專利名稱：昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)酸性海藻糖酶基因菌株及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因菌株及其制備方法和用途，尤其涉及昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株 及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
害蟲防治是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分?；瘜W(xué)農(nóng)藥在防治有害生物和保障農(nóng)業(yè)增產(chǎn) 方面起了積極作用。但化學(xué)農(nóng)藥大量長(zhǎng)期使用引起了一系列的環(huán)境和食品安全問題。由于 微生物生物防治具有安全和可持續(xù)控制的優(yōu)點(diǎn)，一直受到人們的廣泛關(guān)注。其中，昆蟲病原 真菌是昆蟲病原微生物中最大的一個(gè)類群，自然死亡昆蟲的60%由其引起，是自然界控制 昆蟲種群數(shù)量的重要因素之一。昆蟲病原真菌主要通過體壁侵染昆蟲，在害蟲持續(xù)控制及 維護(hù)物種多樣性方面具有特殊優(yōu)勢(shì)。目前真菌殺蟲劑已作為化學(xué)農(nóng)藥的替代產(chǎn)品或補(bǔ)充制 劑防治多種有害昆蟲。然而，與其他微生物農(nóng)藥一樣，真菌農(nóng)藥存在殺蟲較慢、防效不穩(wěn)定 等缺點(diǎn)，這極大限制了其廣泛應(yīng)用。提高昆蟲病原真菌殺蟲速度對(duì)擴(kuò)大其應(yīng)用范圍、減少化 學(xué)農(nóng)藥使用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。提高昆蟲病原真菌殺蟲劑殺蟲速度措施主要有(1)通過制劑研究為真菌提供適 宜的微環(huán)境，促進(jìn)真菌快速生長(zhǎng)與侵染；(2)通過菌株篩選獲得高殺蟲活性的菌株；(3)通 過菌株改良獲得高殺蟲活性的菌株。殺蟲真菌制劑研究成果對(duì)促進(jìn)殺蟲真菌產(chǎn)業(yè)化與應(yīng)用 起到推動(dòng)作用，特別是殺蟲真菌油懸浮劑的出現(xiàn)，顯著降低殺蟲真菌環(huán)境濕度依耐性，使得 殺蟲真菌應(yīng)用范圍從森林等蔭蔽區(qū)域擴(kuò)大到干旱、高溫區(qū)域。但是，由于昆蟲病原真菌侵染 昆蟲是兩者相互作用的過程，即便在適宜的環(huán)境條件下，真菌侵染昆蟲直至昆蟲死亡，仍需 要較長(zhǎng)的時(shí)間。通過菌株篩選已獲得針對(duì)多種不同昆蟲的一系列具有高殺蟲活性的昆蟲病 原真菌菌株，其中國(guó)內(nèi)外登記注冊(cè)的真菌農(nóng)藥已有100多種，由于自然菌株是經(jīng)過長(zhǎng)期與 寄主昆蟲相互作用進(jìn)化形成，與寄主昆蟲在自然界中達(dá)到平衡，所以從大量菌株篩選具有 高殺蟲活性的昆蟲病原真菌菌株費(fèi)時(shí)、費(fèi)事。目前，在昆蟲病原真菌致病機(jī)制研究的基礎(chǔ)上 利用基因工程手段改良菌株成為提高昆蟲病原真菌殺蟲活性的重要途徑。昆蟲病原真菌侵染寄主昆蟲主要有3個(gè)過程①分生孢子附著在寄主表皮；②穿 透昆蟲表皮入侵到昆蟲體內(nèi)；③在昆蟲體內(nèi)利用昆蟲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖并分泌毒素直至昆蟲得 病死亡。迄今為止，對(duì)昆蟲病原真菌致病機(jī)制的研究成果主要集中在真菌穿透寄主表皮過 程中產(chǎn)生的一些水解酶類，并分離鑒定多個(gè)與致病相關(guān)的基因，如蛋白酶Prl、幾丁質(zhì)酶等。 St Leger(1996)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功的將Prl基因轉(zhuǎn)入綠僵菌(Metarhizium)，獲得高毒 力的綠僵菌工程菌株。該工程菌株在煙草天蛾的血淋巴中組成性超表達(dá)后激活酚氧化酶系 統(tǒng)，引起幼蟲黑化，導(dǎo)致昆蟲死亡時(shí)間縮短25%，取食量下降40%。2005年Fang等人成功 將昆蟲病原真菌毒力因子-幾丁質(zhì)水解酶Bbchitl基因構(gòu)建在gpd組成性啟動(dòng)子下游轉(zhuǎn)入 白僵菌基因組中，獲得超表達(dá)工程菌株。工程菌株對(duì)蚜蟲的毒力明顯增強(qiáng)與野生菌株相 比，工程菌株對(duì)蚜蟲的致死劑量降低50%，致死時(shí)間縮短50%。Fang等人(2007)將家蠶的 BmChBD融合到Bbchitl中獲得的雜交幾丁水解酶，這個(gè)雜交幾丁水解酶(Bbchitl-BmChBD)的基因與組成性啟動(dòng)子gpd (三磷酸甘油醛脫氫酶)連接后被成功轉(zhuǎn)化到白僵菌中，提高真 菌的表皮穿透能力，與野生菌株相比，工程菌株使昆蟲死亡時(shí)間縮短23%。然而，由于研究難度較大，目前對(duì)病原真菌進(jìn)入昆蟲血腔后到寄主死亡前的時(shí)期 (侵入后)研究較少，而這一時(shí)期又恰是病原真菌與寄主之間生死斗爭(zhēng)的關(guān)鍵時(shí)期，占了 真菌侵染致病過程中絕大部分時(shí)間，縮短病原真菌昆蟲體內(nèi)侵染時(shí)間能有效提高昆蟲病原 真菌殺蟲活性。Wang and St. Leger (2007)通過基因工程的方法將一種昆蟲特異性神經(jīng)毒 素(來(lái)源于黃肥尾蝎)基因AajIT轉(zhuǎn)入綠僵菌，使其侵染寄主昆蟲后在昆蟲血淋巴中特異 表達(dá)；當(dāng)死亡率相同時(shí)，該工程菌株防治煙草天蛾的劑量比野生型菌株降低22倍，縮短防 治埃及伊蚊時(shí)間40%以上；該工程菌株防治咖啡豆蛀蟲的劑量較野生型菌株降低15. 7倍 (Pava-Ripoll等，2008)。Thomas and Read (2007)認(rèn)為由于社會(huì)心理和政治的因素，該方 法被廣泛應(yīng)用還需一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間。采用安全、易被人們接受的基因工程菌縮短病原真菌昆 蟲體內(nèi)侵染時(shí)間成為研究熱點(diǎn)。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲中海藻糖作為血液內(nèi)的一種主要糖分以提供昆蟲活 動(dòng)，昆蟲體內(nèi)海藻糖濃度影響昆蟲的活動(dòng)與行為，而昆蟲病原真菌能分泌一種海藻糖降解 酶利用昆蟲體內(nèi)的海藻糖供其生長(zhǎng)，則海藻糖降解酶是一種昆蟲病原真菌可能的致病因 子。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該海藻糖降解酶為一種酸性酶，昆蟲病原真菌侵染昆蟲后，昆蟲體 內(nèi)酸性海藻糖活性上升，而昆蟲體內(nèi)海藻糖濃度相應(yīng)下降，這進(jìn)一步表明昆蟲病原真菌酸 性海藻糖降解酶(ATM)是一種可能的致病因子，通過基因工程的手段，構(gòu)建真菌ATM超表達(dá) 載體，轉(zhuǎn)化綠僵菌、白僵菌，獲得ATM超量表達(dá)的工程菌，將是一種易被人們接受的提高昆 蟲病原真菌殺蟲活性的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因菌株能超量表達(dá) 同源或異源酸性海藻糖酶。