玫煙色棒束孢scau-ifcf02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種玫煙色棒束孢SCAU-IFCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝。本發(fā)明針對所述菌株的特點確定影響發(fā)酵效果的關(guān)鍵單因素，在單因素實驗基礎(chǔ)上，建立了產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液初始pH值以及搖床轉(zhuǎn)速之間的特定二次回歸數(shù)學(xué)模型。各因素對產(chǎn)孢量的作用大小依次為：培養(yǎng)液初始pH值＞搖床轉(zhuǎn)速＞培養(yǎng)溫度；經(jīng)過分析總結(jié)出玫煙色棒束孢SCAU-IFCF02菌株液體發(fā)酵的最佳環(huán)境條件為：培養(yǎng)溫度24℃、培養(yǎng)液初始pH值6、搖床轉(zhuǎn)速170rpm，在此條件下該菌株產(chǎn)孢量可達(dá)3.1568×108個孢子/mL。本發(fā)明采用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計，基于本發(fā)明可以保證所述菌株液體發(fā)酵中，優(yōu)化試驗次數(shù)少、周期短、精度高、綜合性好、系統(tǒng)性強、信息量大，并有效消除了各回歸系數(shù)之間的相關(guān)性。
【專利說明】玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工
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【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于無公害微生物農(nóng)藥液體發(fā)酵工藝領(lǐng)域。更具體地，涉及一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]玫煙色棒束孢Usaria fumosorosea)是一種重要的蟲生真菌，屬半知菌亞門{Deuteromycotina)、絲抱綱{Hyphomycetes、、絲抱目(Moniliales、、叢梗抱科(#o/?i7iaceai?)、棒束孢屬(Jsaria)。其地理分布廣泛，寄主多樣，已記載的有25個不同科的昆蟲，包括小菜蛾、麥雙尾蚜和煙粉虱等一些重要農(nóng)業(yè)害蟲，是生物防治中極具開發(fā)應(yīng)用潛力的種類。玫煙色棒束孢的致病力強，對人畜作物及環(huán)境安全，是研究和應(yīng)用最廣的一類微生物殺蟲劑之一。
[0003]玫煙色棒束孢(Jsaria /i/fflosoriosea)在發(fā)酵生產(chǎn)過程中,環(huán)境條件是影響產(chǎn)孢量的重要因素之一。例如一定的溫度、濕度、PH值和光照等。此前的研究表明，玫煙色棒束孢的菌絲生長適溫為8~32°C，最適溫為24~28°C，高溫(30~40°C)比低溫(6~11°C)對生長的影響大，孢子萌發(fā)所需溫度一般比菌絲生長所需溫度范圍更窄。Hall等將玫煙色棒束孢在25 °C條件下，進(jìn)行光照培養(yǎng)4 d后，再轉(zhuǎn)入黑暗中再培養(yǎng)4 d，產(chǎn)孢量比未經(jīng)光照處理的菌株高。陳宜濤等研究表明，玫煙色棒束孢在PH 3~10的范圍內(nèi)均能生長，但中性偏微酸(pH5~7)的環(huán)境比偏酸性(pH3~4)或堿性(pH8~10)環(huán)境更適于其生長，并確定其液相發(fā)酵生產(chǎn)的最適PH值為5~7。吳偉等研究表明，通氣條件對玫煙色棒束孢培養(yǎng)形狀和產(chǎn)孢影響很大。但是這些研`究成果僅僅是單一因素的研究，根據(jù)已有的發(fā)酵條件，玫煙色棒束孢的產(chǎn)孢量仍然很低，且獲得的均是分生孢子。目前用于商品化的真菌制劑大部分是以分生孢子為原料制成，因為芽生孢子在干燥、貯存及在田間應(yīng)用環(huán)境過程中均不穩(wěn)定，容易受到外界不利條件的影響，嚴(yán)重影響了玫煙色棒束孢相關(guān)生物制劑的生產(chǎn)，大大制約了玫煙色棒束孢菌在防治農(nóng)業(yè)害蟲中的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有玫煙色棒束孢菌液體發(fā)酵工藝的技術(shù)不足，提供一種能夠快速、精確的玫煙色棒束孢菌液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝及其確定方法。
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝的確定方法。
[0007]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種玫煙色棒束抱fumosorosea (Wize) Brown & Smith)菌株SCAU-1FCF02液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝的篩選方法，所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株于2013年11月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013526，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)；
