了本發(fā)明的這些和其它目的。
附圖簡述

圖1表示二元植物表達(dá)載體pGA643(An等，1988描述)的基因圖譜和35S啟動子區(qū)，該載體在植物中表達(dá)凝集素是有用的(Wilkins等，1990；Raikhel,U.S.專利號5,276,269，在此引入作為參考)。
圖2表示大麥凝集素cDNA克隆BLc3的核苷酸序列(Lerner和Raikhel,1989；Raikhel,U.S.專利號5,276,269)。
圖3表示橡膠蛋白cDNA克隆“HEV1” 的核苷酸序列(Broekaert等，1990；Raikhel,U.S.專利號5,187,262，在此引入作為參考)圖4表示蕁麻凝集素cDNA克隆MK209的核苷酸序列(Urticadioica凝集素；Lerner,D.R.和Raikhel,N.V.,1992，在此引入作為參考)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及可在棉花細(xì)胞、植株和種子中表達(dá)的嵌合基因，其編碼實質(zhì)性具有大麥、蕁麻和橡膠蛋白凝集素之昆蟲毒性和真菌毒性的殺蟲劑如殺昆蟲劑和殺真菌劑。
涉及的棉花植物細(xì)胞包括外源基因可以被導(dǎo)入、復(fù)制和表達(dá)的任何和所有棉花植物的細(xì)胞。一些合適的棉花植物種類的例子包括陸地棉、樹棉和海島棉。
術(shù)語“植物細(xì)胞”指來自棉花植物的任何細(xì)胞。本發(fā)明包含的細(xì)胞的一些例子包括作為一種活植物部分的分化細(xì)胞；在培養(yǎng)中的未分化細(xì)胞，諸如愈傷組織或腫瘤；種子；胚；無性芽和花粉等未分化組織的細(xì)胞。
本發(fā)明的嵌合基因包含一種在棉花植物中能夠有效發(fā)揮功能的啟動子區(qū)域，和pBLc3編碼的大麥凝集素的編碼區(qū)，cDNA克隆HEV1中編碼的橡膠蛋白凝集素的編碼區(qū)和/或cDNA克隆MK209中編碼蕁麻凝集素的編碼區(qū)。嵌合基因的編碼區(qū)序列在天然基因中與所述啟動子是不相關(guān)聯(lián)的。
5′和/或3′非翻譯區(qū)可以獨立地與啟動子或編碼區(qū)天然相關(guān)聯(lián)，或者與兩者都不相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選5′或3′非編碼區(qū)與天然基因中的啟動子相關(guān)聯(lián)，最優(yōu)選地，5′和3′區(qū)都與天然基因中的啟動子相關(guān)聯(lián)。
基于本發(fā)明產(chǎn)生時的技術(shù)狀況，尚無法預(yù)見到嵌合的大麥、橡膠蛋白或凝集素基因能夠功能性地導(dǎo)入棉花細(xì)胞，更未預(yù)見到這樣的細(xì)胞可表達(dá)足以賦予細(xì)胞殺蟲(殺昆蟲或殺真菌)特性的凝集素。
所謂具殺蟲性(如殺昆蟲或真菌)是指，植物細(xì)胞必須含有殺昆蟲或殺真菌量的實質(zhì)性具有自大麥、蕁麻、橡膠中純化的凝集素之殺昆蟲和殺真菌活性的凝集素?！皩嵸|(zhì)性具有純化凝集素的殺昆蟲和殺真菌活性”是指顯示出與自天然宿主中純化的相應(yīng)凝集素基本相同范圍的抗昆蟲或真菌活性。殺昆蟲或殺真菌量指植物細(xì)胞中存在的能夠殺死昆蟲或真菌，或至少能夠顯著地抑制害蟲的一種生長所必需之功能(如攝食)的劑量，與對照相比這種抑制作用在統(tǒng)計學(xué)上應(yīng)該有顯著性差異。因此，與不含有可產(chǎn)生大麥凝集素、橡膠蛋白或蕁麻凝集素之基因的植物細(xì)胞、植株或種子相比較，在不應(yīng)用或少應(yīng)用純化的大麥凝集素、橡膠蛋白、蕁麻凝集素或其它的殺昆蟲或殺真菌劑的條件下，本發(fā)明的植物細(xì)胞、植株或種子可以經(jīng)受棉花害蟲如昆蟲、線蟲或真菌的攻擊。
以下的實施例是對本發(fā)明主題的某些實施方案的舉例說明。這些實施例是例證性的，不能理解為以任何方式限制本發(fā)明。實施例1基因本研究評估了三種不同的嵌合植物凝集素基因(大麥、橡膠蛋白和蕁麻)。每種嵌合基因包含由在棉花中有活性的啟動子驅(qū)動的特定凝集素之cDNA。為方便起見，應(yīng)用CaMV 35S啟動子，但是任何被證明在棉花中有活性的啟動子，如根癌農(nóng)桿菌T-DNA啟動子，發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA啟動子或棉花葉綠素A/B結(jié)合蛋白基因啟動子(Anderson等，1993)都有用。該列舉僅是示范性的，并非有意包含所有的啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用其它有用的啟動子在適當(dāng)?shù)拿藁?xì)胞、植株和種子中表達(dá)大麥、橡膠蛋白和蕁麻凝集素以控制成問題的棉花害蟲，如昆蟲和真菌。
