專利名稱：哺乳動物的特洛德樣基因和蛋白質的制作方法
相關申請交叉文獻本申請要求了1998年12月11日提交的美國臨時申請No.60/111,873和1998年4月3日提交的美國臨時申請No.60/080,550的優(yōu)先權。各申請均全部納入本文作參考。
關于聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)的聲明有待決定。
背景技術：
本發(fā)明涉及骨形態(tài)生成蛋白領域，更具體地涉及BMP-1/Tld家族中的基因和蛋白質。
哺乳動物如小鼠和人骨骼的形成受到一系列骨形態(tài)生成蛋白(BMP)的控制。在參與成骨的7種已知BMP中，6種(稱為BPM-2到BMP-7)屬于TGF-β超家族。第7種BMP(稱為BMP-1)并不象TGF-β，而看來衍生自不同的基因家族。BMP-1基因家族成員通常含有下列結構域蝦紅素樣金屬蛋白酶結構域，一個或多個在其它蛋白中被認為與Ca++結合的EGF樣基序，以及多個CUB結構域。CUB結構域是介導補體成分Clr/Cls中蛋白之間相互作用的一種基序，也已明確它存在于各種參與發(fā)育過程的蛋白中。Wozney,J.M.等在Science 242:1528-1534(1988)中描述了BMP-1的核苷酸序列。
其它非哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)的蛋白質中也具有哺乳動物BMP-1結構域的結構。這些蛋白質包括果蠅屬特洛德(tolloid)(Tld)(Shimell,M.J.,Cell 67:469-481(1991))、特洛德樣果蠅屬基因產物(Tlr-1或tolkin)(Nguyen,T.,Dev.Biol.166:569-586(1994)和Finelli,A.L.,等,Genetics 141:271-281(1995))、海膽B(tài)MP-1同系物(suBMP-1)(Hwang,S.-P.,等，Development 120:559-568(1994))、兩種相關的海膽發(fā)育基因產物SpAN和BP10(Reynolds,S.D.,等，Development 114:769-786(1992)和Lepage,T.,等，Development 114:147-164(1992))、爪蟾屬(Xenopus) BMP-1(xBMP-1)(Maeno,M.等，Gene 134:257-261(1993)、爪蟾屬特洛德(Lin.J.等人,Develop.Growth Differ.39:43-51(1997))、稱為索洛德(xolloid)的特洛德樣爪蟾屬基因產物(Piccolo,S.等人,Cell91:407-416(1997))、分離自斑馬魚的稱為斑馬魚特洛德的該家族相關成員(Bladder,P.等人,Science 278:1937-1940(1997))、哺乳動物特洛德(mTld)(Takahara,K.等,J.Biol.Chem.269:32572-32578(1994))和哺乳動物特洛德樣基因(mTll-1)(Takahara,K.等人，Genomics 34:157-165(1996))。編碼這些蛋白質的基因的一些核酸序列是已知的。哺乳動物BMP1基因既編碼BMP-1蛋白，又編碼mTld蛋白，盡管靠的是兩個不同的可變剪接的mRNA分子。本段中提到的論文均納入本文作參考。
發(fā)明概述本發(fā)明概括地描述了一種新的哺乳動物特洛德樣基因產物(mTll-2)及其關聯(lián)的聚核苷酸基因mTLL-2，該基因與mTld以及其它所有已知的與BMP-1有關的基因產物及其關聯(lián)的聚核苷酸(包括mTll(現(xiàn)在稱為mTll-1))不同。本文的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3分別報道了該基因的人和小鼠版本。其各自編碼的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中。
本發(fā)明的一個目的是提供參與脊椎動物中胞外基質沉積(如成骨)的基因和基因產物。
本發(fā)明的另一個目的是為合理地開發(fā)出抑制特洛德樣基因活性治療纖維變性、結疤、瘢痕瘤、手術粘連等的藥物提供靶分子。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種重組DNA構建物、以及該構建物所編碼的、用來加速傷口和骨折愈合的蛋白質。
本發(fā)明還有一個目的是提供對人染色體10的10q24區(qū)域以及小鼠染色體19的遠端作圖譜的標記。
本發(fā)明還有一個目的是提供作為探測哺乳動物細胞中非BMP-1骨形態(tài)生成蛋白基因的探針的核苷酸序列。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點在參照附圖進行下列詳細敘述時將會更為清晰。
附圖簡述

圖1A-1C(合稱“圖1”)比較了本發(fā)明公開的mTll-2人基因(htll-2)和鼠基因(mtll-2)的推導氨基酸序列與人mTld(人特洛德)以及人mTll-1(htll)基因的推導氨基酸序列。序列對比用PileUp程序(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)進行，GAP加權值為12，長度加權值為4。蛋白質結構域的近似終點如臨時申請60/080,550中所示，該申請納入本文作參考。
