棒束孢微菌核的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，具體設(shè)及棒束抱微菌核的培養(yǎng)方法及其在防治害蟲(chóng)方 面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 粉風(fēng)類刺吸式口器的害蟲(chóng)常群集于葉片、嫩莖、花蕾、頂芽等部位，刺吸汁液，使葉 片皺縮、卷曲、崎形，嚴(yán)重時(shí)引起枝葉枯萎甚至整株死亡，危害于多種農(nóng)作物、果木、蔬菜等。 目前刺吸式口器害蟲(chóng)防控主要依靠化學(xué)防治，化學(xué)農(nóng)藥的大量施用導(dǎo)致害蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生， 并且污染生態(tài)環(huán)境、影響蔬菜農(nóng)產(chǎn)品安全、威脅人民身體健康;還大量殺傷害蟲(chóng)天敵，破壞 生態(tài)平衡。
[0003] 棒束抱(Isaria)是一類能夠寄生于多種害蟲(chóng)的蟲(chóng)生真菌，能穿透害蟲(chóng)體表進(jìn)入體 內(nèi)，在害蟲(chóng)體內(nèi)繁殖消耗寄主營(yíng)養(yǎng)使害蟲(chóng)致死，能造成害蟲(chóng)局域內(nèi)的流行性病發(fā)生；同時(shí)具 有不污染環(huán)境、無(wú)殘留、對(duì)人畜無(wú)害、害蟲(chóng)不會(huì)產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用 到害蟲(chóng)的生物防治。由于液體發(fā)酵產(chǎn)生的芽生抱子有不耐儲(chǔ)存，致病力低等缺陷，不適宜作 為殺蟲(chóng)制劑的有效成分。目前利用棒束抱進(jìn)行生物防治的有效成分為分生抱子，是通過(guò)液 固兩相發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn)的，但棒束抱產(chǎn)抱需要光照刺激，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、并且分生抱子抗逆 能力差、貨架期短，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高，田間防效不穩(wěn)，影響了棒束抱的產(chǎn)業(yè)化與實(shí)際應(yīng)用。
[0004] 寄生真菌主要類群為絲狀真菌，通常產(chǎn)生菌絲體和分生抱子，少數(shù)種類也可產(chǎn)生 厚垣抱子。真菌微菌核是絲狀真菌度過(guò)高溫、低溫或干旱等不良環(huán)境的休眠繁殖體，是菌絲 體互相糾結(jié)，菌絲變異分化產(chǎn)生的外層致密堅(jiān)硬、有色素沉淀，內(nèi)層髓質(zhì)化的組織體，能夠 在一定的濕度和溫度條件下，重新萌發(fā)進(jìn)行產(chǎn)抱。目前已證實(shí)蟲(chóng)生真菌液體誘導(dǎo)產(chǎn)生的微 菌核能夠作為一種分生抱子的替代有效成分，應(yīng)用于生物防治。目前寄生真菌的菌核或微 菌核的誘導(dǎo)形成僅在白僵菌、綠僵菌和野村菌有報(bào)導(dǎo)，而棒束抱微菌核誘導(dǎo)形成未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種可規(guī)?；a(chǎn)棒束抱微菌核的培養(yǎng)方法 及其應(yīng)用，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)成本低、侵染活力高、抗逆性強(qiáng)的棒束抱新侵染結(jié)構(gòu)體，提供一種防治 害蟲(chóng)的生防制劑，為殺蟲(chóng)真菌制劑的創(chuàng)制提供高質(zhì)量的母藥或原粉，解決目前沒(méi)有有效的 棒束抱微菌核的培養(yǎng)方法，和傳統(tǒng)抱子菌劑抗逆能力差、貨架期短，膽運(yùn)不便的共性技術(shù)難 題。
[0006] 本發(fā)明的目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種棒束抱微菌核的培養(yǎng)方法，其特征在于:包括W下步驟：
[000引1)制備棒束抱抱子接種體；
[0009] 2)微菌核誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟1中制備的棒束抱抱子接種體加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液中振蕩 培養(yǎng)6~8天；
[0010] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液中含有的原料及其含量如下：