按如下方法構(gòu)建包含有效地連接在CaMV 35S啟動子上的大麥凝集素編碼區(qū)的表達(dá)盒利用pBLc3和pGA643中的Xbal限制性內(nèi)切酶位點，將pBLc3 cDNA序列(圖2)連接入植物克隆載體pGA643(圖1；An等，1988)，如Raikhel,U.S.專利號5,276,269中描述的，此處引入作為參考。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α。利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和DNA序列分析以確定相對啟動子區(qū)的插入片段編碼區(qū)正確取向。包含在pGA643中的大麥凝集素編碼區(qū)cDNA pBLc3的克隆可得自N.Raikhel博士，密歇根州立大學(xué)，MSU-DOE植物研究實驗室，東蘭辛，MI,48824。
按如下方法構(gòu)建包含有效地連接在CaMV 35S啟動子上的橡膠蛋白(橡膠樹凝集素)編碼區(qū)的表達(dá)盒先以XbaⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶從HEV1切下插入片段，切開pGA643的多接頭區(qū)，后將橡膠蛋白的cDNA序列HEV1(圖3；Broekaert,1990；Raikhel,U.S.專利號5,187,262)連入植物克隆載體pGA643(圖1；An等，1988)中。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α。利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和DNA序列分析以確定相對啟動子的插入片段編碼區(qū)正確取向。包含插入pGA643中的HEV1 cDNA的克隆可得自N.Raikhel博士，密歇根州立大學(xué)MSU-DOE植物研究實驗室，東蘭辛，MI,48824。
包含有效地連接在CaMV 35S啟動子上的蕁麻凝集素編碼區(qū)的表達(dá)盒是通過將蕁麻cDNA序列(圖4)連入植物克隆載體pGA643(圖1；An等，1988)構(gòu)建而成。具體方法是以Xbal限制性內(nèi)切酶從蕁麻cDNA克隆MK209中切下插入片段，并將該片段連入pGA643多接頭區(qū)內(nèi)的Xbal限制性內(nèi)切酶位點之中。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α。利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和DNA序列分析以確定相對啟動子的插入片段編碼區(qū)正確取向。蕁麻cDNA克隆MK209和包含插入pGA643中的蕁麻編碼區(qū)的克隆可得自N.Raikhel博士，密歇根州立大學(xué)MSU-DOE植物研究實驗室，東蘭辛，MI,48824。
利用攜有具寬廣宿主范圍的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRK2013(Clonetech,PaloAlto,California)的大腸桿菌菌株HB101通過三親株接合(Hooykaas,P.J.J,1988)將以上三個二元載體構(gòu)建體從大腸桿菌菌株DH5α轉(zhuǎn)移至根癌農(nóng)桿菌LBA4404。在含卡那霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(12.5μg/ml)的基本營養(yǎng)平板上(An等，1988)選擇轉(zhuǎn)結(jié)合子。用嵌合凝集素基因轉(zhuǎn)化棉花先用70％乙醇處理種子3分鐘，然后用含0.01％表面活性劑TWEEN-20的20％CLOROX溶液(1％可用氯)處理種子20分鐘，進行表面滅菌。在26±2℃、16小時光照(40-60μE m-2s-1)和8小時黑暗條件下，在含1mg/l激動素的瓊脂固化的(TC瓊脂，Hazleton Biologics,Lenexa,KS)White′s培養(yǎng)基(Singh和Krikorian,1981)上培養(yǎng)幼苗。先按Rangan(U.S.專利號5,244,802)的方法從幼苗外植體建立胚性愈傷組織培養(yǎng)物。簡而言之，將來源于7到10日齡幼苗的子葉和下胚軸外植體放置在添加了0.4mg/l鹽酸硫胺素、30g/l葡萄糖、2.0mg/l α-萘乙酸(NAA)、1.0mg/l激動素、100mg/l肌醇和0.8％(w/v)瓊脂的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS,Murashige和Skoog,1962)上，該培養(yǎng)物在內(nèi)環(huán)境調(diào)控的培養(yǎng)箱(Percival,Boone,IA)中在16小時光照和8小時黑暗，光強度為60μE m-2s-1、27±2℃的條件下培養(yǎng)。三到四周內(nèi)在這些外植體上形成愈傷組織，每三到四周，在以蔗糖(20g/l)替代葡萄糖作為碳源的上述相同培養(yǎng)基上選擇性的傳代培養(yǎng)愈傷組織塊以富集易碎的、微黃綠色的愈傷組織?；谄贩N不同，在起始后經(jīng)1-4次傳代培養(yǎng)出現(xiàn)能形成小球狀體細(xì)胞胚的胚性愈傷組織。每三到四周在含有100mg/l肌醇、20g/l蔗糖、2.0mg/l NAA和0.8％(w/v)瓊脂的MS培養(yǎng)基(維持培養(yǎng)基)上以常規(guī)傳代培養(yǎng)維持和擴增胚性愈傷組織。