所述確定方法為在針對所述菌株的特點確定影響發(fā)酵效果的關(guān)鍵單因素；根據(jù)所確定的關(guān)鍵單因素進(jìn)行篩選分析，結(jié)合二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計方法，以培養(yǎng)溫度、初始PH值和搖床轉(zhuǎn)速為3個試驗因子，以各單因素篩選的最佳值為中心點，以產(chǎn)孢量為測定指標(biāo)，設(shè)計3因素5水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗，建立所述菌株的產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液初始PH值以及搖床轉(zhuǎn)速之間的二次回歸數(shù)學(xué)模型；根據(jù)所得的二次回歸數(shù)學(xué)模型總結(jié)出玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵的環(huán)境條件優(yōu)化工藝。
[0008]本發(fā)明還提供了一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，發(fā)酵的各環(huán)境條件為培養(yǎng)溫度24°C、培養(yǎng)液初始pH值6、搖床轉(zhuǎn)速170 rpm。
[0009]根據(jù)此工藝進(jìn)行發(fā)酵，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的產(chǎn)孢量高達(dá)3.1568 X IO8個孢子/mL。
[0010]上述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，具體的發(fā)酵步驟如下:
51.制備玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液；
52.以上述孢子懸浮液為種子液，按照5%體積比的接種量，將玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液，在培養(yǎng)溫度24°C、搖床轉(zhuǎn)速170 rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0011]其中，步驟SI所述孢子懸浮液的制備方法為:
511.取玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在無菌條件下，用接菌環(huán)取一環(huán)接種于PDA平板進(jìn)行活化，于25°C、光照(14 L:10D)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),最佳培養(yǎng)時間為15d ；
512.待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，加入20mL含有0.03%吐溫-80的無菌水，用接種針輕刮真菌的菌絲及孢子，將菌液倒入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30 min ；
513.待孢子完全分散后，用雙層醫(yī)用紗布過濾菌液，棄去雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘物，獲得分生孢子懸浮液；
514.用血球計數(shù)器計數(shù)孢子懸浮液的孢子濃度，孢子濃度可用含有0.03%吐溫-80的無菌水調(diào)整。
[0012]S2所述發(fā)酵培養(yǎng)為密閉發(fā)酵時，發(fā)酵液與發(fā)酵空間的體積比為3:10。
[0013]如250mL的三角瓶進(jìn)行發(fā)酵時，裝樣量為75mL。
[0014]S2所述的發(fā)酵培養(yǎng)液配方為:葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L，水定容，pH值為6，滅菌備用。
[0015]S3所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為5~8天。
[0016]更優(yōu)選地，S3所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為6天。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
本專利發(fā)明人分離得到的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株對小菜蛾具有非常好的防治效果，是國內(nèi)外所報道的玫煙色棒束孢菌株中致死速度最快的菌株，也是開發(fā)防治小菜蛾真菌制劑的優(yōu)良候選菌株。因此，以玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的常見侵染體分生孢子為活性成分，制備成各種生物制劑農(nóng)藥，能夠為玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為該菌株的田間應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，具有良好的應(yīng)用前景。但是同樣地，目前玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的發(fā)酵存在產(chǎn)孢量低的問題，本領(lǐng)域技術(shù)人員公識，培養(yǎng)溫度、初始PH值和搖床轉(zhuǎn)速等等因素并不是單獨影響真菌的產(chǎn)孢量，往往幾個因素之間是相互影響、相互制衡的，對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化仍然是一個復(fù)雜龐大的課題。另外，目前用于商品化的真菌制劑大部分是以分生孢子為原料制成，但是對靶標(biāo)害蟲有致病力的侵染體包括菌絲、分生孢子、氣生分生孢子和芽生孢子等。其中，氣生分生孢子能夠較好地抵抗不利條件和環(huán)境的影響，更適合做害蟲生物防治的的理想原料。本發(fā)明發(fā)酵優(yōu)化工藝能夠使菌株在較短時間內(nèi)達(dá)產(chǎn)孢高峰，收獲其氣生分生孢子，進(jìn)而縮短工藝時間，為制劑提供原料。