本發(fā)明的另一目的在于提供上述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株的制備方法，本發(fā)明方 法再現(xiàn)性好。本發(fā)明的又一目的在于提供上述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株的用途。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因菌株含有同源或異源酸性海 藻糖酶組成性外源基因。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因菌株酸性海藻糖酶表達(dá)的水平，上述酸性海藻糖酶組成性 外源基因?yàn)?pBarEx-ATM 或 pBGFP-ATM。上述病原真菌為白僵菌或綠僵菌，還可以是擬青霉或輪枝菌等昆蟲病原真菌。上述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，是通過構(gòu)建酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA組成性 表達(dá)載體，然后建立液生分生孢子轉(zhuǎn)化體系，再進(jìn)行選擇性地篩選得到的。上述構(gòu)建酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA組成性表達(dá)載體中的酸性海藻糖酶基因來(lái) 自含有酸性海藻糖酶基因的絲狀真菌或酵母菌；所述絲狀真菌可以是綠僵菌或白僵菌或擬 青霉或輪枝菌或曲霉或小孢子菌等含有酸性海藻糖酶基因的真菌，所述酵母菌可以是畢赤 酵母或釀酒酵母或假絲酵母等含有酸性海藻糖酶基因的酵母菌，優(yōu)選為綠僵菌CQMal02。
具體地說，上述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA 核酸序列，并將其克隆到以除草劑抗性基因(Bar基因)為篩選標(biāo)記的真菌表達(dá)載體pBarEx 或以苯萊特(Benomyl)抗性基因(3 -微管蛋白基因，3-Tubulin)為篩選標(biāo)記的真菌表達(dá) 載體pBGFP，使ATM基因處于來(lái)自構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因的啟動(dòng)子或磷 酸丙糖異構(gòu)酶(tpiA)基因的啟動(dòng)子與色氨酸合成酶(trpC)基因的終止子控制之下，得到 海藻糖酶基因組成性表達(dá)載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；建立利用基因槍法轉(zhuǎn)化綠僵菌或 白僵菌液生分生孢子的體系，將pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到綠僵菌、白僵菌基因組、擬 青霉或輪枝菌中；最后經(jīng)過抗性篩選和聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)法篩選得到。上述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株的制備方法1、構(gòu)建酸性海藻糖酶(ATM)基因組成性表達(dá)載體首先根據(jù)pBGFP構(gòu)建絲狀真菌表達(dá)載體pBarEx 設(shè)計(jì)引物1 (5’ -attagacgtcgcag gtcgacagaagaatgac-3，，下劃線為 Aat II 酶切位點(diǎn))與弓丨物 2 (5，-gtcggccgggcgtcgttctg ggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’ )從構(gòu)巢曲霉基因組DNA中擴(kuò)增色氨酸合成酶啟動(dòng) 子(PtryC)序列；設(shè)計(jì)弓丨物 3 (5，_gcggccgctctagtggatctacc^gagcccagaacgacgcccggccga c-3’，與引物2反向互補(bǔ)系列；其中為Bar基因起始密碼子)與引物4 (5，-CgCggatCCa gcttttattagatctcggtgac-3’，下劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn))從 pCAMBIA 3300 中擴(kuò)增 Bar 基 因序列；以引物1與引物4，采用融合PCR擴(kuò)增PtryC控制下的Bar Cassette ；將pBGFP與 Bar Cassette分別采用AatII與BamHI雙酶切后，用T4連接酶連接構(gòu)建成絲狀真菌表達(dá)載 體 pBarEx ；其次，根據(jù)綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA核酸序列(GenBank登錄 號(hào)EF190950)設(shè)計(jì)的引物 5(5，-cc^g^atgcgcgcgactcccatg-3，，下劃線為 Clal 酶切位 點(diǎn))與引物6 (5，-tcccccRRRctaaaacRctctaccctt-3，，下劃線為Smal酶切位點(diǎn))，以綠僵菌 CQMal02cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出兩端分別帶有Clal與Smal酶切位 點(diǎn)的3303bp的ATM基因全長(zhǎng)cDNA序列，并將其克隆到絲狀真菌表達(dá)載體pBarEx或pBGFP 的Clal和Smal位點(diǎn)之間，使ATM基因處于來(lái)自構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基 因的啟動(dòng)子與色氨酸(trpC)基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組成性表達(dá)載體 pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表達(dá)載體用CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中 并進(jìn)行擴(kuò)增，載體大量提取的產(chǎn)物經(jīng)Spel線性化后去磷酸，再經(jīng)酚-氯仿抽提得到上述線 性化組成性表達(dá)載體；2、建立利用基因槍法轉(zhuǎn)化昆蟲病原真菌液生分生孢子的體系將1ml濃度為107個(gè)/ml的綠僵菌CQMal02或白僵菌CQBb022成熟分生孢子水懸 浮液接種于裝有100ml 1/4強(qiáng)度薩氏液體培養(yǎng)基(1/4SDA) (10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋白胨， 5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6.5)的250ml三角瓶中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)3天，四層滅菌 紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無(wú)菌水重懸清洗2次，最后20 %無(wú)菌甘 油重懸使孢子濃度達(dá)108個(gè)/ml，分裝后-80°C保存；3、轉(zhuǎn)化與篩選轉(zhuǎn)化時(shí)取出50 ill上述液生分生孢子懸浮液與滅菌平皿中央，使其直徑達(dá)到 lcm，然后放入75%乙醇消毒的基因槍室內(nèi)用于轉(zhuǎn)化；按照Bio-Rad系統(tǒng)提供的方法進(jìn)行金粉的處理和線性載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用該系統(tǒng)進(jìn)行微粒子 轟擊；轟擊后在超凈臺(tái)上取出孢子液，用5ml無(wú)菌水稀釋，取lOOul涂布于除草劑草丁膦 (Phosphinothricin, PPT)或苯萊特(Benomyl)篩選培養(yǎng)基平板上，28 °C培養(yǎng)；綠僵菌采 用80ug/ml PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，白僵菌篩選采用10ug/ml PPT或5ug/ ml苯萊特的查氏平板篩選，10天后挑取正常生長(zhǎng)單菌落，在相應(yīng)篩選培養(yǎng)基與1/4SDA 平板上交替?zhèn)鞔?次后提取DNA，利用特異引物對(duì)(5’ -gactgcccgc attgagaag-3'與 5 ’ -agatggaggagttggtgttg-3 ’)，經(jīng)PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因菌株Bar基因，或利用特異引物對(duì) (5，-gcttactcctccttgacaccac-3，與 5，-agccgagtatggtaaccaaggg-3‘)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因菌株 3-Tubulin基因，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因菌株。上述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株在制備真菌農(nóng)藥中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株表達(dá)海藻糖酶的效率高；本發(fā)明制備方法易操 作、重復(fù)再現(xiàn)性好；本發(fā)明昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株應(yīng)用于真菌農(nóng)藥中，該真菌農(nóng)藥作用于 昆蟲體內(nèi)時(shí)，通過轉(zhuǎn)基因菌株的超量表達(dá)酸性海藻糖酶基因，使昆蟲寄主體內(nèi)酸性海藻糖 酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促進(jìn)了病原真菌在寄主昆蟲體內(nèi)生長(zhǎng)，從而有效地提高 了真菌農(nóng)藥如綠僵菌、白僵菌等真菌農(nóng)藥的殺蟲活性。


圖1 酸性海藻糖酶(ATM)基因表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖
(A)pBarEx-ATM
(B)pBGFP-ATM
圖2 綠僵菌、白僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株與空載體轉(zhuǎn)化子PCR馬i證電泳圖
(A) pBarEx-ATM 載體轉(zhuǎn)化
(M)Marker
(l)Ma0E017
⑵ MaVT
(3)MaffT (CQMal02)
(4)Bb0E113
(5) BbVT
(6)BbffT(CQBb022)
(B) pBGFP-ATM載體轉(zhuǎn)化
(M)Marker
(l)Ma0E112
(2)MaffT (CQMal02)
(3)Bb0E093
(4)BbffT(CQBb022)
圖3 轉(zhuǎn)基因菌株酸性海藻糖酶(ATM)基因的表達(dá)量
A 綠僵菌酸性海藻糖酶基因的表達(dá)量；B 白僵菌酸性海藻|套酶基因的表達(dá)量
圖4 綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株對(duì)蝗蟲的生物活性比較
圖5 白僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株對(duì)蝗蟲的生物活性比較圖6 綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株侵染寄主昆蟲后，蝗蟲血 淋巴中酸性海藻糖酶活性圖7 綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株侵染寄主昆蟲后，蝗蟲血 淋巴中酸性海藻糖酶同功酶分析(l)MaffT(2)MaVT(3)Ma0E017(4)空白對(duì)照(棉籽油接種蝗蟲)圖8 綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株侵染寄主昆蟲后，蝗蟲血 淋巴中海藻糖含量圖9 綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株侵染寄主蝗蟲后，在蝗蟲 血淋巴中的生長(zhǎng)量
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例1一種昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株的制備方法1、構(gòu)建酸性海藻糖酶基因組成性表達(dá)載體# 先，卞艮 ig pBGFP(Cao YQ, Peng GX, He ZB, Wang ZK, Yin YP, Xia YX. Transformation of Metarhizium anisopliae with benomyl resistance and green fluorescentprotein genes provides a tag for genetically engineered strains. Biotechnology Letters, 2007, 29 :907_911)構(gòu)建絲狀真菌表達(dá)載體 pBarEx 設(shè)計(jì)引物 1( 5，-attaRacRtcRcaRRtcRacaRaaRaatRac-3，，下劃線為 Aat II 酶切位點(diǎn))與弓丨物 2(5，-gtc ggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3‘) H勾H 曲DNA 中才/“土曾 色氨酸合成酶啟動(dòng)子(pTryC)序列；設(shè)計(jì)引物3(5’ -gcggccgctctagtggatctaccatgagccca gaacgacgcccggccgac-3’，與引物2反向互補(bǔ)系列；其中駐g為Bar基因起始密碼子)與引 物 4(5，-CRCRRatccaRcttttattaRatctcRRtRac-3，，下劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn))從 pCAMBIA 3300 (購(gòu)自CAMBIA公司)中擴(kuò)增Bar基因序列；以引物1和引物4，采用融合PCR擴(kuò)增pTryC 控制下的Bar Cassette ；將pBGFP與Bar Cassette分別采用Aatll與BamHI雙酶切后，用 T4連接酶連接構(gòu)建成絲狀真菌表達(dá)載體pBarEx。