將分散良好的胚性愈傷組織培養(yǎng)物在以旋轉(zhuǎn)振蕩器(NewBrunswich G-10,Edison,NJ)攪動(120rpm,27±2℃)的液體維持培養(yǎng)基上開始細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
每周定期地去除游離的漂浮細(xì)胞和大團塊(≥840μm)以富集小體積、等直徑、細(xì)胞質(zhì)致密和高度胚性化的懸浮培養(yǎng)物。在使用前兩天，將這些培養(yǎng)物在含40ml維持培養(yǎng)基的250ml Erlenmeyer瓶中傳代培養(yǎng)。在我們實驗中使用的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物是快速生長的胚性細(xì)胞，在4-6天(在傳代培養(yǎng)二天后進入對數(shù)生長期)內(nèi)，凈重加倍。用于biolistic轉(zhuǎn)化實驗的所有細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物累計年齡為3-4個月。實施例3胚胎發(fā)生棉花培養(yǎng)物的Biolistic轉(zhuǎn)化用三種質(zhì)粒(在pGA643中的大麥凝集素編碼區(qū)，在pGA643中的橡膠蛋白編碼區(qū)，在pGA643中的蕁麻凝集素編碼區(qū))包被1.0μM金微粒，然后用一種改良的氦氣驅(qū)動的biolistic裝置(PDS,1000/He；BioRad)注射到胚胎發(fā)生棉花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中。簡單地說，用50μl金微載體懸浮物(1μ金微粒)的水溶液。在一1.5ml微量離心管中，在持續(xù)渦旋的條件下，依次加入5μl DNA(1μg/μl),50μl 2.5M的CaCl2和20μl 0.1M的亞精胺(游離堿，組織培養(yǎng)純)，繼續(xù)渦旋3分鐘，在10,000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10秒以沉淀微載體，盡可能地棄去上清。以250μl 100％乙醇(HPLC或光譜級)輕輕旋轉(zhuǎn)洗滌微載體，接著離心、棄上清。用60μl 100％乙醇重懸微載體。每個大載體板加入7.5μl DNA包被的微載體混合物。
按Hamilton等(8)描述的方法，用1550psi的膜穿透壓和其它參數(shù)設(shè)置進行轟擊。將提前兩天傳代培養(yǎng)的如上所述建立的細(xì)胞懸液(＜840μm組分)，呈一薄層真空沉淀在滅菌Petri皿內(nèi)(直徑5.5cm)的濕潤試紙(Whatman No.1；3.5cm直徑)上。每個培養(yǎng)皿中加入1ml懸浮細(xì)胞(1×106個細(xì)胞)。在懸浮液表面上放一400目的尼龍網(wǎng)作為隔板。最適的轟擊條件包括應(yīng)用10Mpa的穿孔盤，細(xì)胞懸液和隔離網(wǎng)間距為7.5cm，大載體運行間距為10mm。在轟擊時，樣品室的真空壓為95Kpa，以2天的間隔重復(fù)轟擊細(xì)胞3-5次以使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大。
微粒轟擊之后，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在不含任何選擇性的維持培養(yǎng)基上生長一周。二元載體pGA643帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因可用來篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(圖1)。因此，可用抗生素G418(10μg/μl)篩選細(xì)胞懸液。以抗生素G418篩選時，每周逐漸提高濃度。G418的篩選濃度從10μg/ml起，每隔5-7天提高10μg/ml，三到四周后終濃度達(dá)到50μg/ml。可選擇地，在有些實驗中，在篩選伊始時細(xì)胞直接暴露在一種高濃度的抗生素中(G418,50μg/ml)。在選擇性試劑的存在下，獨立的轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生單獨生長的集落。單獨培養(yǎng)每個克隆，并以NPTIIELISA(Firoozabady等，1987)驗證真正的轉(zhuǎn)化子。按Rangan等，U.S.專利號5,593,036(此處引入作為參考)描述的方法，從胚性懸浮培養(yǎng)物再生棉花植物。實施例4用凝集素基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌通過如前所述的三親株接合將三種二元載體質(zhì)粒(含大麥凝集素編碼區(qū)的pGA643，含橡膠蛋白編碼區(qū)的pGA643，含蕁麻凝集素編碼區(qū)的pGA643)轉(zhuǎn)移至二元根癌農(nóng)桿菌宿主菌株LBA4404中。有很多種方法(Firoozabady等，1987；Umbeck等，1987；Rangan等，U.S.專利號5,244,802)可用來實現(xiàn)棉花原代外植體的轉(zhuǎn)化。為了方便起見，簡單地描述經(jīng)Rajasekaran等，1996改良的Rangan等，U.S.專利號5,244,802的方法。