發(fā)明詳述哺乳動物特洛德樣2(mTll-2)是以骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1(BMP-1)為原型的蝦紅素樣蛋白酶超家族中在基因水平上有所不同的成員。該蛋白酶超家族還包括哺乳動物特洛德(mTld)和哺乳動物特洛德樣-1(mTll-1；以前稱為mTll)，該超家族在發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中在傷口愈合中、以及諸如纖維變性等病理過程中起關鍵的控制作用。編碼mTll-2的基因具有與BMP-1家族其它成員不同的空間上和時間上的表達分布圖，經對發(fā)育者、成年人和小鼠組織的RNA進行Northern和Master印跡(Clontech)確證，它在成年人和正發(fā)育的心臟軟組織中表達的水平最高。本文列舉的mTll-2基因特別可與BMP-1基因家族其它成員區(qū)別之處在于編碼序列的3′端(編碼mTll-2蛋白質的羧基端17個氨基酸)以及編碼蛋白質前區(qū)(proregion)的部分。同樣，其蛋白質也能與該家族中的其它蛋白質區(qū)分開來。
本發(fā)明者已經確定，與BMP-1、mTld和mTll-1不同，mTll-2并不是前膠原C-蛋白酶，并且不切割chordin。mTll-2將前賴氨酰氧化酶切割成成熟的活性形式的作用較弱。該蛋白質還可能切割參與基質沉淀、發(fā)育、體內平衡、傷口愈合和疾病的其它底物。同樣，mTll-2蛋白最優(yōu)切割的底物子集(subset)也與BMP-1、mTld以及mTll-1最優(yōu)切割的底物子集不同，盡管這些蛋白的底物特異性有部分重疊。mTll-2是抗纖維變性藥的潛在靶標，它可能會促進各種組織的愈合，并且還可用來研究發(fā)育和疾病過程和鑒定其功能性抑制劑。mTll-2的抑制可能會抑制纖維變性、過度結疤、或正常愈合或發(fā)育的其它紊亂。重組mTll-2(或其關聯(lián)的核酸)可用于評價發(fā)育、疾病過程和治療性干預的系統(tǒng)。
mTll-2蛋白可通過激活生長因子和形態(tài)發(fā)生素起作用。因此，如果外源性加入(或如果將其同源核酸加入細胞內，例如在基因治療中)，它可能加速愈合。
編碼mTll-2的多核苷酸(例如基因組DNA、信使RNA和對應于信使RNA的cDNA)可用對應于以前報道的蝦紅素金屬蛋白酶催化域保守區(qū)的引物，在合適的擴增條件下，從含有哺乳動物多核苷酸的模板文庫擴增獲得。下列的簡并寡核苷酸引物(用標準IUPAC命名法顯示)適合獲得mTll-2基因的一部分，本發(fā)明者認為它們是較佳的引物1(正向)5′-CARGC MATGM GNCAC TGGGAG-3′(SEQ ID NO:5)引物2(正向)5′-CARGC MATGMGN CACTG GGAA-3′(SEQ ID NO:6)引物3(反向)5′GAADG TGTTVC KNGCRT ARTGC-3′(SEQ ID NO: 7)含有哺乳動物多核苷酸的合適的模板文庫宜為性交后7天的小鼠胚胎或人胎盤的未擴增cDNA的合并物。此合并物中的cDNA宜用RT-PCR擴增的RNA來制備。合適的人和小鼠胎盤和胚胎cDNA合并物購自Clontech。模板cDNA的來源并不關鍵，只要該cDNA合并物包括至少一個能如所述那樣擴增的模板序列即可。其它合適的模板包括，但不局限于，器官特異性的或其它類型的cDNA合并物或文庫或基因組DNA或文庫。
合適的擴增條件在下文實施例中有所描述，但是本領域技術人員能確定與本文報告的那些有所不同的可接受的條件。一旦獲得了最初的PCR產物，就可用它來進行平板篩選cDNA或基因組文庫。
可能需要分開建立編碼mTll-2的cDNA序列的5′或3′端，例如采用只選擇性擴增5′或3′端cDNA序列的方法，例如3′簡并PCR或cDNA末端的迅速擴增方法(“RACE”)，該方法在Frohman,M.A.″迅速擴增互補DNA末端來產生全長互補DNA加熱RACE法″，Methods in Enzymology(Wu,R.編)，218卷，340-362頁，Academic Press,New York(1991)，該文全部納入本文作參考。
市售的5′和3′RACE擴增系統(tǒng)購自Clontech。適合5′和3′RACE的引物可從上述用簡并引物進行最初PCR時獲得的擴增cDNA序列，或通過篩選cDNA或基因組DNA文庫獲得的cDNA克隆序列推導出來。在較佳的實施方案中，根據平板篩選分離出的1.6kb cDNA 5′端設計的嵌套PCR的引物如下引物4 5′-TGTGGTGTCT GGGCTGCTCT CAGATGC-3′(SEQ ID NO:8)引物5 5′-ACTGTCTGCT TGGTCCAGTC TCTGG-3′(SEQ ID NO:9)對于3′-簡并PCR，合適的嵌套引物對應于平板篩選分離的cDNA 3′端序列，合適的簡并引物對應于在BMP-1/特洛德樣蛋白CUB結構域5中發(fā)現(xiàn)的保守序列。合適的引物包括引物6 5′-TACCTGGAAG TCCGGGATGG CCCCACG-3′(SEQ ID NO:10)引物7 5′-GAGGATGTGA AATCGAGCTC CAACAGAC-3′(SEQ ID NO:11)引物8-11(簡并引物)5′-RAANCCYTTYTTNNNDATNGTRTCRTC-3′(SEQ ID NO:12)對于3′RACE，對應于用3′-簡并PCR擴增的cDNA片段3′端序列的合適的嵌套PCR引物是引物12 5′-CAACAACTAC CCGAGCGAGG CCCC-3′(SEQ ID NO:13)引物13 5′-GAAGCCTACG ACGGCTACGA CAGCTC-3′(SEQ ID NO:14)
