專利名稱：一種分離純化達托霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及達托霉素的制備方法，具體的說涉及一種采用陶瓷膜過濾、樹脂層析以及結(jié)晶技術(shù)制備高純度達托霉素的方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的發(fā)展及抗生素的濫用，病原菌對抗生素的耐藥性是當(dāng)今社會面臨的最嚴峻挑戰(zhàn)。除了控制抗生素濫用外，目前尋找一種有效的對抗耐藥菌的抗生素成了解決這一問題的最佳途徑，萬古霉素曾被認為是對抗革蘭氏陽性菌的最后一道防線，但現(xiàn)在全世界臨床已發(fā)現(xiàn)越來越多的耐此藥菌。
達托霉素(Daptomycin)是由LillyGL^)公司最初研究,Cubist制藥公司開發(fā)的一環(huán)脂肽類抗生素。應(yīng)病人對新型耐藥抗生素的迫切需求，2003年底，美國食品與藥物管理局(FDA)經(jīng)過快速審理程序批準注射用達托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治療由一些革蘭氏陽性敏感菌株引起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染，如膿腫、手術(shù)切口感染和皮膚潰瘍。達托霉素的作用機制與其他抗生素不同，它通過擾亂細胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成，改變細胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過破壞細菌的細胞膜，使其內(nèi)容物外泄而達到殺菌的目的，因此細菌對達托霉素產(chǎn)生耐藥性可能會比較困難。達托霉素雖然已經(jīng)在美國實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但在中國并未實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，其主要原因在于沒有能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化的提取技術(shù)?，F(xiàn)有的達托霉素提取方法，例如中國專利申請200910058577. 7所描述的達托霉素提取方法，僅采用大孔樹脂分離純化達托霉素，所得的達托霉素色譜純度僅為80% -90%，不但不能滿足制藥需求，而且因為其成本高昂而無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。中國專利申請200910085837. X雖然采用離子交換樹脂方法獲得高純度的達托霉素，但是因存在達托霉素被嚴重破壞的問題而無法實現(xiàn)分離純化達托霉素的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、成本低廉同時又能制得高純度達托霉素的制備方法。其包括如下步驟I)將達托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH2. 0-4. 5后，用膜孔徑為O. 01 μ m_0. I μ m的陶瓷膜進行過濾，然后用pH2. 0-4. O的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜,棄濾液，再用pH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達托霉素濾液；2)將步驟I)所得達托霉素濾液調(diào)節(jié)pH4. 5-7. O,經(jīng)弱堿性陰離子交換樹脂吸附、洗脫后得到達托霉素解吸液；3)將步驟2)所得達托霉素解吸液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附、解吸脫色后得達托霉素脫色液；4)將步驟3)所得達托霉素脫色液經(jīng)截留分子量為50-500的納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到達托霉素濃縮液；5)將步驟4)所得達托霉素濃縮液調(diào)節(jié)pH5. 0-7. 0，然后加入無機鈣鹽和醇類溶劑進行結(jié)晶，晶體過濾干燥后得到固體達托霉素。上述步驟I)中，首先將發(fā)酵液pH調(diào)至2. 0-4. 5，由于達托霉素等電點為PI3. 5，在pH2. 0-4. 5的條件下，達托霉素形成分子量很大的膠束，不會透過陶瓷膜。洗滌所用的PH2. 0-4. O酸性水溶液可以采用磷酸溶液，其用量通常是發(fā)酵液體積的1-2倍；所述堿性水溶液可以是PH8-10的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，其用量以發(fā)酵液體積的4-5倍為宜。洗滌完后，達托霉素的收率在92%以上。上述步驟2)采用弱堿性陰離子交換樹脂分離系統(tǒng)分離純化達托霉素，優(yōu)選D301樹脂，D301樹脂價格便宜，成本低，而且它對達托霉素的選擇性較強。D301樹脂的裝填內(nèi)徑和高度比一般為I : 5 I : 7，優(yōu)選為I : 6。洗脫液可采用pH5. 5-6. O的NaCl溶液。 上述步驟3)采用大孔樹脂分離系統(tǒng)進一步分離純化達托霉素，優(yōu)選為HZ20樹月旨，這種樹脂價格便宜，顆粒較粗，不易造成堵塞。HZ20樹脂的裝填內(nèi)徑和高度比一般為
I: 5 I : 7，優(yōu)選為I : 6。用大孔樹脂吸附達托霉素后，可先用15%-20%乙醇溶液清洗大孔樹脂,再用30% -35%的乙醇溶液將達托霉素洗脫下來。上述步驟4)納濾膜的截留分子量優(yōu)選為100-200。上述步驟5)無機鈣鹽的加入量以濃縮液中所含達托霉素質(zhì)量的30% 50%為宜，所述無機鈣鹽例如氯化鈣、乙酸鈣。所述醇類溶劑常用的有乙醇和異丙醇，其加入量通常是濃縮液體積的3-6倍。上述各步驟，一般的，采用磷酸、乙酸和氫氧化鈉來調(diào)節(jié)溶液的pH。在本發(fā)明方法中，達托霉素發(fā)酵液經(jīng)過陶瓷膜系統(tǒng)、弱堿性陰離子交換樹脂分離系統(tǒng)和大孔樹脂分離系統(tǒng)分離純化和脫色處理后，收集純度85%以上組分再經(jīng)過納濾膜系統(tǒng)濃縮至濃度20%左右，加醇類溶劑結(jié)晶，晶體過濾干燥后得到的達托霉素固體其色譜純度在98%以上。該方法簡單易行，成本低廉，適合進行工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式以下通過實施例進一步描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實施例所用實驗材料均為達托霉素發(fā)酵液，其為pH7. O左右的較粘稠料液。