一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法
【專利摘要】一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法。包括分離培養(yǎng)、液體發(fā)酵和菌劑制備三個(gè)步驟。從土壤中篩選分離培養(yǎng)對(duì)核盤(pán)菌具有拮抗作用的重寄生真菌，通過(guò)改變投放菌核數(shù)量，培養(yǎng)時(shí)間，液體發(fā)酵碳氮比，發(fā)酵液接種濃度，菌漿與硅藻土配比，提高核盤(pán)菌的重寄生真菌有效活菌數(shù)量。篩選培養(yǎng)出特定的拮抗微生物并制備菌劑可防治核盤(pán)菌病害，菌劑重寄生真菌生物活性強(qiáng)。該菌劑可克服化學(xué)農(nóng)藥防治效果差、陳本高、污染環(huán)境和影響食品安全等諸多弊端。
【專利說(shuō)明】一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種真菌菌劑制備方法，具體地說(shuō)是一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerot1rum)是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。可侵染多種農(nóng)作物、果樹(shù)、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物，特別是造成油菜、大豆、向日葵、花生、芹菜和黃瓜等作物產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失。這種病原菌通過(guò)產(chǎn)生菌核在土壤中越冬和越夏存活，并成為下一季的重要初侵染源。目前對(duì)菌核病的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而化學(xué)防治不僅成本高、污染環(huán)境，而且防效也不理想；同時(shí)，食品的安全性也受到嚴(yán)重影響。國(guó)外大量研究結(jié)果表明，土壤中存在著豐富的重寄生真菌，對(duì)菌核有著天然的控制作用。篩選土壤中對(duì)菌核具強(qiáng)烈重寄生作用的真菌是對(duì)這一病害生物防治的重要基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法，篩選培養(yǎng)出特定的拮抗微生物并制備菌劑來(lái)防治核盤(pán)菌病害，菌劑重寄生真菌生物活性強(qiáng)且含量高，以克服化學(xué)農(nóng)藥防治效果差、陳本高、污染環(huán)境和影響食品安全等諸多弊端。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案包括分離培養(yǎng)、液體發(fā)酵和菌劑制備三個(gè)步驟。
[0005]所述分離培養(yǎng)步驟為:
采集根際土樣，以30-50粒/100克土樣加入菌核并混勻，最好以40粒/100克加入核盤(pán)菌菌核并混勻，25°C恒溫誘捕寄生菌，3-4周后取出，最好3.5周后取出，經(jīng)自來(lái)水漂洗、1% NaC1表面滅菌I分鐘和無(wú)菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25°C保溫培養(yǎng)2周后，在體現(xiàn)鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得;
所述液體發(fā)酵步驟包括:
試管培養(yǎng):采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基，將貼帚霉HLD-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，22-28 V下培養(yǎng)4-5天；
擴(kuò)大培養(yǎng):采用液體馬鈴薯葡萄糖H)培養(yǎng)基，將試管中粘帚霉HLD-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上22-28°C振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天作為種子液；
發(fā)酵培養(yǎng):以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，C/N為6:1-15:1，最好C/N為12:1，其它組分及用量同查彼Czapek培養(yǎng)液，121°C高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按6-8%的比例接入發(fā)酵液，最好按7%的比例接入發(fā)酵液，22-280C振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。
[0006]所述菌劑制備步驟為:
硅藻土 121°C高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干2-3天，將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1:1-1.5:1 (V/W)混勻，最好按1.2:1 (V/W)混勻，晾干即可。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:
培養(yǎng)特征:
在PDA上25°C培養(yǎng)，3-10天觀察，菌落生長(zhǎng)速度不是很快，早期形成大量密集白色生菌絲，絨絮狀。后產(chǎn)孢逐漸變成灰綠色，孢子聚集成束狀突起。7天后，整個(gè)菌落中央逐漸塌陷，呈現(xiàn)暗綠至墨綠色。從接種中心至菌落外緣呈塌陷，束狀突起及最外邊的毛絨狀白色生菌絲。菌落背面淡黃色。
[0008]在CMA上25°C培養(yǎng)，氣生菌絲下發(fā)達(dá)，較均勻地著生孢子，孢子團(tuán)淺綠色。不產(chǎn)色素。
[0009]鏡檢形態(tài):
分生孢子梗及分生孢子:分生孢子梗無(wú)色透明，上部著生帚狀分枝，在水中鏡檢觀察共有兩種類型；一種象青霉菌一樣較密集，形成“毛刷”；另一種像輪枝菌，分枝對(duì)稱輪生。分生孢子(瓶梗孢子)2.5-5.5X2.5-3.5 μ m，無(wú)色透明，單細(xì)胞，連續(xù)向頂端產(chǎn)生孢子并集聚于粘液滴中。
[0010]該菌株屬于粘帚霉HLD-1 (Gl1cladium sp.)。
[0011 ] 所述重寄生真菌孢子懸液(濃度為16-1O9個(gè)孢子/ml )，菌核浸泡其中，5分鐘后取出，保濕寄生培養(yǎng)24小時(shí)，然后用l%NaC10表現(xiàn)消毒I分鐘，無(wú)菌水清洗3次，再保濕培養(yǎng)約5-7天，在體視境下觀察到90%以上菌核上長(zhǎng)出上述微生物。這表明上述所述重寄生真菌的孢子在保濕條件下24小時(shí)內(nèi)能夠寄生大部分菌核，所述重寄生真菌對(duì)核盤(pán)菌表現(xiàn)強(qiáng)養(yǎng)倉(cāng)泛力。
[0012]由低到高逐漸改變制備工藝參數(shù)時(shí)，所述分離培養(yǎng)步驟中采集根際土樣，以30-50粒/100克土樣加入菌核并混勻，25°C恒溫誘捕寄生菌，3-4周后取出。所述液體發(fā)酵步驟中發(fā)酵培養(yǎng)以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，C/N為6:1-15:1。所述液體發(fā)酵步驟中將錐形瓶中的培養(yǎng)物按6-8%的比例接入發(fā)酵液。所述菌劑制備步驟中將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1:1-1.5:1 (V/W)混勻。所述重寄生真菌有效活菌數(shù)量為20-30億/克上升到40-50億/克，然后又逐漸下降到30-40億/克。所述重寄生真菌有效活菌數(shù)量最好可達(dá)40-50億/克。