本領域技術人員可將分開克隆的序列連接在一起，正如本發(fā)明者所做的那樣，從人獲得完整的全長cDNA，如SEQ ID NO:1所示。SEQ ID NO:1所示的是側接了5′和3′非翻譯序列的一個開放讀框。該開放讀框編碼了稱為mTll-2的哺乳動物特洛德樣蛋白。該人mTll-2基因的基因圖譜位于人染色體10q24。
SEQ ID NO:3顯示了從小鼠源獲得的第二種mTll-2基因。SEQ ID NO:4中報道了該小鼠mTll-基因編碼的對應蛋白。該鼠版本基因與人mTll-2基因對應之處在于兩者均具有相似的核酸和氨基酸序列。還不知道鼠mTll-2基因在鼠染色體基因圖譜中在何位置。
如果DNA制品中已經除去了90％以上任何有DNA的宿主細胞的細胞物質，則認為任何來源的含有mTll-2基因序列的DNA分子制品是基本上純的。例如，細胞物質可利用市售純化試劑盒(如購自Qiagen(Chatsworth,CA)的試劑盒)從核酸制品中除去。較佳的是，核酸制品中超過10％的核酸分子含有全部或部分mTll-2基因。更佳的是，超過50％，甚至還要佳的是超過90％的核酸分子含有mTll-2基因全部或部分序列。
鑒于與其它特洛德樣蛋白質的相似性，預計本發(fā)明公開的mTll-2基因所編碼的產物將在發(fā)育以及體內平衡過程(如傷口愈合)中起關鍵作用。該蛋白參與胞外基質前體成熟為大分子結構(例如通過激活前賴氨酰氧化酶)。該蛋白還可能在體內和體外激活生長因子中起一定作用，當將有效量的蛋白質給予組織時，它可能會促進發(fā)育和體內平衡過程。另一方面，如果mTll-2蛋白質功能被抑制，這些過程本身可能被抑制，通過輸送有效量的抑制劑就可有利地利用該特性來防止纖維變性和過度結疤或其它傷口愈合的異常情況。通過測試某劑量范圍的該蛋白質對所選的認為在生物化學或生理學上類似于人的脊椎動物或模型動物的作用，就容易確定待輸送給靶部位以激活發(fā)育和體內平衡特性的該蛋白質的有效量。例如，就皮膚或心臟傷口愈合或發(fā)育而言，豬皮膚或心臟是人皮膚和心臟的合適模型。大鼠或家兔心臟也是可以接受的系統(tǒng)。
同樣，也可確定mTll-2蛋白抑制劑的有效量。有效量是指在給予后能比未治療動物有效減少纖維變性、結疤或瘢痕瘤發(fā)生的用量，其中根據臨床或獸醫(yī)所接受的標準來評估上述病癥。這種測試宜在通常被視為與人皮膚、心臟或其它受累組織有關的模型系統(tǒng)中進行。
由于該蛋白質在動物組織中的含量通常非常少，因此BMP系統(tǒng)蛋白質的工作能力受到阻遏。一種以前未知的基因，mTll-2，可以克隆入含有(在合適哺乳動物或昆蟲宿主細胞內)有效的轉錄啟動子的合適表達載體中，繼而導入合適的(哺乳動物或昆蟲)宿主細胞并在其中表達，并以天然構型純化，所有這些均采用常規(guī)方法?？蓪DNA插入可整合的(例如pCDNA3.1型)或游離型(例如pCEP4型)載體中，并在合適培養(yǎng)的哺乳動物細胞(如分別為293人胚腎細胞或2930EBNA細胞)中表達。pCDNA3.1和pCEP4載體(以及有關載體)購自Invitrogen。載體序列和載體的限制性圖譜均從Invitrogen獲得。cDNA還可插入桿狀病毒載體(如BacPAK 6，購自Clontech)。
這樣表達的蛋白質可保留在宿主細胞內，或可以分泌到胞外生長培養(yǎng)基中(如果構建物有合適的信號序列的話)。該蛋白質可用常規(guī)的方法從細胞或生長培養(yǎng)基中純化獲得。重組蛋白(及其同源mRNA)可用于功能試驗和高產量篩選抑制劑。重組蛋白和蛋白質的諸部分可從本文公開序列的亞克隆產生，并可作X-線晶體圖進行合理的藥物設計?？稍O計出對mTll-2蛋白有特異性的抗體。
合適的轉錄啟動子包括如在pCDNA3.1或pCEP載體中發(fā)現(xiàn)的巨細胞病毒立即早期啟動子，或是在載體pFASTBacl(該載體可購自Gibco-BRL)上發(fā)現(xiàn)的桿狀病毒極遲啟動子。另一個合適的啟動子是桿狀病毒立即早期啟動子，如在pAcPIE1載體(Novagen,Madison,WI)上發(fā)現(xiàn)的啟動子。任何其它有利的表達元件如增強子、終止子等本領域已知的元件可包括在合適的表達載體中。
合適的宿主可以是昆蟲組織培育細胞，如細胞系Sf21、Sf9、High Five(Invitrogen,sar Diego,CA)、或哺乳動物293或293-EBNA細胞。
也可將含有小于全部編碼序列的該基因的合適部分克隆入合適的載體中，以形成基因重組構建物。應當理解，根據本發(fā)明制得的構建物不必含有整個mTll-2基因座或編碼區(qū)，但應含有能編碼所需功能的一個或多個部分，或含有該基因其它有用性能(如與所需基因組序列互補)的部分。本領域普通技術人員可以理解，mTll-2蛋白質(以及編碼mTll-2蛋白質的相應的遺傳物質)在大小和序列上的某些變化不會干擾其功能。在構建含有全部或部分mTll-2基因的基因構建物時，這些經修飾的形式可用已知的有利方法進行工程化，并表達在其編碼的蛋白質中。