其次，根據(jù)綠僵菌CQMal02(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保 存，CGMCC菌株號(hào)0877，在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所可以購(gòu)買到)酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng) cDNA 核酸序列(GenBank 登錄號(hào)EF190950)設(shè)計(jì)的引物 1 (5’-CCATCGATATGCGCGCGACTCCCA TG-3’，下劃線為 Clal 酶切位點(diǎn))與引物 2 (5，-TCCCCCGGGCTAAAACGCTCTACCCTT-3，，下劃線 為Smal酶切位點(diǎn))，以綠僵菌CQMal02cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出兩端 分別帶有Clal與Smal酶切位點(diǎn)的3303bp的ATM基因全長(zhǎng)cDNA序列，并將其分別克隆到絲狀真菌表達(dá)載體pBarEx或pBGFP的Clal和Smal位點(diǎn)之間，使ATM基因處于來(lái)自構(gòu)巢曲 霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因的啟動(dòng)子與色氨酸(trpC)基因的終止子控制之下，分 別得到海藻糖酶基因組成性表達(dá)載體pBarEx-ATM(見附圖1A)或pBGFP_ATM(見附圖1B)， pBarEx-ATM或pBGFP-ATM載體用CaCl2法分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中并進(jìn)行擴(kuò)增，載體大量提取 的產(chǎn)物經(jīng)Spe I線性化后去磷酸，再經(jīng)酚-氯仿抽提得到濃度為500-1000 ug/ml的上述線 性化組成性表達(dá)載體，0D260/280在1. 80-1. 85之間。以pBarEx空白載體為對(duì)照。2、建立昆蟲病原真菌液生分生孢子轉(zhuǎn)化體系將100 u 1的綠僵菌CQMal02或白僵菌CQBb022分生孢子水懸浮液(濃度為107個(gè) /ml)分別接種于裝有100ml 1/4強(qiáng)度薩氏液體培養(yǎng)基(1/4SDA) (10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋 白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6. 5)的250ml三角瓶中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)3-4天，四 層滅菌紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無(wú)菌水重懸清洗2次，最后20 % 無(wú)菌甘油重懸使孢子濃度達(dá)108個(gè)/ml，50 u 1/管分裝后-80°C保存。3、轉(zhuǎn)化與篩選轉(zhuǎn)化時(shí)取50iU分生孢子懸液于滅菌60mm平皿中央，使其直徑達(dá)1cm，然后 放于70%乙醇滅菌基因槍室內(nèi)。按照Biolistic PDS-1000/he Particle Delvery System(Bio-Rad)系統(tǒng)提供的方法進(jìn)行金粉的處理和線性載體pBarEx_ATM或pBGFP-ATM的 包埋，并利用該系統(tǒng)，以1350psi氣壓，27. 5英寸汞(Hg)真空度進(jìn)行微粒子轟擊。以pBarEx 空白載體為對(duì)照。轟擊后取出樣品，在超凈臺(tái)上取出孢子液，用5ml無(wú)菌水稀釋，取lOOul 涂布于除草劑草丁膦(phosphinothricin，PPT)或苯萊特(Benomyl)篩選培養(yǎng)基平板上 26 °C -28°C培養(yǎng)10天左右。綠僵菌與白僵菌篩選培養(yǎng)基分別為含有濃度為80Ug/ml、10Ug/ml PPT或含有濃度 為 5ug/ml 苯萊特(Benomyl)的查氏培養(yǎng)基(2g/l NaN03, lg/1 K2HP04, KC1 0. 5g/l，0. 5g/ lMgS04,0. 01g/l FeS04，30g/l蔗糖，15-20g/l瓊脂，pH自然)。10天后挑取正常生長(zhǎng)單菌落， 在相應(yīng)篩選培養(yǎng)基與1/4SDA平板上交替?zhèn)鞔?次，選取菌落仍然能夠正常生長(zhǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基 因菌株。同時(shí)采用 PCR 方法，以引物對(duì)(5，-gactgcccgc attgagaag-3，與 5，-agatggagga gttggtgttg-3，)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因菌株 Bar 基因或以引物對(duì)(5，-gcttactcctccttgacaccac-3， % 5' -agccgagtatggtaaccaaggg-3‘ )liftt Tubulin轉(zhuǎn)化篩選后分別得到含有Bar基因的ATM綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株與空載體綠僵菌轉(zhuǎn)化 子(Ma0E017，MaVT)與ATM白僵菌轉(zhuǎn)基因菌株與空載體白僵菌轉(zhuǎn)化子(Bb0E113，BbVT)(見 附圖2A)，和含有抗苯萊特基因的ATM綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E112)與ATM白僵菌轉(zhuǎn)基因菌 株(Bb0E093)(見附圖 2B)。為了驗(yàn)證本發(fā)明提供的方法可以提高昆蟲病原真菌孢子的殺蟲活性及其機(jī)制，發(fā) 明人作了如下實(shí)驗(yàn)1、利用定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菌株中酸性海藻糖酶(ATM)基因的表達(dá)量將綠僵菌的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E017)、空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)、出發(fā)菌株 CQMal02 (MaffT)與白僵菌超表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株Bb0E113、空載體轉(zhuǎn)化子(BbVT)、出發(fā)菌株 CQBb022 (BbffT)的分生孢子分別接種在1/4 SDA平板上，28°C恒溫培養(yǎng)12-15天；用接種鏟 輕刮下孢子粉，懸浮在滅菌的0. 