專(zhuān)利名稱(chēng)：達(dá)托霉素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物純化領(lǐng)域，具體涉及一種達(dá)托霉素的純化方法。
背景技術(shù)：
由革蘭氏陽(yáng)性耐藥菌引起感染的趨勢(shì)在不斷上升。雖然萬(wàn)古霉素等糖肽類(lèi)抗生素對(duì)這些耐藥病原菌，如耐甲氧西林金葡球菌、表皮葡萄球和腸球菌耐藥株等具有一定的治療效果，但近幾年來(lái)，隨著臨床上耐萬(wàn)古霉素革蘭氏耐藥菌的出現(xiàn)，使得這種趨勢(shì)愈發(fā)增大，因此迫切需要尋找一類(lèi)抗生素來(lái)對(duì)抗耐藥菌。達(dá)托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌產(chǎn)生的一種抗生素，如圖1所示，由十三個(gè)氨基酸組成，其中十個(gè)氨基酸組成一個(gè)氨基酸肽環(huán)，另有三個(gè)氨基酸排列成線(xiàn)狀，這三個(gè)氨基酸中末端的L-色氨酸接著一個(gè)十碳癸酸，是一種鈣離子依賴(lài)型的抗生素。在鈣離子存在的條件下，它將以非共價(jià)鍵的形式與細(xì)胞膜上達(dá)托霉素結(jié)合蛋白(DBPs)結(jié)合。達(dá)托霉素對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌具有很好的殺菌作用，可開(kāi)發(fā)成制劑用于包括但不限于耐甲氧西林金黃色葡萄糖菌和耐萬(wàn)古霉素腸球菌引起的感染。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?1805212. 6)和其分案申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?00810087401. X)以及美國(guó)專(zhuān)利US6696412B1等公開(kāi)了達(dá)托霉素的純化方法。利用陰離子樹(shù)脂F(xiàn)P-DA13從發(fā)酵液中富集達(dá)托霉素，接著利用反相樹(shù)脂HP-20SS進(jìn)一步純化達(dá)托霉素，得到半純化的達(dá)托霉素。然后將半純化的達(dá)托霉素過(guò)Poros P150或Poros D50 (Applied Biosystem)純化，得到純度為98%的達(dá)托霉素。該方法提供了一種商業(yè)化可行的分離達(dá)托霉素的方法。 但是，在該方法中使用到了的Poros P150和Poros D50兩種樹(shù)脂，由Applied Biosystem 公司生產(chǎn)，其價(jià)格非常昂貴，而且雖然分離效果較好，但由于其顆粒很細(xì)，在分離純化過(guò)程中需要很大壓力才能達(dá)到一定的流速。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對(duì)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?1805212. 6)和其分案申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?00810087401. X)以及美國(guó)專(zhuān)利US6696412B1等公開(kāi)的達(dá)托霉素的純化方法作進(jìn)一步的改進(jìn)，以降低成本，利于工業(yè)化推廣應(yīng)用。為此，本發(fā)明提供了一種達(dá)托霉素的純化方法，包括將半純化的達(dá)托霉素進(jìn)一步純化的步驟，具體的，所述純化是指將所述半純化的達(dá)托霉素加載結(jié)合到凝膠型弱陰離子樹(shù)脂后進(jìn)行洗脫。本發(fā)明的達(dá)托霉素的純化方法，所述凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為葡聚糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂，所述葡聚糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為葡聚糖凝膠A25，所述葡聚糖凝膠A25在使用前采用含0-4mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液平衡，且所述緩沖液的pH為6 8。所述半純化的達(dá)托霉素加載結(jié)合到葡聚糖凝膠A25后進(jìn)行洗脫，使用體積為柱體積3倍的含0-4mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液洗滌后，采用體積為柱體積10倍的含 0. 1-0. 5mol/L氯化鈉、0-4mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液進(jìn)行洗脫，所述緩沖液的pH 為 6-8。本發(fā)明的達(dá)托霉素的純化方法，所述凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為瓊脂糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂，所述瓊脂糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為DEAE fast flow，所述DEAE fastflow在使用前采用含0-6mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液平衡，且所述緩沖液的pH為6 8。 所述半純化的達(dá)托霉素加載結(jié)合到所述DEAE fast flow上進(jìn)行分離純化，使用體積為柱體積3倍的含0-6mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液洗滌后，采用含體積為柱體積5 10倍的含0. 