[0011] KH2P04:3.0~5.0g/L、CaCl2.2H20:0.6~1.0g/L、MgS04?7H20:0.4~0.8g/L、 C0CI2 ? 6出0:：M~40mg/L、MnS〇4 ?出0:14~20mg/L、ZnS〇4 ? 7出0:12~16mg/LJeS〇4 ? 7出0: 0.1 ~0.4g/L、維生素K3:0.0096-0.0 l72g/L、二甲亞諷溶液：0.05-0 . ImL/L、葡萄糖：12~ 40g/L、酵母膏:4~6g/L、蛋白腺:2.0~3. Og/L;
[0012] 3)將步驟2)振蕩培養(yǎng)得到的發(fā)酵液過(guò)濾，棄去上清液，得到沉淀微菌核，干燥，保 存。
[0013] 步驟1)中所述制備棒束抱抱子接種體的方法為:將活化的棒束抱的抱子或菌絲體 接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在22~25°C下培養(yǎng)10~14天，用0.1~0.5%Tween-80將平板上的 分生抱子洗下，制備成抱子懸浮液，接種到1/4SDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-3化，即得到用于微 菌核誘導(dǎo)培養(yǎng)的接種體。
[0014] 步驟2)中所述棒束抱抱子接種體加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液中后的培養(yǎng)條件為25~28°C， 200~25化pm振蕩培養(yǎng)。
[001引作為優(yōu)選地，步驟2)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液中含有的原料及其含量如下:K出P04:3.5~ 4.5邑/1、化(：12*2出0:0.7~0.9邑/1、]\%504.7出0:0.5~0.7邑/1、(：〇(：12.細(xì)20:36~38111邑/1、 MnS〇4 ?此0:15~17mg/L、ZnS〇4 ? 7此0:13~15mg/L、FeS〇4 ? 7出0:0.15~0.35邑/1、維生素 K3:0.0096-0.0172g/L、二甲亞諷溶液：0.05-0.1 mL/L、葡萄糖：17~35g/L、酵母膏：4.5~ 5.5邑/1、蛋白腺:2.0~3.0邑/1。
[0016] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述培養(yǎng)方法獲得的棒束抱微菌核在防治粉風(fēng) 類害蟲(chóng)中的應(yīng)用。應(yīng)用方式為:將上述培養(yǎng)方法獲得的棒束抱微菌核干燥后與娃藻±或高 嶺± W及助劑按重量比為微菌核;娃藻±或高嶺±:助劑= 8-10: 85-88: 2-5混合后成為微 菌核細(xì)粒劑，用于防治粉風(fēng)類害蟲(chóng)。
[0017] 作為優(yōu)選地，所述助劑為薦糖醋或黃原膠。
[0018] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種防治粉風(fēng)類害蟲(chóng)的生防制劑，包含通過(guò)上述培養(yǎng) 方法獲得的棒束抱微菌核和輔料。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明首次用液體發(fā)酵法能穩(wěn)定大量產(chǎn)生棒束抱微菌核， 產(chǎn)生的微菌核能夠適應(yīng)高溫、干旱、強(qiáng)紫外等外界不良環(huán)境，具有良好的殺蟲(chóng)活性、抗逆耐 儲(chǔ)、發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低、貨架期長(zhǎng)的特點(diǎn);微菌核作為生物制劑的有效成分，可用于規(guī) ?；a(chǎn)新型真菌農(nóng)藥，可W替代分生抱子作為絲狀真菌制劑加工的有效成分。該生產(chǎn)過(guò) 程周期短，成本低廉，生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)污染性廢料產(chǎn)生，十分環(huán)保。本發(fā)明所用的培養(yǎng)液的配 制和液體發(fā)酵工序可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，所用原料易于獲取。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為振蕩培養(yǎng)7天后得到的棒束抱微菌核顯微鏡下100倍圖。
[0021] 圖2為干燥后的棒束抱微菌核在水瓊脂上2地時(shí)萌發(fā)顯微100倍圖。
[0022] 圖3為棒束抱微菌核在水瓊脂上Hd的產(chǎn)抱情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲(chóng)源，如棒束抱和粉風(fēng)，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可 通過(guò)常規(guī)的途徑獲得，如±壤分離或商業(yè)途徑購(gòu)買等。