01% Tween 80 (w/v)溶液中混勻，四層擦鏡紙過濾后用血 球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制IX 108個(gè)/ml的孢子懸液；按(v/v)的接種量接種于海藻糖為唯一碳源的基本鹽液體培養(yǎng)基(ICM)中(1.0g/l KH2P04,0. 5g/l MgS04,1. Og/1 KCl，2g/l 硫酸 銨，10g/l海藻糖，10g/l MES，初始pH 6.0)中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)，每天取3ml培養(yǎng)液， 4°C 12000g離心收集菌絲。按Promega總RNA提取試劑盒說明書提取菌株總RNA，按Promega 反轉(zhuǎn)錄酶說明書以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，以此為模板，用引物7(5’ -tccttgatgg ctattccgc-3’ )禾口弓丨物 8(5，-gcgccgacccattttgtgattc-3’ )進(jìn)行定量 PGR 檢測(cè) ATM 基因 的表達(dá)，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因?yàn)閰⒄?，見附圖3。從附圖3A可以看出，在海藻糖酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基ICM中培養(yǎng)2-4天，綠僵菌ATM超 表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E017)的ATM基因表達(dá)水平都顯著高于出發(fā)菌株CQMal02(MaWT) (p <0.01)，為出發(fā)菌株(MaWT)的1.7-2. 3倍，而綠僵菌空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)與出發(fā)菌株 (MaWT) ATM基因表達(dá)水平無(wú)顯著差異(p > 0. 05)。與此相似，從附圖3B可以看出，在海藻 糖酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基ICM中培養(yǎng)2-4天，白僵菌ATM超表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株(Bb0E093)的ATM基因 表達(dá)水平上都顯著高于與出發(fā)菌株(BbWT) (p < 0. 01)，而白僵菌空載體轉(zhuǎn)化子(BbVT)與出 發(fā)菌株Bb022 (BbWT)的ATM基因表達(dá)水平無(wú)顯著差異(p > 0. 05)。這說明轉(zhuǎn)ATM基因的綠 僵菌與白僵菌菌株中都能超量表達(dá)ATM基因，而空載體序列不影響ATM基因的表達(dá)。2、綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株殺蟲活性本實(shí)驗(yàn)以綠僵菌CQMal02菌株的寄主昆蟲東亞飛蝗為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定綠僵菌轉(zhuǎn)基 因菌株殺蟲活性。將活化的CQMal02與其轉(zhuǎn)基因菌株孢子用滅菌水配成濃度為1 X 105個(gè)孢子/ml的 孢子懸浮液，均勻涂在直徑為9cm的1/4SDAY平板上(100 yl/皿)，26°C培養(yǎng)15d，完全產(chǎn) 孢。將孢子刮下后放在干燥器中干燥后用棉籽油渦旋分散，靜置10-15min，吸取中層孢子油 懸浮液，采用新鮮煤油(透明)稀釋測(cè)定濃度，根據(jù)濃度將配好的孢子油懸浮液用棉籽油梯 度稀釋至 1. 6 X 105，8 X 105，4 X 106，2 X 107，1 X 108 和 5 X 108 個(gè)孢子 /ml 備用。選取羽化后3-4天的東亞飛蝗健康雄蟲，用微量移液槍吸取5 ill的綠僵菌孢 子油懸浮液，在蝗蟲前胸背板下點(diǎn)滴接種后放入生測(cè)籠中，調(diào)節(jié)溫度26-28°C，相對(duì)濕度 40-70%，每天更換新鮮麥苗或人工飼料，并觀察、記載各處理的死蟲數(shù)。以棉籽油接種為空 白對(duì)照(control)。根據(jù)蝗蟲每天死亡累計(jì)蟲數(shù)采用DPS軟件統(tǒng)計(jì)LT5(I、LT9(I，結(jié)果見附圖4 與表1。從附圖4與表1可以看出，綠僵菌空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)與出發(fā)菌株(MaWT)接 種蝗蟲后存活率無(wú)明顯差異，但接種5天后顯著高于綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E017) (p < 0. 01)；接種后7天，Ma0E017處理組蝗蟲存活率小于10%，而MaVT與MaWT處理組存活率 都約為60%。另外，MaWT LT5。較Ma0E017處理組推遲1.2天(18. 8%)，而LC5Q為Ma0E017 處理組的約15倍(附表1)。這些說明ATM超表達(dá)綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株較出發(fā)菌株對(duì)寄主昆 蟲蝗蟲的生物活性明顯提高。附表1綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株對(duì)蝗蟲室內(nèi)防治效果比
較 3、白僵菌轉(zhuǎn)基因菌株殺蟲活性本實(shí)驗(yàn)以白僵菌CQBb022菌株的寄主昆蟲玉米螟為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定白僵菌轉(zhuǎn)基因 菌株殺蟲活性。按上面方法配制濃度為至1. 6 X 105，8 X 105，4 X 106，2 X 107，1 X 108和5 X 108個(gè)孢 子/ml的白僵菌CQBb022孢子油懸浮液。選取3齡玉米螟幼蟲，放入墊有濾紙的直徑為9cm 培養(yǎng)皿中，置于噴霧塔(BURKARD)載物臺(tái)中央固定，調(diào)節(jié)氣壓為lOpsi，用50iU不同處理處 理白僵菌孢子油懸浮液噴霧后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入生測(cè)室，調(diào)節(jié)溫度25-28°C，放入玉米葉。接種 后，每12小時(shí)觀察一次觀察并記載各處理的死蟲數(shù)。根據(jù)死亡后身體是否變硬判斷為玉米 螟是否為白僵菌侵染致死。以棉籽油接種為空白對(duì)照(control)。根據(jù)玉米螟每天死亡累 計(jì)蟲數(shù)采用DPS軟件統(tǒng)計(jì)LT5(i、LT90O結(jié)果見附圖5與表2。從附圖5與表2可以看出，白僵菌空載體轉(zhuǎn)化子(BbVT)與出發(fā)菌株 CQBb022 (BbffT)接種蝗蟲后存活率無(wú)明顯差異(p > 0. 