015-0. 3mol/L氯化鈉、0-6mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液進(jìn)行洗脫， 所述緩沖液的PH為6-8。本發(fā)明的達(dá)托霉素的純化方法，所述半純化的達(dá)托霉素經(jīng)步驟:A)、采用陰離子數(shù)脂從達(dá)托霉素發(fā)酵液中富集達(dá)托霉素粗溶液；B)、采用反向樹(shù)脂純化所述達(dá)托霉素粗溶液制得。本發(fā)明的純化方法，使用的凝膠型樹(shù)脂，原料易得、相對(duì)廉價(jià)、易于工業(yè)化推廣應(yīng)用。在緩沖液中添加尿素，破壞非共價(jià)鍵，有利于從樹(shù)脂上洗脫達(dá)托霉素。本發(fā)明的純化方法，得到的達(dá)托霉素的純度高于98%。


圖1為達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)圖。圖2為純化后達(dá)托霉素的HPLC檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明中，HPLC條件如下
流動(dòng)相A相乙睛緩沖液(10 90)
B相乙睛緩沖液(45 55)
緩沖液0.5% (NH4)H2PO4
梯度(ISmin)
色譜柱Hypersil C18，4. 6*250mm，5 μ m
柱溫:35°C
檢測(cè)器DAD (HPllOO)檢測(cè)器
檢測(cè)波長(zhǎng):223nm
流速:1. 5ml/min
進(jìn)樣量:5μ 1
洗脫方式如表1所示。
表UHPLC洗脫方案
權(quán)利要求
1.一種達(dá)托霉素的純化方法，包括將半純化的達(dá)托霉素進(jìn)一步純化的步驟，其特征在于，所述純化是指將所述半純化的達(dá)托霉素加載結(jié)合到凝膠型弱陰離子樹(shù)脂后進(jìn)行洗脫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為葡聚糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，所述葡聚糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為葡聚糖凝膠A25。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化方法，其特征在于，所述葡聚糖凝膠A25在使用前采用含 0-4mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液平衡，且所述緩沖液的pH為6 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化方法，其特征在于，所述洗脫是指使用體積為柱體積3 倍的含0-4mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液洗滌后，采用體積為柱體積10倍的含 0. 1-0. 5mol/L氯化鈉、0-4mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液進(jìn)行洗脫，所述緩沖液的 pH 為 6-8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為瓊脂糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠型弱陰離子樹(shù)脂為 DEAE fast flow。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化方法，其特征在于，所述DEAEfast flow在使用前采用含0-6mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液平衡，且所述緩沖液的pH為6 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化方法，其特征在于，所述洗脫是指使用體積為柱體積3倍的含0-6mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液洗滌后，采用含體積為柱體積5 10倍的含0. 015-0. 3mol/L氯化鈉、0-6mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液進(jìn)行洗脫，所述緩沖液的PH為6-8。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述半純化的達(dá)托霉素經(jīng)以下步驟制得A)、采用陰離子數(shù)脂從達(dá)托霉素發(fā)酵液中富集達(dá)托霉素粗溶液；B)、采用反向樹(shù)脂純化所述達(dá)托霉素粗溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種達(dá)托霉素的純化方法，將半純化的達(dá)托霉素加載結(jié)合到凝膠型弱陰離子樹(shù)脂后進(jìn)行洗脫。本發(fā)明的純化方法，得到的達(dá)托霉素純度高于98％，且原料易得、相對(duì)廉價(jià)、易于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102276696SQ20101019624
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者夏興, 孫新強(qiáng), 戈梅, 李秋爽, 楊天, 楊志均, 羅敏玉, 蘇永槐, 阮林高, 陳代杰 申請(qǐng)人:上海來(lái)益生物藥物研究開(kāi)發(fā)中心有限責(zé)任公司, 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠(chǎng)