只要蛋白質保留了已知與該蛋白有關的所需功能，認為這些改變、修飾、添加和缺失均在本發(fā)明的范圍內。如果蛋白質在進行這種切割的標準試驗中保留了切斷(前賴氨酰氧化酶的)能力，則該蛋白質是感受態(tài)蛋白。本領域技術人員對這些試驗應伴有的必要的對照是熟悉的?；蛘?，可能希望蛋白質由于這種變化而喪失某些功能，預計這類情況也包括在本發(fā)明的范圍內。
這樣制得的該蛋白質基本純的制品被確定為一種制品，其中mTll-2蛋白質的特征性活性(例如對前賴氨酰氧化酶的較弱的切割作用)應不受制品中存在的其它蛋白質或分子的影響。根據該蛋白質將投入的用途，mTll-2蛋白質在基本純的蛋白質制品中的量至少應為10％，至少50％為佳，至少75％為更佳，至少95％為最佳。通過用親和標記物對該蛋白質作標記，并使制品通過對標記物有親和性的柱，可增加此蛋白質制品中感興趣的蛋白質。也可采用一種加工標記物，這樣，就可從加有粗品的柱中洗脫獲得適當加工形式(缺少切割前區(qū))的該蛋白質。
當將鼠mTll-2蛋白質序列與其它特洛德樣基因進行比較時，其與兩個哺乳動物蛋白質(mTld和mTll)任一的前區(qū)或兩個果蠅屬蛋白質(Tld或Tlr-1)任一的前區(qū)沒有廣泛的同源性。圖1將本發(fā)明公開的人和鼠mTll-2基因與人mTld以及人mTll-1基因作了氨基酸序列對比。序列對比用PileUp程序(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)進行，GAP權值為12，長度權值為4。圖1還顯示了所示編碼序列編碼的蛋白質各結構域的大致邊界。圖1所示的氨基酸序列，從上到下，分別是人mTll-2、小鼠mTll-2、mTld和mTll-1。
mTll-2 mRNA轉錄物看來并非是可變剪接的，因為只檢測到一個轉錄物，因為在每一種動物中進行cDNA文庫篩選和PCR擴增時只分離出一種mTll-2 cDNA。
在胎盤和心臟觀察到有相當強的mTll-2 mRNA表達。
具體預計的是，通過用經選擇包含所述小鼠基因的mTll-2特異性部分的探針探測適當動物細胞的cDNA文庫，或用與上述相似或不同的簡并引物進行PCR擴增，可以自其它動物種類分離出mTll-2基因的等價物。通過比較小鼠mTll-2編碼區(qū)核酸序列與BMP-1/mTld以及mTll-1的序列并選出在此二基因內均沒有等價物的mTll-2基因部分，可獲得小鼠mTll-2基因的mTll-2特異性部分。作為有效的探針，所選序列不應含有會與眾多基因組位點相互雜交的重復序列。探針長度應至少約200個堿基。已經認識到，BMP-l家族基因在編碼蛋白質前區(qū)和C端17個氨基酸的區(qū)域中最為可變，并且預計可以從mTll-2基因的那些區(qū)域分離出合適的探針。這樣的探針片段可用切口翻譯、末端標記或本領域已知的其它合適技術來轉變成探針。還應理解，可用分子生物學家熟知的技術來體外合成所需的片段(或實際上是整個基因)。本領域技術人員能設計出對應于mTll-2所獨有的區(qū)域或BMP-1/mTll-1/mTll-2蛋白家族成員中保守的區(qū)域的簡并引物。
由于mTll-2中的缺陷可能導致人基因異常，因此如下文實施例所述已確定了人TLL-2基因的染色體位置(10q24)。該位置靠近與人遺傳性疾病肌萎縮性痙攣性下身輕癱有關的基因圖位置。在用Trask,B.,Methods Cell Biol.35:1-35(1992)的方法伸展的人細胞分裂中期染色體上進行熒光原位雜交(FISH)，并通過放射雜交篩選，對TLL基因獨立作圖譜。
通過選擇預計側接mTll-2基因(或該基因任何部分)的特異性引物，應當也可能用PCR來擴增對應于mTll-2區(qū)的基因組部分。該基因的兩個mTll-2特異性部分可作為合適的引物。在該基因編碼部分之外選擇引物可能是無效的，因為非編碼部分降低的選擇性壓力會導致小鼠和人以及其它動物之間在這些區(qū)域中出現(xiàn)更大的趨異。特別應注意的是，應對人和模型動物(如小鼠)BMP家族的基因進行特別搜尋，以探知它們與人畸形的關系(參見例如"The Chicken With a Duck′s Feet:It′s All in theBiochemical Signal,"The New York Times,National Edition,p.B6(1996年5月21日))。
也可特別預計到，可在宿主細胞中表達(或從宿主細胞中分泌)mTll-2基因編碼的大量蛋白質，純化成基本純的制品，并用于隨后的功能試驗。在這樣的一個功能試驗中，將描述表達蛋白質的功能特征。預計該蛋白質的功能將包括金屬蛋白酶活性、前賴氨酰氧化酶加工活性，以及激活TGF-β樣蛋白的活性，鑒于其總體結構在結構域水平上與已知的蛋白質相似，因此這些預計是合理的。
在另一個試驗中，該蛋白質可用來篩選對其有抑制活性的推定試劑。如果mTll-2能拯救BMP-1敲除小鼠，則它對于修飾或消除BMP-1蛋白功能以類似方式改變mTll-2蛋白功能的任何治療系統(tǒng)是重要的。因此，任何一組這樣的試劑都必需以mTll-2蛋白質進行篩選。在這樣的試驗中，所有支持mTll功能的試驗成分可在合適的鹽和pH條件下一同加入，并與一組推定的蛋白質功能抑制劑合用。采用已建立的蛋白質功能試驗(在納入本文其它處作為參考的文獻中有所描述)，將可以確定受測制劑是否能抑制蛋白質活性，從而使其成為以治療量抑制纖維變性、減少結疤和減少瘢痕瘤的候選制劑。采用BMP-1基因家族的相關蛋白質的這種篩選努力正在進行。