【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
分離培養(yǎng):
采集根際土樣，以30粒/100克土樣加入菌核并混勻，25°C恒溫誘捕寄生菌；3周后取出，經(jīng)自來(lái)水漂洗、l%NaC10表面滅菌I分鐘和無(wú)菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25°C保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離。
[0014]液體發(fā)酵:
試管培養(yǎng):采用固體馬鈴薯葡萄瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將所述重寄生真菌菌株接種在試管培養(yǎng)基上，26 °C下培養(yǎng)4天；
擴(kuò)大培養(yǎng):采用液體馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基，將試管中所述重寄生真菌菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上26°C振蕩黑暗培養(yǎng)4天作為種子液； 發(fā)酵培養(yǎng):以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，C/N為6:1，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)液，121°C高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按6%的比例接入發(fā)酵液，26°C振蕩黑暗培養(yǎng)4天得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。
[0015]菌劑制備:
硅藻土 121°C高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1:1 (V/W)混勻，晾干即可。有效活菌量20-30億/克。
[0016]實(shí)施例2
工藝步驟如實(shí)施例1，所述分離培養(yǎng)步驟中采集根際土樣，以40粒/100克土樣加入菌核并混勻，25°C恒溫誘捕寄生菌，3.5周后取出。所述液體發(fā)酵步驟中發(fā)酵培養(yǎng)以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，C/N為12:1。所述液體發(fā)酵步驟中將錐形瓶中的培養(yǎng)物按7%的比例接入發(fā)酵液。所述菌劑制備步驟中將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1.2:1 (V/W)混勻。有效活菌量40-50億/克。
[0017]實(shí)施例3
工藝步驟如實(shí)施例1，所述分離培養(yǎng)步驟中采集根際土樣，以50粒/100克土樣加入菌核并混勻，25°C恒溫誘捕寄生菌，4周后取出。所述液體發(fā)酵步驟中發(fā)酵培養(yǎng)以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，C/N為15:1。所述液體發(fā)酵步驟中將錐形瓶中的培養(yǎng)物按8%的比例接入發(fā)酵液。所述菌劑制備步驟中將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1.5:1 (V/W)混勻。有效活菌量30-40億/克。
【權(quán)利要求】
1.一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法，包括分離培養(yǎng)、液體發(fā)酵和菌劑制備三個(gè)步驟，其特征在于 所述分離培養(yǎng)步驟為: 采集根際土樣，以30-50粒/100克土樣加入菌核并混勻，251恒溫誘捕寄生菌，3-4周后取出，經(jīng)自來(lái)水漂洗、1% ^^10表面滅菌1分鐘和無(wú)菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，251保溫培養(yǎng)2周后，在體現(xiàn)鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至？0八平板培養(yǎng)，純化分離獲得； 所述液體發(fā)酵步驟包括: 試管培養(yǎng):采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂？0八培養(yǎng)基，將貼帚霉!10-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，22-28 V下培養(yǎng)4-5天； 擴(kuò)大培養(yǎng):采用液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，將試管中粘帚霉10-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上22-281振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天作為種子液； 發(fā)酵培養(yǎng):以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，為6: 1-15:1，其它組分及用量同查彼培養(yǎng)液，1211高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按6-8%的比例接入發(fā)酵液，22-281振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿； 所述菌劑制備步驟為: 硅藻土 1211高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干2-3天，將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1:1-1.5:1 (乂/胃)混勻，晾干即可。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法，其特征是所述分離培養(yǎng)步驟中采集根際土樣，以40粒/100克土樣加入菌核并混勻，251恒溫誘捕寄生菌，3.5周后取出。
3.根據(jù)權(quán)力要求1所述的一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法，其特征是所述液體發(fā)酵步驟中發(fā)酵培養(yǎng)以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源，為12:1。
4.根據(jù)權(quán)力要求3所述的一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法，其特征是所述液體發(fā)酵步驟中將錐形瓶中的培養(yǎng)物按7%的比例接入發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)力要求1所述的一種核盤(pán)菌的重寄生真菌菌劑制備方法，其特征是所述菌劑制備步驟中將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1.2:1 (刺混勻。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK104304328SQ201410501526
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月27日
【發(fā)明者】胡勤星, 李世東, 李延祿, 彭毅 申請(qǐng)人:江蘇天象生物科技有限公司