在50ml YEB液體培養(yǎng)基中接種冷凍的甘油貯存菌液(500μl)開始培養(yǎng)用于轉(zhuǎn)化實驗的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物在26±2℃，旋轉(zhuǎn)搖床上生長過夜，約18小時。在使用前用液體MS培養(yǎng)基調(diào)節(jié)光密度(A600)值至0.6-0.8。
以5-7日齡的幼苗制備農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的子葉(1cm2)外植體。用如上制備的農(nóng)桿菌懸浮液處理外植體15-30分鐘，吸干，然后鋪于放置在裝在直徑為15cm的Petri培養(yǎng)皿內(nèi)含60ml新鮮配制的瓊脂固化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Rangan U.S.專利號5,244,802)上直徑為12cm的濾紙(Whatman No.1)上。26±2℃,60-90μE m-2s-1，光照16h的條件下，在Percival培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)48小時。共培養(yǎng)后，以含200mg/l氨噻肟頭孢霉素(Cal-Biochem)和200mg/l羧芐青霉素(Sigma)的MS液體培養(yǎng)基徹底洗外植體，吸干，然后置于新鮮配制的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基中含有抗生素G418(10mg/l；Gibco BRL,LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)為篩選試劑，并加入如上相同濃度的氨噻肟頭孢霉素和羧芐青霉素以控制細(xì)菌的生長。每個含25ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的Petri平皿上(直徑9cm)種植7個子葉段。經(jīng)第一次傳代培養(yǎng)后，將該外植體移入新鮮配制的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在選擇壓的存在下促進更多的愈傷組織生成。轉(zhuǎn)化后3-8周轉(zhuǎn)化(抗生素抗性)的愈傷組織形成，將單個的愈傷組織集落進行分別傳代培養(yǎng)以保持每個整合事件的一致性。按照Firoozabady等，1987的方法進行NPTⅡ ELISA實驗，驗證抗生素抗性愈傷組織集落確已轉(zhuǎn)化。依照已報道的方法(Rangan等，U.S.專利號5,244,802)從轉(zhuǎn)化的集落再生植株。結(jié)果實施例5鑒定凝集素基因轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞如上所述，以pGA643中的大麥、蕁麻或橡膠蛋白凝集素基因轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞系(胚性集落)在培養(yǎng)中保持獨立的克隆并以NPTⅡ ELISA證實已被轉(zhuǎn)化。為證實在所使用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中適宜的凝集素基因與選擇性標(biāo)記的共轉(zhuǎn)化，以大體上與Raikhel等，1984相似的雙結(jié)合ELISA，但改良后更適用于轉(zhuǎn)化了的棉花細(xì)胞，檢測了數(shù)個以BLc3轉(zhuǎn)化的NPTⅡ ELISA陽性集落。
商業(yè)上有售的小麥胚芽凝集素抗體，與大麥凝集素有交叉反應(yīng)(Wilkins等，1990)，因此，能夠用在以WGA ELISA法檢測BLc3蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞中的表達(dá)。在WGA ELISA檢測轉(zhuǎn)化時，在最初以轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞的研究中已觀察到棉花的抽提物可產(chǎn)生高背景。發(fā)展了以下方案以克服這種背景問題，從而可應(yīng)用本發(fā)明方法確定凝集素基因和抗生素標(biāo)記基因的共轉(zhuǎn)移。