現(xiàn)在也可用本發(fā)明所公開的蛋白質或其片段來進行合理的藥物設計。在設計時，對該蛋白質或片段進行X-射線晶體圖作分析，以確定它們的活性位點和可與推定治療劑相互作用的位點。
目前表明，BMP-1編碼的蛋白質可切割前膠原的C端附近。人們早就認為產生這種膠原所必需的C端-蛋白酶活性存在于一種預測的蛋白質中。因此，利用C端蛋白酶活性作為膠原相關疾病的治療劑具有很高的商業(yè)價值。特別期望的是，mTll-2編碼的蛋白質部分可用來產生另一種C端蛋白酶，兩者均通過將基因導入重組載體中來體外生產治療性蛋白，并在遺傳疾病治療中直接給藥。人的基因特別適用于這些用途。
在考慮下列非限制性實施例后將能更好地理解本發(fā)明。
實施例來自人胎盤cDNA的人mTll-2用簡并引物作PCR擴增。用對應于在BMP-1/特洛德樣蝦紅素金屬蛋白酶催化功能域中的一對保守區(qū)域的簡并引物，從人胎盤Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech)擴增得到mTll-2基因的一部分(見Bond.J.S.和R.J.Benynon,Protein Science 4:1247-1261在1249頁(1995)，納入本文作參考)。為了確定簡并引物的合適序列，對人(Wozney等人，1988)、小鼠(Fukagawa等人，1994)和爪蟾屬(Ma no等人，1993)BMP-1、果蠅屬特洛德相關-1(Nguyen等人，1994)和小鼠(Takahara等人，1996)和人mTll-1的對應核苷酸序列作人工序列對比。一對5′(正向)寡核苷酸引物，為引物1:5′-CARGC MATGMGNCAC TGGGAG-3′(SEQ ID NO:5)和引物2:5′-CARGC MATGMGN CACTGGGAA-3′(SEQ ID NO:6)，它對應于編碼較多氨基端氨基酸保守殘基AMRHWE的序列。兩個正向引物的不同僅僅在于最3′端的堿基對應于E的密碼子的搖擺位置。3′(反向)寡核苷酸引物為引物3:5′GAADG TGTTVC KNGCRT ARTGC-3′(SEQ ID NO:7)，它對應于編碼較多羧基端氨基酸保守的殘基HYARNTF的序列。
PCR這樣進行:95℃變性5分鐘，然后是30輪的95℃45秒、50℃45秒、72℃2分鐘，最后72℃延伸10分鐘，采用0.5ng人胎盤cDNA作為模板。
從2％瓊脂糖凝膠上切下電泳觀察到的異源的375bp PCR產物，然后連接入市售的pCR2.1載體(Invitrogen)中，該載體的核酸序列已公布。連接反應用ApaⅠ來限制，該酶在BMP-1/mTld序列中切割，以降低BMP-1/mTld克隆的本底。克隆的序列分析揭示用引物2和引物3組合獲得了約375bp的PCR產物。用引物1和引物3組合沒有獲得mTll-2或其它新的(例如非BMP-1/mTld或mTll-1)產物。通過對兩條鏈測序，確認本文報告的人mTll-2序列。
cDNA文庫篩選。用32p-dCTP(Amersham)通過隨機引導對375bp的人mTll-2PCR片段作放射性標記(Feinberg,A.P.,和Vogelstein,B.(1983)，“將DNA限制性內切核酸酶片段放射性標記成高比活的技術”，Anal.Biochem.132:6-13,該文全部納入本文作參考)，并用其來篩選gtll人胎盤cDNA文庫(Clontech)的噬斑。雜交在65℃下進行18小時，用2×SSC、0.1％SDS室溫洗滌30分鐘；用2×SSC、0.1％SDS 65℃洗滌30分鐘；并用0.1×SSC、0.1％SDS 65℃洗滌30分鐘。
噬斑純化得到一個強雜交陽性克隆，切下約1.6kb的插入物(大致對應于BMP-1家族基因常見的前區(qū)、催化結構域、CUB1和CUB2結構域)，亞克隆到pBluescript ⅡKS+的EcoRⅠ位點內，通過如Lee S.-T.，等人，″編碼人前α2(Ⅰ)膠原的全長cDNA的構建及其在前α2(Ⅰ)-缺陷型W8大鼠細胞中的表達″，J.Biol.Chem.263；13414-13418(1988)(該文全部納入本文作參考)中所描述的雙脫氧鏈終止法，從雙鏈模板獲得序列。
用T3和T7引物對亞克隆的兩末端進行測序，通過引入缺失或采用與插入序列互補的引物使亞克隆的內部部分得以測序。平板篩選的進一步嘗試未能產生編碼新的mTll-2序列的其它陽性克隆。
用RACE-PCR和采用簡并引物的PCR來完成人mTll-2 cDNA序列的5′和3′端。為了獲得1.6kb片段(如上所述獲得)和mTll-2 cDNA 5′端序列之間的所有序列，用Marathon cDNA擴增試劑盒按照生產商(Clontech)說明書，對0.5ng人胎盤Marathon-Ready cDNA模板進行5′RACE PCR擴增。對應于1.6kb片段5′端附近序列的嵌套引物是引物4:5′-TGTGGTGTCT GGGCTGCTCT CAGATGC-3′(SEQ ID NO:8)和引物5:5′-ACTGTCTGCT TGGTCCAGTC TCTGG-3′(SEQ ID NO:9)。嵌套PCR反應中的其余引物對應于Clontech合成并包括在市售的Marathon cDNA擴增試劑盒(它可用來進行嵌套PCR過程)中的RACE-PCR銜接子部分。