05)，但在接種4天后顯著高于白僵 菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株BbOEl 13 (p < 0. 01)，接種后7天，當(dāng)BbOEl 13玉米螟存活率小于5 %，而 BbffT與BbVT處理組存活率分別為47. 9%與56. 3%。BbWT對(duì)照組LT5(1較Bb0E093處理組 推遲約0. 9天，而LC5Q為Bb0E093處理組的約13倍。這些說明白僵菌ATM超表達(dá)轉(zhuǎn)基因 菌株較出發(fā)菌株對(duì)寄主昆蟲玉米螟的生物活性明顯提高。附表2白僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株、空載體轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株對(duì)蝗蟲室內(nèi)防治效果比 較 4、感病蝗蟲體內(nèi)酸性海藻糖酶活性、海藻糖含量與綠僵菌生長(zhǎng)量將綠僵菌CQMal02出發(fā)菌株、ATM轉(zhuǎn)基因菌株Ma0E017與空白轉(zhuǎn)化子MaVT孢子用 大豆色拉油懸浮，配成2X 107個(gè)孢子/ml的油懸浮液，接種蝗蟲后3、4、5、6天每處理取出 10只蝗蟲，停食2小時(shí)，將蝗蟲放置于冰上10分鐘，然后蝗蟲后腿內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)膜采血?；认x 血淋巴采集后加入10%體積的無(wú)菌冰冷抗凝血緩沖液(AC buffer 0. 017M乙二胺四乙酸 (EDTA)，0. 041M檸檬酸，pH4. 8)，6000rpm離心6分鐘，分別收集上清與沉淀。以棉籽油接種 后的蝗蟲血淋巴為空白對(duì)照(Control)。酸性海藻糖酶活性測(cè)定取10ul上清置于1. 5ml離心管中，加入20ul海藻糖底 物溶液[含有50mM海藻糖的Mcllvaine緩沖液(22ml 0. 1M檸檬酸+28ml 0. 2M Na2HP04 ；pH5. 6)]，在30°C條件下反應(yīng)30min ； 100°C水浴10分鐘后冰浴5分鐘，4°C下14000g離心 5分鐘之后取10ul上清置于96孔酶標(biāo)板中，加入200ul葡萄糖檢測(cè)試劑(北京中生)[含 0. 5mM 4-氨基安替吡啉，20mM 羥基苯璜酸(p-hydroxybenzene sulphonate)，15，000U/ 1葡萄糖氧化酶和10，000U/1過氧化物酶]在27°C下顯色40min，使用Model 550酶標(biāo)儀 (Bio-rad)，于在490nm下測(cè)光吸收值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酸性海藻糖酶 活性(見附圖6)。酸性海藻糖酶同功酶分析取50ul上清液用4°C ddH20稀釋50倍后裝入超濾 管，4°C下8，000g離心脫鹽濃縮，重復(fù)3次。脫鹽濃縮液后采用寬pH范圍兩性電解質(zhì)(pH 3-10)進(jìn)行在水平板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(PAGE-IEF)。陰極電泳液與陽(yáng)極電泳液分 別為2mM NaOH與2mMH3P04。電泳結(jié)束后，采用覆蓋膠法對(duì)凝膠中酸性海藻糖酶進(jìn)行活性顯 色將10ml含有10g/l海藻糖的0. 1M檸檬酸緩沖液(pH5. 0)、50ul 1000U/ml葡萄糖氧化 酶、50ul 2500U/ml過氧化物酶、2ml 25mg/mL 3-氨基-9-乙基-咔唑(溶解在丙酮中)與 12ml 20g/l瓊脂水溶液(60°C)混合后，均勻傾倒在凝膠表面，然后將凝膠放置在37°C下進(jìn) 行保溫直到出現(xiàn)紅棕色染色條帶。用7%的乙酸對(duì)凝膠進(jìn)行固定(見附圖7)。酸性海藻糖濃度測(cè)定蝗蟲的血淋巴上清液先用Mcllvaine緩沖液稀釋3倍，然后 于100°C加熱10分鐘，4°C下14000g離心5分鐘；取20ul上清液加入2ul海藻糖酶(2. 5U/ ml, sigma)，混勻后于37°C保溫16小時(shí)。設(shè)置空白對(duì)照反應(yīng)，只加2ul海藻糖酶儲(chǔ)藏液 (50%甘油、Tritonx-100和25mM磷酸鉀，PH 6.5)。16小時(shí)反應(yīng)后，于100°C加熱10分 鐘終止反應(yīng)，接著將樣品放在冰上冷卻5分鐘，然后將冷卻后的樣品lOOOOrpm離心5分鐘。 取10ul上清液加入200ul葡萄糖測(cè)定試劑(北京中生)，26°C反應(yīng)40分鐘，使用Model550 酶標(biāo)儀(BioRad)，于490nm的處測(cè)定光吸收值，計(jì)算蝗蟲血淋巴海藻糖含量(見附圖8)?；认x體內(nèi)綠僵菌DNA濃度測(cè)定利用離心后的沉淀提取DNA，以昆蟲病原真菌特異 引物 9(5，-TGGCATCTTCTGAGTGGTG-3，)和引物 10(5，-CCCGTTGCGAGTGAGTTA-3，)進(jìn)行定量 PCR，以綠僵菌DNA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蝗蟲體內(nèi)綠僵菌DNA濃度(見附圖9)。從附圖6可以看出，感病蝗蟲體內(nèi)海藻糖降解酶活性隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)從的 0. 15-0. 3U/ml (接種后3天)逐漸升高到(0. 4-0. 6U/ml)(接種后6天)，都顯著高于健康 蝗蟲體內(nèi)0.08U/ml的水平(p < 0.01)；另外，綠僵菌ATM轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E017)處理組 蝗蟲體內(nèi)海藻糖降解酶活性顯著高于綠僵菌空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)與出發(fā)菌株(MaWT) (p < 0. 01)。由于感病蝗蟲體內(nèi)較空白對(duì)照(Control)多了一個(gè)新的等電點(diǎn)為4. 7的海藻糖 降解酶活性條帶，該條帶與綠僵菌體外分泌的酸性海藻糖降解酶等電點(diǎn)一致(Zhao H，et al.，2007)，并且蝗蟲感病后其自身的海藻糖降解酶活性受到抑制(附圖7)，說明感病蝗蟲 體內(nèi)海藻糖降解酶活性由蝗蟲體內(nèi)綠僵菌分泌的酸性海藻糖酶量決定。附圖7也表明綠 僵菌ATM超表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E017)處理組蝗蟲體內(nèi)海藻糖降解酶活性明顯高于綠僵菌 空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)與出發(fā)菌株(MaWT)。相應(yīng)的，從附圖8可以看出，綠僵菌ATM超表達(dá) 轉(zhuǎn)基因菌株(Ma0E017)處理組蝗蟲體內(nèi)海藻糖濃度顯著低于空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)與出發(fā) 菌株(MaWT)，生物量顯著高于綠僵菌空載體轉(zhuǎn)化子(MaVT)與出發(fā)菌株(MaWT)處理組。這 些說明ATM超表達(dá)綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株在寄主昆蟲體內(nèi)通過超量表達(dá)ATM基因，提高寄主昆 蟲體內(nèi)血淋巴中ATM的活性，增強(qiáng)綠僵菌利用寄主昆蟲體內(nèi)血淋巴中海藻糖的能力，促進(jìn) 綠僵菌在昆蟲體內(nèi)生長(zhǎng)，從而提高菌株的殺蟲活性。