兔抗小麥胚芽凝集素(6mg/ml)和生物素化的兔抗WGA(3.5mg/ml)購自E.Y Laboratories。以11ml碳酸鹽結(jié)合緩沖液(Na2CO31.59g,NaHCO32.93g，加水至1升，pH9.6)稀釋1.8μl兔抗WGA抗體儲存液制備一抗溶液(1μg/ml)并保存在冰上。向96孔ELISA板(Corning#25805-96)的每孔加入100μl抗體，密封后4℃保持過夜。預(yù)吸附抗體按如下方法制備。將4g對照愈傷組織(未轉(zhuǎn)化的)在由含1％PVP40000的50X的濃縮液(Agdia,Elckhart,Indiana)制備的6ml PBSTween緩沖液中勻漿，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘沉淀細(xì)胞碎片，將5.5ml上清與5.5ml含0.1％BSA和4％PEG 8000的PBS Tween混合，向其中加入9.4μl生物素化兔抗WGA抗體(E.Y.Laboratories,3.5mg/ml)至終濃度3μg/ml。其后在冰上孵育3小時以預(yù)吸附抗體。
取出孵育過夜的ELISA板并以PBS Tween充分洗滌(4X)，每孔中加入無Tween的PBS中的i％BSA溶液進行封閉。無Tween的PBS溶液由5ml 10％(w/v)的牛血清白蛋白貯存液(Fraction V,ICNPharmaceuticals #81-066，水溶液)與5ml PBS(NaCl 8.0g,Na2HPO4.2H2O 1.44g,KH2PO40.2g,KCL 0.2g,加水至1升，調(diào)至pH7.4)混合而成。室溫下(22-24℃)孵育平板1小時，然后以PBS Tween洗滌4X。
按以下方法制備以BLc3轉(zhuǎn)化的胚性細(xì)胞系抽提物。在1.5ml微量離心管中以130μl含1％PVP40000的PBS Tween溶液勻漿約0.5g愈傷組織，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀細(xì)胞碎片，并放置在冰上。向ELISA板每孔中加入100μl上清，接著按上述步驟封閉1小時，洗滌板。在室溫下孵育板3小時，并以PBS Tween洗滌板4X。向板的每一孔中加入100μl預(yù)吸附的生物素化抗體，4℃孵育平板過夜，并以PBS Tween洗滌4X。
于含1％BSA的PBS(無Tween)中配制11ml 1∶3000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(5′到3′)。向ELISA板的每孔中加入100μl，在室溫下孵育板1小時，以PBS Tween洗滌平板4X，每孔加入200μl溶于pH9.8,10％乙二醇胺+0.5mM MgCl2的PNP(對硝基苯磷酸鹽；Sigma104磷酸鹽底物#104-0)(使用前制備)，在室溫下顯色反應(yīng)20分鐘。加入50μl 3N NaOH終止反應(yīng)，在微滴板讀數(shù)儀上讀取波長410λ處的吸光值。幾種轉(zhuǎn)化的胚性細(xì)胞系的分析結(jié)果列于下表中。
表1用pGA643中的BLc3轉(zhuǎn)化了的棉花細(xì)胞進行的WGA ELISA中免疫測定的結(jié)果樣品#集落#凝集素DNAELISA結(jié)果1 對照 無 -2 對照 無 -3 對照 無 -4 對照 無 -5 對照 無 -6 75BLC-7 95BLC-8 105 BLC-9 138 BLC-10 158 BLC-11 171 BLC-12 173 BLC-13 175 BLC-14 176 BLC++15 177 BLC+16 178 BLC+++17 180 BLC-18 181 BLC-19 183 BLC-20 184 BLC+21 185 BLC-22 186 BLC+23 187 BLC-24 188 BLC+++25 189 BLC-26 190 BLC++27 191 BLC-28 192 BLC-29 194 BLC+30 195 BLC+++31 197 BLC+++32 198 BLC+33 200 BLC+++35 203 BLC-36 205 BLC+++37 207 BLC-38 209 BLC-39 211 BLC+++40 216 BLC+41 25μg/ml WGA+++-=為監(jiān)測到信號；+,++,+++表示檢測到的信號和相對強度，+++表示信號最強。
表1數(shù)據(jù)證實了凝集素基因與NPTⅡ選擇性標(biāo)記的共轉(zhuǎn)移。在本試驗中約50％轉(zhuǎn)化的胚性細(xì)胞系表達(dá)的凝集素蛋白質(zhì)足以被檢測到。但在本試驗中，顯然BLc3蛋白質(zhì)的可檢測性水平是可變化的，這可能由所分析的不同細(xì)胞系代表的獨立轉(zhuǎn)化事件中凝集素蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異所致。實施例6BLc3轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞是殺昆蟲的為確定轉(zhuǎn)化了BLc3的棉花細(xì)胞的殺昆蟲特性，以實夜蛾屬的幼蟲進行飼養(yǎng)試驗。實夜蛾是在經(jīng)濟學(xué)上重要的棉花害蟲，選擇NPTⅡELISA和WGA ELISA雙陽性的轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織培養(yǎng)物進行實驗。將這些集落分為兩組，一半繼續(xù)培養(yǎng)以再生成植物，另外一半用以飼養(yǎng)試驗。實驗中，將大于1克的組織在液氮中冷凍，凍干并貯存在-75℃，以待飼養(yǎng)試驗之用。