進行嵌套PCR,PCR的第一回合為95℃5分鐘，然后是40輪的95℃45秒、60℃45秒、72℃2分鐘，最后72℃延伸10分鐘。嵌套PCR的第二回合在相同條件下進行，只是進行35輪而不是40輪。將PCR產物克隆到Invitrogen pCR2.1載體中進行序列分析。
獲得了前區(qū)和所有信號肽的編碼部分并含有約360bp 5′非翻譯序列的約900bp的mTll-2 5′RACE-cDNA克隆。
最初，3′RACE PCR沒有提供人mTll-2基因的附加的3′序列。因此，采用中間PCR擴增步驟，該步驟采用了對應于1.6kb cDNA 3′端序列的兩個嵌套引物(引物6:5′-TACCTGGAAG TCCGGGATGG CCCCACG-3′(SEQ ID NO:10))和引物7(5′-GAGGATGTGA AATCGAGCTC CAACAGAC-3′(SEQ ID NO:11))，以及對應于人和小鼠mTld以及mTll-1蛋白的CUB結構域5中保守的氨基酸序列的四個交替簡并寡核苷酸引物。簡并反向引物8-11都具有序列5′-RAANCCYTTYT TNNNDATNGT-3′，但是各引物中的6個附加的3′端堿基不同。反向引物8-11的末端序列為引物8,5′-GTCGTC-3′；引物9,5′-ATCATC-3′；引物10,5′-GTCATC-3′；和引物11,5′-ATCGTC-3′。這四個簡并引物在SEQ ID NO:12中列成單個簡并引物，其中引物8、9、10和11中的變化反映在6個最3′端堿基的簡并性上。
用人胎盤Marathon-Ready cDNA作為模板(0.5ng)。第一回合PCR這樣進行，95℃5分鐘，然后40輪的95℃45秒、60℃45秒、72℃4分鐘，最后72℃延伸10分鐘。PCR的第二個嵌套回合在相同條件下進行，只是采用35輪而不是40輪。
從0.8％瓊脂糖凝膠上切下約1.3kb的特異性產物，克隆到pCR2.1中進行序列分析。1.3kb片段編碼了人mTll-2的所有EGF1、CUB3、EGF2和CUB4結構域和大部分CUB5結構域，并且是用簡并反向引物10(而不是引物8、9或11)與嵌套正向引物6或7組合獲得的。
為了獲得其余的人mTll-2 cDNA序列，用對應于1.3kb片段3′端附近序列的兩個嵌套引物(引物12:5′-CAACAACTAC CCGAGCGAGG CCCC-3′(SEQ ID NO:13)和引物13:5′-GAAGCCTACG ACGGCTACGA CAGCTC-3′(SEQ ID NO:14))，以人胎盤Marathon-Ready cDNA作為模板(0.5ng)，用Marathon cDNA擴增試劑盒根據生產商說明書(Clontech)來進行3′RACE PCR。嵌套PCR如下進行PCR的第一回合為95℃分鐘，然后是40輪的95℃45秒、60℃45秒、72℃4分鐘，最后72℃延伸10分鐘。PCR的第二嵌套回合在相同條件下進行，只是采用35輪而不是40輪。從0.8％瓊脂糖凝膠上切下約1.7kb的特異性產物(編碼部分CUB5結構域并含有1.6kb的3′非翻譯區(qū)，包括聚A尾部)，并克隆到pCR2.1中進行序列分析。
鼠mTll-2用獲得最初人375bp片段的相同簡并引物和PCR條件(見上文)，從小鼠cDNA獲得約375bp的異源產物。在這種情況下，所用的模板為0.5ng的性交后7天(dpc)小鼠胚胎Marathon-Ready cDNA(Clontech)。對375bp PCR產物作電泳并從2％瓊脂糖凝膠上切下，連接到pCR2.1中，連接反應用ApaⅠ限制，以降低BMP-1/mTld克隆的本底。與人序列相反，375bp mTll-2 PCR產物是用引物1與引物3組合獲得的，但用引物2和引物3組合沒有獲得mTll-2或其它新的產物。
用375bp片段篩選鼠7dpc和17dpc cDNA文庫，沒有產生任何陽性mTll-2克隆。為了獲得375bp片段和鼠mTll-2 cDNA 5′端序列之間的所有序列，用MarathoncDNA擴增試劑盒按照生產商(Clontech)說明書，用簡并反向引物3(如上)和對應于375bp片段3′端附近序列的嵌套引物(引物14,5′-GCTTTCCTCATCTGTCCTCTCTACG-3′(SEQ ID NO:15)),以0.5ng 7dpc小鼠胎盤Marathon-Ready cDNA為模板，進行5′RACE PCR。嵌套PCR如下進行PCR的第一回合為94℃30秒，然后是5輪的94℃5秒、72℃4分鐘；5輪的94℃5秒，70℃4分鐘；30輪的94℃5秒，68℃4分鐘，最后72℃延伸10分鐘。PCR的第二個嵌套回合如下進行94℃30秒，然后是5輪的94℃5秒，72℃4分鐘；5輪94℃5秒，70℃4分鐘；25輪94℃5秒，68℃4分鐘，最后72℃延伸10分鐘。
將PCR產物克隆到Invitrogen pCR2.1載體中進行序列分析。獲得約900bp的mTll-2PCR產物，它編碼部分蛋白酶結構域、所有的信號肽和前區(qū)，并含有約200bp的5′非翻譯序列。
為了獲得375bp片段和小鼠mTll-2 cDNA序列3′端之間的序列，用簡并正向引物1(上述)和對應于375bp片段5′端附近序列的嵌套引物(引物15，CCTGTGTGACCTTCGTAGAGAGG-3′(SEQ ID NO:16))進行3′RACE PCR。PCR條件與用于小鼠mTll-2序列5′RACE的條件(上述)相同。將PCR產物克隆到pCR2.1中作序列分析。獲得約1200bp的mTll-2 PCR產物，它編碼部分蛋白酶結構域、所有的結構域CUBl、CUB2、EGF1、CUB3、EGF2并終止于CUB3結構域內。用從1200bp片段獲得的序列信息所設計出的寡核苷酸引物對編碼序列的其余部分作PCR擴增。已經確定小鼠mTll-2基因的全長編碼區(qū)，其位于bp191和3229之間或SEQ IDNO:3。