[0018]本發(fā)明人首次將二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計應(yīng)用于玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝的確定，結(jié)合所述菌株的發(fā)酵特點和單因素實驗，總結(jié)得到二次通用旋轉(zhuǎn)回歸方程，進(jìn)一步發(fā)揮二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計方法在優(yōu)化菌株發(fā)酵工藝方面的應(yīng)用，既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數(shù)學(xué)模型，獲得試驗次數(shù)少、周期短、精度高、綜合性好、系統(tǒng)性強、信息量大等優(yōu)點，并消除了回歸系數(shù)之間的相關(guān)性，取得了非常好的效果。
本發(fā)明建立了產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液初始PH值以及搖床轉(zhuǎn)速之間的二次回歸數(shù)學(xué)模型，總結(jié)了各環(huán)境因素對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株產(chǎn)孢量的作用大小依次為:培養(yǎng)液初始卩!1值>搖床轉(zhuǎn)速> 培養(yǎng)溫度，且其中培養(yǎng)液初始pH值為正效應(yīng)，培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速為負(fù)效應(yīng)，隨著培養(yǎng)溫度、初始PH值與搖床轉(zhuǎn)速的不斷增加，玫煙色棒束孢產(chǎn)孢量表現(xiàn)出先增后減的趨勢，表明培養(yǎng)溫度、初始PH值與搖床轉(zhuǎn)速存在一個最適的提取范圍。
[0019]根據(jù)本發(fā)明建立的產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液初始pH值以及搖床轉(zhuǎn)速之間的二次回歸數(shù)學(xué)模型，能夠非常方便的分析出玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵的最佳環(huán)境條件為:培養(yǎng)溫度24°C、培養(yǎng)液初始pH值6、搖床轉(zhuǎn)速170 rpm，在此條件下該菌株產(chǎn)孢量最高可達(dá)3.1568 X IO8個孢子/mL。
另外，本發(fā)明采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對本菌株液體發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，與目前傳統(tǒng)的產(chǎn)用的單因素試驗和正交試驗相`比較，它既能分析各處理因子對發(fā)酵的影響和各處理因子之間的相互作用，又能建立定量的數(shù)學(xué)模型。顯示出在一定的搖床轉(zhuǎn)速(X3)下，產(chǎn)孢量隨著溫度的增加而增加，當(dāng)達(dá)到最大值后，溫度(X1)的增加會使產(chǎn)孢量下降，尤其是在較低或者較高搖床轉(zhuǎn)速的條件下，過低或者過高的溫度(X1)均對產(chǎn)孢表現(xiàn)不利影響，且高溫條件下更明顯；同理，在較低或較高的溫度(X1)下，較低或者較高的搖床轉(zhuǎn)速(X3)均對產(chǎn)孢表現(xiàn)不利影響，可能是因為搖床轉(zhuǎn)速太低，溶氧量不足，搖床轉(zhuǎn)速過高，容易造成菌絲的機(jī)械損傷，進(jìn)而影響產(chǎn)孢。
[0020]本發(fā)明采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，與目前傳統(tǒng)的常用的單因素試驗和正交試驗相比較，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數(shù)學(xué)模型，屬于更高級的試驗設(shè)計技術(shù)，具有試驗次數(shù)少、周期短、精度高、綜合性好、系統(tǒng)性強、信息量大等優(yōu)點，并消除了回歸系數(shù)之間的相關(guān)性。從所建立的回歸方程的偏回歸系數(shù)絕對值的大小可以判斷各因子的重要程度，系數(shù)的正負(fù)表示各因子效應(yīng)作用的方向，本試驗得出的回歸方程可以非常好地應(yīng)用于玫煙色棒束孢液體發(fā)酵工藝的確定，具有很好的實踐指導(dǎo)應(yīng)用價值。
[0021]本發(fā)明獲得的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵的最佳環(huán)境條件工藝為培養(yǎng)溫度24°C、培養(yǎng)液初始pH值6、搖床轉(zhuǎn)速170 rpm,在此條件下該菌株產(chǎn)孢量最高可達(dá)
3.1568X IO8個孢子/mL，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用和規(guī)?；a(chǎn)提供了理論依據(jù)。
[0022]通過所述工藝發(fā)酵獲得的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的分生孢子懸浮液的對小菜蛾具有良好的控制能力，是一種理想的防治十字花科蔬菜小菜蛾的無公害農(nóng)藥，并且具有高效、低毒、低殘留，與環(huán)境相容性好，效果更為穩(wěn)定，是替代高殘留農(nóng)藥的新型生物農(nóng)藥，可以很好的應(yīng)用于該菌株商品制劑的生產(chǎn)。另外，通過本發(fā)明優(yōu)化工藝獲得的分生孢子和芽生孢子可作為進(jìn)一步固體發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)的種子，為液固雙相發(fā)酵工藝的探索提供理論支撐，從而進(jìn)一步縮短發(fā)酵工藝流程和擴(kuò)大工藝生產(chǎn)量。對于我國開發(fā)無公害蔬菜，維護(hù)生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為培養(yǎng)溫度對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響曲線圖。