由于棉鈴蟲(corn ear worm)是一種主要的棉花害蟲，本實施例中使用其飼料。假如他想檢定轉(zhuǎn)化的組織對其它昆蟲的抗昆蟲活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得如何選擇適宜昆蟲飼料。昆蟲飼料按下述方法制備，將2.6g瓊脂溶解在157ml水中，煮沸1分鐘，后加入40.6g棉鈴蟲飼料(Bioserv產(chǎn)品#9394)充分?jǐn)嚢琛Ｏ?6孔昆蟲飼養(yǎng)盤每孔中加入1.5ml上述混合液。再向每孔中加入25ml凍干的愈傷組織或?qū)φ?未轉(zhuǎn)化)樣品。以截短型蘇云金芽孢桿菌(B.t)晶體內(nèi)毒素(CrylAb)基因(pPHY3)轉(zhuǎn)化的愈傷組織為陽性對照。這種愈傷組織表達(dá)低水平的Bt蛋白質(zhì)，對實夜蛾幼蟲有毒性。以轉(zhuǎn)化NPTⅡ基因(pUC/NEO)，但無凝集素基因的愈傷組織作為陰性對照。
煙芽夜蛾幼蟲，一種嚴(yán)重的棉花害蟲在本實施例使用。使卵孵化，新生的幼蟲用于試驗，飼養(yǎng)盤每孔加入一個幼蟲。6天后，稱其重以確定生長程度。數(shù)據(jù)總結(jié)在下表2中。
表2實夜蛾幼蟲在含以BLc3轉(zhuǎn)化的棉花組織的飼料上的生長結(jié)果
BLC編號與表1中樣品編號一致。用8只實夜蛾幼蟲檢驗如上文制備的每一種愈傷組織樣品。表中所示的生長體重增加百分?jǐn)?shù)是在所示檢測樣品混合物上飼養(yǎng)6天后8只幼蟲的平均值。以僅NPTⅡ標(biāo)記基因(無凝集素基因)轉(zhuǎn)化的愈傷組織制備陰性對照樣品。陽性對照來自以pPHY3轉(zhuǎn)化的組織。
表2中的數(shù)據(jù)表明以BLc3轉(zhuǎn)化的棉花胚性愈傷組織能夠抑制實夜蛾幼蟲的生長，并且確實能夠殺死一些幼蟲，即使在這些研究中以相對少量的(25mg)凍干轉(zhuǎn)化愈傷組織混合到人工飼料中也能如此。實施例7以HEVI(橡膠蛋白)和MK209(大麥凝集素)轉(zhuǎn)染的棉花細(xì)胞是殺昆蟲的添加凍干愈傷組織的棉鈴蟲飼料按實施例6所述的方法制備，只是愈傷組織樣品來自以HEVI轉(zhuǎn)化的和MK209轉(zhuǎn)化的愈傷組織。將新孵化的幼蟲(每飼養(yǎng)孔一只)放置到測試培養(yǎng)基上，室溫下孵育，7天后計分，數(shù)據(jù)總結(jié)在下表3中。
表3實夜蛾幼蟲在添加了以HEVI(橡膠蛋白)或MK209(蕁麻凝集素)轉(zhuǎn)化的棉花組織的飼料上的生長結(jié)果
本實驗使用的昆蟲飼料制劑中包含極低重量百分比的待測試愈傷組織，因此，比較其與陽性對照的相對活性，可以認(rèn)為觀察到的殺昆蟲活性是很顯著的。盡管所有測試的凝集素基因都表現(xiàn)出抗實夜蛾的顯著活性，在本研究中，蕁麻凝集素MK209相對B.t內(nèi)毒素的活性最高。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得利用這些方法檢測本研究所示范的或其他凝集素基因轉(zhuǎn)化的棉花組織抗在棉花生產(chǎn)上有經(jīng)濟學(xué)重要意義的其他昆蟲和害蟲的殺蟲活性。這類昆蟲和害蟲的例子包括切根蟲[地夜蛾(Agrotis spp.),Paridroma ssp.，切夜蛾(Euxoa spp.)，臟切夜蛾(Feltia spp)]，纓翅目昆蟲[花薊馬(Franklinialla spp.)]，蚜蟲[棉蚜(Aphis gossypii)]，棉鈴蟲[實夜蛾(Heliothis spp.),Pectinophora spp.,Helicoverpa spp.]，芽夜蛾(budworm)[實夜蛾(Heliothis spp.)]，盲蝽[草盲蝽(Lygus spp.),Euschistusspp.)]，棉鈴象(Anthonomus grandis)，粘蟲[貪夜蛾(Spodopteraspp)]，夜蛾(looper)(Alabama spp.)，毛蟲(Estigmene spp.),cotton leaf perforator(Bacculatrix spp)，葉螨(Tetranychusspp.)，粉虱(Bemisia spp.,Trialeurodes spp)，線蟲[根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)，小盤旋線蟲(Rotylenchulus spp.)，紐帶線蟲(Hoploaimus spp.)]，和真菌病原體[輪枝孢(Verticillium spp.),鐮孢(Fusarium spp.)，腐霉(Pythium spp.)，絲核菌(Rhizoetoniaspp.)，根串珠霉(Thielaviopsis spp.)，疫霉(Phytophthoraspp.)]。由上述實施例看來，熟練的技術(shù)人員可以預(yù)見以其他凝集素基因的測試也可能是成功的。因此，顯而易見本發(fā)明包含的實施方案不僅僅是那些在例證性的實施例中提到的實施方案，將通過附加的權(quán)利要求書詮釋本發(fā)明。