染色體排布。用輻射雜交圖譜(Walter等人，1994)作TLL2圖譜，該方法包括對從Research Genetics獲得的4組輻射雜交物作聚合酶鏈反應(PCR)分析。正向引物5′-TGGGAGCTGAGCAATGCTAACTGC-3′(SEQ ID NO:17)和反向引物5′-GAAGGTGTTCCGGGCGTAGTGCAT-3′(SEQ ID NO:18)分別對應于TLL2內含子6和外顯子7中的序列，用人基因組DNA模板得到1.4kb PCR產物，但用對照中國倉鼠基因組DNA模板沒有得到產物。PCR用100ng模板DNA和10皮摩爾各引物進行，熱循環(huán)程序為95℃5分鐘，然后是30輪的95℃45秒、65℃45秒、72℃3分鐘，最后72℃延伸10分鐘。
在0.8％瓊脂糖凝膠上對PCR產物作電泳，用溴乙錠顯色，將得分提交給Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research的WICGR給圖服務機構。TLL2在GeneBridge 4 Panel輻射雜交物上清晰地圖示位置位于染色體10q，距離標記D10S571 8.66cR,Lod評分為15。另外，Trask(1991)的方法伸展的在雄性中期染色體上進行熒光原位雜交(FISH)，圖示出TLL2在染色體10上的位置。將含有TLL2外顯子的10kb BamHⅠ基因組片段亞克隆到pBluescript Ⅱ KS+中，并用洋地黃毒苷-11-dUTP(Boehringer Mannheim)通過隨機引導作標記。獲得可圖象并如Takahara等人1994所述作分析。僅發(fā)現(xiàn)這兩個染色體上的雙熒光信號在測定的75％中期伸展體(15/20)中的10q24處，在其它染色體上沒能將TLL2定位于該區(qū)域(未顯示)。
組織切片作原位雜交將組織切片固定在玻片上進行原位雜交。小鼠組織將如Lyons等人，″發(fā)育骨骼肌中肌球蛋白基因的表達″，J.Cell Biol.111:1465-1476(1990)中所述那樣固定和包埋。簡言之，將組織固定在含4％多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液中，脫水，并用石蠟浸潤。將5-7微米厚的系列切片固定在明膠化的玻片上。每個玻片固定1-3個切片，用二甲苯脫去石蠟，并重新水化。用蛋白酶K消化切片，后固定，用三乙醇胺/乙酸酐處理、洗滌并脫水。
原位雜交和洗滌程序使切片在52℃50％去離子甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris-HCl、pH7.4、5mMEDTA、10mM NaPO4、10％硫酸葡聚糖、1×Denhardt′s溶液、50μg/ml酵母總RNA、25μmol/ml硫代ATP(Boehringer-Mannheim)和50-75,000cpm/μl35S標記的cRNA探針中雜交過夜。使組織在65℃的50％甲酰胺、2×SSC、10mM二硫蘇糖醇中嚴格清洗；在磷酸鹽緩沖鹽水中漂清；并用20μg/ml RNase A 37℃處理30分鐘。隨后在37℃2×SSC和0.1×SSC中37℃清洗15分鐘后，使載玻片脫水，將其浸在Kodak NTB-2核示蹤乳液中，并在4℃、有干燥劑的不透光箱子中曝光一周。照片在Kodak D-19中顯影。用Zeiss Axiophot顯微鏡的亮視野和暗視野鏡片分析載玻片。
mTll-2基因的亞克隆和表達BMP-1、mTld、mTll-1和mTll-2的成熟活性形式的氨基酸序列是相似的。只是每種蛋白質的C端沒有同源性。C端序列的這種獨特性已被用來生產一系列能區(qū)別這些蛋白質形式的多克隆抗體。在小鼠mTll-2的情況下，使對應于mTll-2最后的17個氨基酸的合成的肽與蛋白質載體鑰孔血蘭素連接，懸浮在鹽水中，與等體積弗氏佐劑混合乳化，注入兩只兔子每只背部皮下3-4處。在加強免疫后12周和16周，放血取血清。這些抗體有商業(yè)用途，可用于試驗顯示細胞、組織和哺乳動物生物體(包括但不局限于模型動物體系如嚙齒類動物和靈長類動物和人)中mTll-2蛋白質的產生和定位。
應注意，獨特的序列存在于蛋白酶、這些蛋白質的CUB和前區(qū)內，并能用來檢測和區(qū)分該家族的各成員。參見Lee,S.J.Biol.Chem.272:19059-19066(1997)。
由于對骨形態(tài)生成蛋白的了解進展迅速，因此區(qū)別各組分的能力不僅在研究方面重要，而且在監(jiān)測BMP體系疾病患者的BMP系統(tǒng)組分的水平和分布上也很重要。這些疾病包括，例如，小鼠和人體的纖維變性疾病或心臟病。此外，由于TLL2基因的缺陷，還可能會有遺傳性發(fā)育異常。采用本文所述的抗體和核酸探針就可確定mTll-2在這些遺傳異常中起的作用。顯然，mTll-2蛋白質在生物發(fā)育中是非常重要的，因為它在胎盤和發(fā)育的心臟中表達。
序列表<110>Greenspan,Daniel S.