[0024]圖2為初始pH值對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響曲線圖。
[0025]圖3為搖床轉(zhuǎn)速對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響曲線圖。
[0026]圖4為各單因子效應(yīng)曲線，X1為培養(yǎng)溫度，X2為培養(yǎng)液初始pH值，X3為搖床轉(zhuǎn)速。
[0027]圖5為培養(yǎng)溫度(X1)與搖床轉(zhuǎn)速(X3)交互作用圖，圖中，當(dāng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速均在1、2、3或4所示區(qū)域內(nèi)，產(chǎn)孢量分別為70~100、100~200、200~300或300~400百萬孢子/mL。
【具體實施方式】
[0028]以下結(jié)合附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，`本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0029]以下實例中涉及的玫煙色棒束孢具體為玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，于2013年11月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013526，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)。
[0030]實施例中所用的含有0.03%吐溫-80的無菌水，所述的0.03%指的是體積比。
[0031]實施例1玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株孢子懸浮液的制備 玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液的制備方法如下:
51.取玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在無菌條件下，用接菌環(huán)取一環(huán)接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板進(jìn)行活化，于25°C、光照(14L:10D)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d ；
52.待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，加入20mL含有0.03%吐溫-80的無菌水，用接種針輕刮真菌的菌絲及孢子，將菌液倒入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30 min ；
53.待孢子完全分散后，用雙層醫(yī)用紗布過濾菌液，棄去雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘物，獲得分生孢子懸浮液；
54.用血球計數(shù)器計數(shù)孢子懸浮液的孢子濃度，孢子濃度可用含有0.03%吐溫-80的無菌水調(diào)整。
[0032]用含有0.03%吐溫-80的無菌水配成濃度為I X IO6孢子/mL的孢子懸浮液，供以下實施例使用。[0033]實施例2培養(yǎng)溫度對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響
1、試驗設(shè)置
(O以實施例1制備的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液為種子液進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)液成分為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。裝樣量75mL/250mL，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接種量 5% (V/V)。
[0034](2)搖床培養(yǎng)過程中，遵循單一因子變量原則。初始pH值為培養(yǎng)液的自然pH值，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm ο溫度條件設(shè)置為19°C、22°C、25°C、28°C和31°C，測定不同培養(yǎng)溫度對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響，搖床培養(yǎng)6 d。每隔24 h進(jìn)行菌絲生物量及產(chǎn)孢量的測定，每個處理重復(fù)5次，根據(jù)結(jié)果獲得最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)溫度。
[0035]2、結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)溫度對玫煙色棒束孢液體發(fā)酵過程中菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響如附圖1所示，在5種不同的培養(yǎng)溫度條件下，本菌株菌絲生物量和產(chǎn)孢量均表現(xiàn)出顯著的差異(P < 0.05)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌絲生物量和產(chǎn)孢量均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，整體趨勢大致相同。在25°C時產(chǎn)孢量達(dá)最大值2.9230 X IO8孢子/mL，適溫范圍大致為25~28°C ;而在28°C時菌絲生物量達(dá)到最大值23.17mg/mL，適溫范圍大致為25~31°C。由此可以看出，產(chǎn)孢量和菌絲生物量并非同一溫度條件下達(dá)最大值，產(chǎn)孢量的最佳溫度較菌絲生物量的最佳溫度略低，最適溫區(qū)也相對較窄。