實(shí)施例2昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因工程菌株Ma0E017孢子粉真菌農(nóng)藥的制備將1ml濃度為107個(gè)/ml的綠僵菌轉(zhuǎn)基因工程菌株Ma0E017成熟分生孢子水懸 浮液接種于裝有100ml 1/4強(qiáng)度薩氏液體培養(yǎng)基(1/4SDA) (10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋白胨， 5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6. 5)的250ml三角瓶中，28°C，150rpm振蕩培養(yǎng)3天，準(zhǔn)備液體菌 種；將大米在室溫(25°C )用自來(lái)浸泡4小時(shí)候后裝入蘑菇袋中，121°C滅菌30分鐘后冷卻 至25°C;按重量比為1 10的比例接種轉(zhuǎn)基因工程菌株Ma0E017液體菌種，混合均勻，28°C 下培養(yǎng)15天后用干燥器中用變色硅膠干燥，用80目篩網(wǎng)收集綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株Ma0E017 干孢子粉真菌農(nóng)藥，4 °C密封保存。實(shí)施例3昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因工程菌株Ma0E017油懸浮劑真菌農(nóng)藥的配制將800g的菜籽油和200g含綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株Ma0E017干孢子粉放在攪拌機(jī)中 (1000-1500轉(zhuǎn)/分鐘)混合20分鐘均勻，用80目濾網(wǎng)過濾后配置成20%的綠僵菌油懸浮 劑真菌農(nóng)藥，用油稀釋3-5倍后采用超低容量技術(shù)噴霧。實(shí)施例4昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株Ma0E017可濕性粉劑真菌農(nóng)藥的配制將200g含500億孢子/克綠僵菌轉(zhuǎn)基因菌株Ma0E017干孢子粉、740g硅藻土、30g 脂肪醇聚氧乙烯醚、20g烷基酚聚氧乙烯醚、10g司班放在攪拌機(jī)中(1000-1500轉(zhuǎn)/分鐘) 混合20分鐘均勻，用80目濾網(wǎng)過篩后配制成100億孢子/克可濕性粉劑真菌農(nóng)藥，使用時(shí) 用水稀釋500-2000倍后采用噴霧。
權(quán)利要求
昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因菌株含有同源或異源酸性海藻糖酶組成性外源基因。
2.如權(quán)利要求1所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述酸性海藻糖酶組 成性外源基因?yàn)閜BarEx-ATM或pBGFP-ATM。
3.如權(quán)利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述昆蟲病原真 菌為白僵菌、綠僵菌、擬青霉或輪枝菌。
4.如權(quán)利要求3所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述昆蟲病原真菌轉(zhuǎn) 基因菌株，是通過構(gòu)建酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA組成性表達(dá)載體，然后建立液生分生孢 子轉(zhuǎn)化體系，再進(jìn)行選擇性地篩選得到的。
5.如權(quán)利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述昆蟲病原真 菌轉(zhuǎn)基因菌株，是通過構(gòu)建酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA組成性表達(dá)載體，然后建立液生分 生孢子轉(zhuǎn)化體系，再進(jìn)行選擇性地篩選得到的。
6.如權(quán)利要求4所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述構(gòu)建酸性海藻糖 酶基因全長(zhǎng)cDNA組成性表達(dá)載體中的酸性海藻糖酶基因來(lái)自綠僵菌CQMal02。
7.如權(quán)利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因菌株是通過PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全 長(zhǎng)cDNA核酸序列，并將其克隆到以除草劑抗性基因——Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的真菌表達(dá)載 體pBarEx或以Benomy 1抗性基因——β _微管蛋白基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的真菌表達(dá)載體pBGFP， 使ATM基因處于來(lái)自構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA基因的啟動(dòng)子或磷酸丙糖異構(gòu) 酶tpiA基因的啟動(dòng)子與色氨酸合成酶trpC基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組 成性表達(dá)載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；再建立利用基因槍法轉(zhuǎn)化綠僵菌或白僵菌液生分 生孢子的體系，將pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到綠僵菌、白僵菌基因組、擬青霉或輪枝菌 中；最后經(jīng)過抗性篩選和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法篩選得到的。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株的制備方法，其特征在于a.