[0024] 實(shí)施例一棒束抱微菌核誘導(dǎo)培養(yǎng)液配方優(yōu)化和誘導(dǎo)過(guò)程
[0025] 1、棒束抱接種體制備：
[00%]將玫煙色棒束抱CQIF101菌株(來(lái)源于重慶市殺蟲(chóng)真菌農(nóng)藥工程技術(shù)研究中屯、）的 分生抱子接種到PDA平板上，在25°C條件下光照培養(yǎng)（16小時(shí)光:8小時(shí)黑暗）12天，用0.1~ 0.5 % Tween-80滅菌液體將平板上的成熟分生抱子洗下，調(diào)節(jié)分生抱子的濃度，制備成1.0 X IO8抱子/毫升的抱子懸浮液，接種到1/4SDA液體培養(yǎng)基中，在溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速為 25化pm條件下培養(yǎng)24-3化，即得到用于微菌核誘導(dǎo)培養(yǎng)的接種體。
[0027] 2、誘導(dǎo)培養(yǎng)液配方篩選
[002引1)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分濃度：
[0029] W添加 KH2P04:3.0~5.0g/L、CaCl2 ? 2此0:0.6~1.0g/L、MgS〇4 ? 7出0:0.4~0.8g/ L、CoCb ? 6出0::34~40mg/L、MnS〇4 ?出0:14~20mg/L、ZnS〇4 ? 7出0:12~16mg/L作為培養(yǎng)微 菌核的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分。
[0030] 2)碳、氮源的選擇
[0031] 選擇濃度為12~40g/L的葡萄糖作為碳源，4~6g/L酵母膏和2.0~3 . Og/L蛋白腺 作為培養(yǎng)基中的氮源。
[0032] 3)鐵離子濃度的選擇
[0033] WFeSCk ? 7此0作為誘導(dǎo)劑之一，Wo. Ig/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L四個(gè)濃度梯度 進(jìn)行鐵離子濃度的確定。
[0034] 對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、葡萄糖、酵母膏、蛋白腺、FeS化? 7出0按不同濃度 梯度進(jìn)行組合，篩選最佳培養(yǎng)液組分。在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了大量排列組合，制作了多份培養(yǎng)液進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)，將各種液體培養(yǎng)基分別W IOOmL的量分裝到250mLS角瓶中，pH值為5.5-6.5，進(jìn)行 12rC高溫高壓滅菌30分鐘。將前述制備好的接種體按照5%的接種量接種到不同的培養(yǎng)液 中，在溫度為25~28°C，搖床轉(zhuǎn)速為200~25化pm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每種培養(yǎng)液設(shè)3個(gè)重 復(fù)，在6天時(shí)進(jìn)行顯微觀察液體培養(yǎng)基中產(chǎn)微菌核狀況，計(jì)算每種培養(yǎng)液的平均產(chǎn)量。其中 有代表性的培養(yǎng)液的微菌核產(chǎn)量結(jié)果如表1所示：
[0035] 表1培養(yǎng)液不同濃度組分微菌核產(chǎn)量表
[0036]
[00371
[0038] 可見(jiàn)培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、葡萄糖、酵母膏、蛋白腺不同濃度對(duì)微菌核產(chǎn)量影響 差異不大，鐵離子濃度影響差異大，可見(jiàn)FeS〇4 ? 7此0濃度為0.2和0.3g/L時(shí)，微菌核產(chǎn)量顯 著高于化S〇4 ? 7出的農(nóng)度為0.1和0.4g/L的培養(yǎng)液。
[0039] W樣品8的培養(yǎng)液成分來(lái)篩選另一個(gè)主要誘導(dǎo)因子維生素K3的最佳濃度，將維生 素K3溶解在二甲亞諷溶液中加入培養(yǎng)液中。維生素K3不同的濃度梯度為0.0096g/L、 0.0100g/L、0.0140g/L、0.0172g/L、0.0200g/L、0.0256g/L，按照維生素 K30.0096 ~0.0256g 溶解在0.08mL(0.05~0.1 mL均可）的二甲亞諷溶液中溶解維生素K3，然后將溶液進(jìn)行過(guò)濾 除菌后，加入培養(yǎng)液中混勻即可。然后按照前述方法對(duì)培養(yǎng)液滅菌、接種棒束抱接種體，進(jìn) 行搖床培養(yǎng)，每種培養(yǎng)液設(shè)3個(gè)重復(fù)，在6天時(shí)進(jìn)行顯微觀察液體培養(yǎng)基中產(chǎn)微菌核狀況，