[0036]實施例3初始pH值對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響
1、試驗設(shè)置
(O以實施例1制備的玫煙色棒束孢SCAU-`1FCF02菌株的孢子懸浮液為種子液進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)液成分為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。裝樣量75mL/250mL，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接種量 5% (V/V)。
[0037](2)在所篩選出的產(chǎn)孢量的最佳培養(yǎng)溫度的基礎(chǔ)上，控制搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm。培養(yǎng)液的初始pH值設(shè)置如下:4、5、6、7、8和9，初始pH值通過NaOH和HCl稀釋液進(jìn)行調(diào)配，測定不同初始PH值對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響，其它條件和測定方法同前所述，獲得最佳產(chǎn)孢初始pH值。
[0038]2、結(jié)果顯示，不同初始pH值對玫煙色棒束孢液體發(fā)酵過程中菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響如附圖2所示，在6種不同初始pH值的培養(yǎng)液中，本菌株菌絲生物量和產(chǎn)孢量均表現(xiàn)出顯著的差異(P < 0.05)。兩者的變化趨勢整體上一致，菌絲生物量和產(chǎn)孢量在近中性偏微酸性環(huán)境下產(chǎn)量較高，堿性條件則表現(xiàn)出不利影響，下降趨勢顯著(P < 0.05)。在初始PH值為5~6時，菌絲生物量呈現(xiàn)出最大值約為22 mg/mL，兩者之間差異不顯著(P >
0.05);而在初始pH值為6時，產(chǎn)孢量達(dá)到最大值2.9480 X IO8孢子/mL。由此可見，產(chǎn)孢量對初始PH值的要求更加嚴(yán)格。
[0039]實施例4搖床轉(zhuǎn)速對玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響
1、試驗設(shè)置
(O以實施例1制備的玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液為種子液進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)液成分為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。裝樣量75mL/250mL，玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接種量 5% (V/V)。
[0040](2)在所篩選出的產(chǎn)孢量的最佳培養(yǎng)溫度和最佳初始pH值的基礎(chǔ)上，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置如下:90、120、150、180、210、240和270 rpm，測定不同搖床轉(zhuǎn)速對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響，其它條件和測定方法同前所述，獲得最佳產(chǎn)孢搖床轉(zhuǎn)速。
[0041]2、結(jié)果顯示，不同搖床轉(zhuǎn)速對玫煙色棒束孢液體發(fā)酵過程中菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響如附圖3所示，在7種不同的搖床轉(zhuǎn)速條件下，本菌株菌絲生物量和產(chǎn)孢量均表現(xiàn)出較明顯的差異。隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高，菌絲生物量和產(chǎn)孢量均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，從整體上來看，兩者的變化程度大致相同。在搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm時，菌絲生物量達(dá)到最大值21.43 mg/mL，顯著高于其它轉(zhuǎn)速條件(P < 0.05);在搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm條件下，產(chǎn)孢量達(dá)最大值為3.1140X 108孢子/mL，顯著高于其它轉(zhuǎn)速條件(P < 0.05)。
[0042]實施例5 二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計優(yōu)化玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株發(fā)酵環(huán)境條件