Scott,Ian C.
Thomas,Christina L.<120>哺乳動物的特洛德樣基因和蛋白質<130>960296.96111<140><141><150>60/111873<151>1998-12-11<150>60/080550<151>1998-04-03<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>5021<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(365)..(3412)<400>1cgcccattgg ctcctcagcc aagcacgtac accaaatgtc tgaacctgcg gttcctctcg 60tactgagcag gattaccatg gcaacaacac atcatcagta gggtaaaact aacctgtctc 120acgacggtct aaacccaggc agcctcggcc gccgggcaag tagctccgag cggctgcttc 180ccggttgcct cgaagaagac agggggcgcc gcgctccgct tgctccgcgc ctgagccatg 240cccagcagcc ctgtgtaacc accgagtccc ggccggagcc gaccgaccca gtgtgcgccg 300tctttcggcc gagctgagct ttcgtgcacg caactccctc tgccccagcc ggccccgcgc 360cacc atg ccc cgg gcg act gca ctt ggg gcc ctg gtg tca ctg ctg ctg 409Met Pro Arg Ala Thr Ala Leu Gly Ala Leu Val Ser Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctg ccg ctg cct cgc ggc gcc ggg gga ctc ggg gag cgc ccg gac 457Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ala Gly Gly Leu Gly Glu Arg Pro Asp
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1．一種分離的多核苷酸，它包含能在聚合酶鏈反應中擴增的核苷酸序列，該聚合酶鏈反應使用含有SEQ ID NO:7所示序列的第一簡并擴增引物和含有選自SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示序列的第二簡并擴增引物，其中多核苷酸不被ApaⅠ切割。
2．根據權利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸可從人獲得。
3．根據權利要求2所述的多核苷酸，它包含SEQ ID NO:1的核苷酸365至3409的序列。
4．根據權利要求3所述的多核苷酸，它包含SEQ ID NO:1的序列。
5．根據權利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸可從小鼠獲得。
6．根據權利要求5所述的多核苷酸，它包含SEQ ID NO:3的核苷酸191至3229的序列。
7．根據權利要求4所述的多核苷酸，它包含SEQ ID NO:3的序列。
8．一種基因構建物，它包含轉錄啟動子以及與轉錄啟動子操作性相連的多核苷酸，該多核苷酸包含能在聚合酶鏈反應中擴增的核苷酸序列，該聚合酶鏈反應使用含有SEQ ID NO:7所示序列的第一簡并擴增引物和含有選自SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示序列的第二簡并擴增引物，其中多核苷酸不被ApaⅠ切割。
9．根據權利要求8所述的基因構建物，其中多核苷酸可從人獲得。
10．根據權利要求9所述的基因構建物，它包含SEQ ID NO:1的核苷酸365至3409的序列。
11．根據權利要求10所述的基因構建物，它包含SEQ ID NO:1的序列。
12．根據權利要求8所述的基因構建物，其中多核苷酸可從小鼠獲得。
13．根據權利要求12所述的基因構建物，它包含SEQ ID NO:3的核苷酸191至3229的序列。
14．根據權利要求12所述的基因構建物，它包含SEQ ID NO:3的序列。
15．一種多肽，它含有選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的序列。
16．一種選擇調節(jié)mTll-2蛋白活性的試劑的方法，該方法包括下列步驟在支持mTll-2蛋白功能、有和沒有一種或多種推定的活性調節(jié)劑的條件下，評價mTll-2蛋白的活性；和從一種或多種推定的調節(jié)劑中選出與沒有試劑時的該蛋白質活性相比能調節(jié)該蛋白質活性的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼與人或小鼠BMP－1/mTld不同且與人或小鼠mTll－1不同的特洛德樣蛋自的哺乳動物基因。該基因在結構上與BMP－1家族成員的基因相似,但是在基因圖譜中位于不同的位置,并編碼了具有不同活性的不同蛋白。該基因編碼的蛋白質可用來篩選抑制BMP－1家族基因活性以防止結疤、纖維變性等疾病的治療劑。
文檔編號C12N1/21GK1302332SQ9980654
公開日2001年7月4日 申請日期1999年4月2日 優(yōu)先權日1998年4月3日
發(fā)明者D·S·格林斯潘, I·C·斯科特, C·L·托馬斯 申請人:威斯康星校友研究基金會