構(gòu)建酸性海藻糖酶基因組成性表達(dá)載體首先根據(jù)PBGFP構(gòu)建絲狀真菌表達(dá)載體pBarEx 設(shè)計(jì)引物1與引物2從構(gòu)巢曲霉基因 組DNA中擴(kuò)增色氨酸合成酶啟動(dòng)子PtryC序列；設(shè)計(jì)引物3與引物4從pCAMBIA3300中擴(kuò) 增Bar基因序列；以引物1與引物4，采用融合PCR擴(kuò)增PtryC控制下的BarCassette ；將 PBGFP與Bar Cassette分別采用AatII與BamHI雙酶切后，用T4連接酶連接構(gòu)建成絲狀真 菌表達(dá)載體 pBarEx ；所述弓I物 1 為 5，-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3', T^'J^^J Aat II 酶切位點(diǎn)；所述弓I物 2 為 5，-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcgg ccgc-3，；所述弓I物 3 為 5，-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3‘, 與引物2反向互補(bǔ)系列，其中駐g為Bar基因起始密碼子；所述引物4為5，-CgCggatCCagC ttttattagatctcggtgac-3，，下劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn)；其次，根據(jù)綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA核酸序列設(shè)計(jì)的引物5與引物 6，以綠僵菌CQMal02cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出兩端分別帶有ClaI與SmaI 酶切位點(diǎn)的3303bp的ATM基因全長(zhǎng)cDNA序列，并將其克隆到絲狀真菌表達(dá)載體pBarEx或 PBGFP的ClaI和SmaI位點(diǎn)之間，使ATM基因處于來(lái)自構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA 基因的啟動(dòng)子與色氨酸t(yī)rpC基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組成性表達(dá)載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表達(dá)載體用CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中 并進(jìn)行擴(kuò)增，載體大量提取的產(chǎn)物經(jīng)SpeI線性化后去磷酸，再經(jīng)酚-氯仿抽提得到所述線 性化組成性表達(dá)載體；所述引物5為5’ -ccatcgatatgcgcgcgactcccatg-3',下劃線為ClaI 酶切位點(diǎn)；所述引物6為5，-tcccccgggctaaaacgctctaccctt-3，,下劃線為SmaI酶切位點(diǎn)；b.建立利用基因槍法轉(zhuǎn)化昆蟲病原真菌液生分生孢子的體系 將Iml濃度為IO7個(gè)/ml的綠僵菌CQMal02或白僵菌CQBb022成熟分生孢子水懸浮液 接種于裝有IOOml 1/4強(qiáng)度薩氏液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)3 天，四層滅菌紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無(wú)菌水重懸清洗2次，最 后20%無(wú)菌甘油重懸使孢子濃度達(dá)IO8個(gè)/ml，分裝后-80°C保存；所述薩氏液體培養(yǎng)基為 10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6. 5 ；c.轉(zhuǎn)化與篩選轉(zhuǎn)化時(shí)取出50 μ 1所述液生分生孢子懸浮液與滅菌平皿中央，使其直徑達(dá)到lcm，然后 放入75%乙醇消毒的基因槍室內(nèi)用于轉(zhuǎn)化按照Bio-Rad系統(tǒng)提供的方法進(jìn)行金粉的處理 和線性載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用該系統(tǒng)進(jìn)行微粒子轟擊；轟擊后在超 凈臺(tái)上取出孢子液，用5ml無(wú)菌水稀釋，取IOOul涂布于除草劑草丁膦或苯萊特篩選培養(yǎng)基 平板上，28°C培養(yǎng)；綠僵菌采用80ug/ml PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，白僵菌篩選 采用10ug/ml PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，10天后挑取正常生長(zhǎng)單菌落，在相應(yīng) 篩選培養(yǎng)基與1/4SDA平板上交替?zhèn)鞔?次后提取DNA，利用5，-gactgcccgcattgagaag-3' 與5’-agatggagga gttggtgttg-3’的特異引物對(duì)，經(jīng)PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因菌株Bar基因，或利用 5，-gcttactcctccttgacaccac-3，與 5，-agccgagtatggtaaccaaggg-3‘的特異弓丨物對(duì)，驗(yàn)證 轉(zhuǎn)基因菌株β -Tubulin基因，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因菌株。
9.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株在制備真菌農(nóng)藥中的應(yīng)用。
全文摘要
昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株，其含有同源或異源酸性海藻糖酶組成性外源基因；其是通過構(gòu)建酸性海藻糖酶基因全長(zhǎng)cDNA組成性表達(dá)載體，然后建立液生分生孢子轉(zhuǎn)化體系，再進(jìn)行選擇性地篩選制得的；本發(fā)明昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株在制備真菌農(nóng)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株表達(dá)海藻糖酶的效率高；本發(fā)明制備方法易操作、重復(fù)再現(xiàn)性好；本發(fā)明昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株應(yīng)用于真菌農(nóng)藥中，該真菌農(nóng)藥作用于昆蟲體內(nèi)時(shí)，通過轉(zhuǎn)基因菌株的超量表達(dá)酸性海藻糖酶基因，使昆蟲寄主體內(nèi)酸性海藻糖酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促進(jìn)了病原真菌在寄主昆蟲體內(nèi)生長(zhǎng)，從而有效地提高了真菌農(nóng)藥如綠僵菌、白僵菌等真菌農(nóng)藥的殺蟲活性。
文檔編號(hào)A01P7/04GK101886046SQ201010200520
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者夏玉先, 彭國(guó)雄 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)