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1．含有一種編碼凝集素的異源性編碼序列的棉花細(xì)胞群，其中所述的細(xì)胞中表達(dá)該編碼序列，從而賦予該細(xì)胞殺害蟲能力。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞，其中該細(xì)胞是殺昆蟲的。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞，其中該細(xì)胞是殺真菌的。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞，其中該細(xì)胞是殺線蟲的。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞，其中所述的凝集素編碼序列來自大麥。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞，其中所述的凝集素編碼序列來自蕁麻。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞，其中所述的凝集素編碼序列來自橡膠蛋白。
8．一種棉花植物，其中包含根據(jù)權(quán)利要求1的棉花細(xì)胞。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物，其中所述細(xì)胞是殺昆蟲的。
10．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物，其中所述細(xì)胞是殺真菌的。
11．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物，其中所述細(xì)胞是殺線蟲的。
12．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物，其中所述的細(xì)胞包含來自大麥的凝集素編碼序列。
13．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物，其中所述的細(xì)胞包含來自蕁麻的凝集素編碼序列。
14．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物，其中所述的細(xì)胞包含來自橡膠蛋白的凝集素編碼序列。
15．根據(jù)權(quán)利要求8的棉花植物種子，該種子包含具有異源性凝集素編碼序列的細(xì)胞。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的種子，其中所述的凝集素編碼序列編碼一種殺昆蟲的凝集素。
17．根據(jù)權(quán)利要求15的種子，其中所述的凝集素編碼序列編碼一種殺真菌的凝集素。
18．根據(jù)權(quán)利要求15的種子，其中所述的凝集素編碼序列編碼一種殺線蟲的凝集素。
19．根據(jù)權(quán)利要求15的種子，其中所述的凝集素編碼序列來自大麥。
20．根據(jù)權(quán)利要求15的種子，其中所述的凝集素編碼序列來自蕁麻。
21．根據(jù)權(quán)利要求15的種子，其中所述的凝集素編碼序列來自橡膠蛋白。
22．一種生產(chǎn)殺害蟲的凝集素的方法，包括以下步驟獲得編碼殺害蟲的凝集素的多核苷酸；用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞；在一定的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而產(chǎn)生包含所述多核苷酸的子代棉花細(xì)胞或包含所述子代細(xì)胞的植物；驗證所述多核苷酸在所述的子代細(xì)胞中表達(dá)，從而生產(chǎn)一種可殺害蟲的凝集素。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的凝集素是殺昆蟲的。
24．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的凝集素是殺真菌的。
25．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的凝集素是殺線蟲的。
26．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的多核苷酸來自大麥。
27．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的多核苷酸來自蕁麻。
28．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的多核苷酸來自橡膠蛋白。