由上述實施例2~4可知，在單因素試驗確定的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)孢量達(dá)最大值為3.1140X IO8孢子/mL，且?guī)讉€因素的配比有成千上萬種組合，因此，本發(fā)明人通過利用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計，建立一種二次回歸數(shù)學(xué)模型，能夠準(zhǔn)確快速的確定玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株發(fā)酵環(huán)境條件最優(yōu)工藝。
[0043]1、根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以培養(yǎng)溫度(X1X初始pH值(X2)和搖床轉(zhuǎn)速(X3)為3個試驗因子，以單因素試驗確定的最佳值為中心點，以產(chǎn)孢量為測定指標(biāo)，設(shè)計3因素5水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗，用以優(yōu)化本菌株液體發(fā)酵產(chǎn)孢的培養(yǎng)條件，每個處理重復(fù)5次。試驗因子及水平如表1所示。
[0044]表1因素水平編碼表
【權(quán)利要求】
1.一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝的確定方法，其特征在于，所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株于2013年11月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013526 ； 所述確定方法為在針對所述菌株的特點確定影響發(fā)酵效果的關(guān)鍵單因素；根據(jù)所確定的關(guān)鍵單因素進(jìn)行篩選分析，結(jié)合二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計方法，以培養(yǎng)溫度、初始PH值和搖床轉(zhuǎn)速為3個試驗因子，以各單因素篩選的最佳值為中心點，以產(chǎn)孢量為測定指標(biāo)，設(shè)計3因素5水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗，建立所述菌株的產(chǎn)孢量與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液初始PH值以及搖床轉(zhuǎn)速之間的二次回歸數(shù)學(xué)模型；根據(jù)所得的二次回歸數(shù)學(xué)模型總結(jié)出玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵的環(huán)境條件優(yōu)化工藝。
2.一種玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，發(fā)酵的各環(huán)境條件為培養(yǎng)溫度24°C、培養(yǎng)液初始pH值6、搖床轉(zhuǎn)速170 rpm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，具體的發(fā)酵步驟如下: 51.制備玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液； 52.以上述孢子懸浮液為種子液，按照5%體積比的接種量，將玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子懸浮液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液，在培養(yǎng)溫度24°C、搖床轉(zhuǎn)速170 rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，步驟SI所述孢子懸浮液的制備方法為: 511.取玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在無菌條件下，接種于PDA平板進(jìn)行活化，光照周期為光照:黑暗=14:10，25°C恒溫培養(yǎng)；` 512.待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，加入含有0.03%吐溫-80的無菌水，洗出菌絲及孢子，對洗出的菌液進(jìn)行攪拌； 513.待孢子完全分散后，過濾，獲得分生孢子懸浮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，S2所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L，水定容，pH值為6，滅菌備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，S2所述發(fā)酵培養(yǎng)為密閉發(fā)酵時，發(fā)酵液與發(fā)酵空間的體積比為3:10。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，S3所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為5~8天。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述玫煙色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液體發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化工藝，其特征在于，S3所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為6天。
【文檔編號】C12R1/645GK103756950SQ201310721114
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】何余容, 張偉, 呂利華, 謝梅瓊, 念曉歌 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)