29．產(chǎn)生具害蟲抗性的棉花植物的方法，包含以下步驟獲得編碼殺害蟲的凝集素的多核苷酸；用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞；在一定的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，從而生產(chǎn)包含所述細(xì)胞之子代細(xì)胞的棉花植物，該子代細(xì)胞包含編碼凝集素的多核苷酸；驗證該多核苷酸在所述子代細(xì)胞中表達(dá)，從而生產(chǎn)殺害蟲的凝集素。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中進一步包含下述步驟在一定條件下培育所述植物，從而產(chǎn)生棉花種子；從所述植物收獲至少一粒棉花種子；由所述植物生產(chǎn)具害蟲抗性的棉花植物的子代。
31．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的凝集素是殺昆蟲的。
32．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的凝集素是真菌的。
33．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的凝集素是殺線蟲的。
34．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的多核苷酸來自大麥。
35．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的多核苷酸來自蕁麻。
36．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的多核苷酸來自橡膠蛋白。
37．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的凝集素是殺昆蟲的。
38．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的凝集素是殺真菌的。
39．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的凝集素是殺線蟲的。
40．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的多核苷酸來自大麥。
41．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的多核苷酸來自蕁麻。
42．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的多核苷酸來自橡膠蛋白。
43．一種殺棉花害蟲的方法，包含以下步驟獲得編碼殺害蟲的凝集素的多核苷酸；用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞；在一定的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，從而生產(chǎn)包含所述多核苷酸的子代細(xì)胞或包含所述子代細(xì)胞的植物；驗證所述多核苷酸在所述子代細(xì)胞中表達(dá)，從而生產(chǎn)殺害蟲的凝集素；使所述子代細(xì)胞與棉花害蟲接觸。
44．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的凝集素是殺昆蟲的。
45．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的凝集素是殺真菌的。
46．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的凝集素是殺線蟲的。
47．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的多核苷酸來自大麥。
48．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的多核苷酸來自蕁麻。
49．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的多核苷酸來自橡膠蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了編碼呈現(xiàn)殺蟲活性(如殺昆蟲和/或殺真菌活性)的凝集素的嵌合基因,該嵌合基因可用來轉(zhuǎn)化棉花以產(chǎn)生可表達(dá)該嵌合基因的棉花細(xì)胞、植株和種子。當(dāng)被棉花害蟲攝取后這種轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞能夠殺害蟲。
文檔編號C12N15/29GK1303441SQ99806759
公開日2001年7月11日 申請日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月29日
發(fā)明者R·L·耶諾夫斯基, M·范恩, T·S·蘭根, D·M·安德森 申請人:麥考根公司