實施例I將達托霉素發(fā)酵液用磷酸調(diào)節(jié)至pH3. O后，經(jīng)過孔徑O. 05 μ m的陶瓷膜過濾除去達托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，然后用原料液1-2倍體積的pH3. O的磷酸水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜(濾液棄去)，再用原料液4-5倍體積的pH9. O的氫氧化鈉溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)ρΗ5· 5過D301樹脂，水洗D301樹脂，然后在ρΗ5· 5-6. O用300mM的NaCl溶液洗脫。所得洗脫物用稀乙酸調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5并加入料液體積10%的乙醇后過HZ20樹脂(上海華震公司生產(chǎn)的大孔吸附樹脂)，用15% -20%乙醇溶液(注乙醇溶液的百分濃度指體積百分濃度，下同)清洗HZ20樹脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脫。洗脫物經(jīng)過截留分子量為100-200的納濾膜納濾濃縮，濃縮后達托霉素濃度在20% (w/w)。將所得濃縮液用稀乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 0，加入該濃縮液中達托霉素質(zhì)量含量40 %左右的乙酸鈣，加入濃縮液4倍體積的95 %乙醇，冰箱放置15h，過濾干燥，得到的固體達托霉素。采用高效液相色譜法(檢測條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION0FDAPT0MYCIN”(EP I 586 580 A2)公開的方法相同)檢測達托霉素純度，其純度在99%以上。實施例2將達托霉素發(fā)酵液用磷酸調(diào)節(jié)至pH3. 5后，經(jīng)過孔徑O. 05 μ m的陶瓷膜過濾除去達托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，然后用原料液1-2倍體積的pH3. O的磷酸水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜(濾液棄去)，再用原料液4-5倍體積的pHIO的氫氧化鈉溶液 循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。 將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)ρΗ5· 5過D301樹脂，水洗D301樹脂，然后在ρΗ5· 5-6. O用300mM的NaCl溶液洗脫。所得洗脫物用稀乙酸調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5并加入料液O. I倍體積的乙醇后過HZ20樹月旨，用15% -20%乙醇溶液清洗HZ20樹脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脫。洗脫物經(jīng)過截留分子量為100-200的納濾膜納濾濃縮，濃縮后達托霉素濃度在20% (w/w)。將所得濃縮液用稀乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 0，加入該濃縮液中達托霉素質(zhì)量含量40 %左右的乙酸鈣，加入濃縮液4倍體積的95 %乙醇，冰箱放置15h，過濾干燥，得到的固體達托霉素，經(jīng)高效液相色譜法檢測，其純度在99%以上。實施例3將達托霉素發(fā)酵液用磷酸調(diào)節(jié)至pH3. O后，經(jīng)過孔徑O. 05 μ m的陶瓷膜過濾除去達托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，然后用原料液O. 5-1倍體積的pH3. O的磷酸水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜(濾液棄去)，再用原料液2-3倍體積的pHIO. O的氫氧化鈉溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)pH6. 0-7. O過D301樹脂，水洗D301樹脂，然后在pH6. 0-7. O用300mM的NaCl溶液洗脫。所得洗脫物用稀乙酸調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5并加入料液0. I倍體積的乙醇后過HZ20樹月旨，用15% -20%乙醇溶液清洗HZ20樹脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脫。洗脫物經(jīng)過截留分子量為100-200的納濾膜納濾濃縮，濃縮后達托霉素濃度在20% (w/w)左右。將所得濃縮液用稀乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 5-7. O,加入該濃縮液中達托霉素質(zhì)量含量40%左右的乙酸鈣，加入濃縮液5倍體積的95%乙醇，冰箱放置15h，過濾干燥，得到的固體達托霉素，經(jīng)高效液相色譜法檢測，其純度在98 %以上。本發(fā)明所用膜在使用后均要用膜清洗劑清洗，必要時用0. 5%亞硫酸氫鈉溶液浸泡保存，以達到膜的重復(fù)利用。本發(fā)明綜合采用膜、層析技術(shù)及結(jié)晶手段提供一種生產(chǎn)可行、成本低廉的制備高純度達托霉素的工藝技術(shù)。雖然本文已經(jīng)對該發(fā)明進行了詳盡的描述，但可以理解，在不違背本發(fā)明精神和實質(zhì)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以做一些修改或變動，這些修改或變動均在本發(fā)明要求保護的范圍之內(nèi) 。
權(quán)利要求
1.一種分離純化達托霉素的方法，包括下述步驟 1)將達托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)PH2.0-4. 5后，用膜孔徑為O. 01 μ m-0. I μ m的陶瓷膜進行過濾，然后用PH2. 0-4. O的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，棄濾液，再用PH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達托霉素濾液； 2)將步驟I)所得達托霉素濾液調(diào)節(jié)pH4.5-7.0，經(jīng)弱堿性陰離子交換樹脂吸附、洗脫后得到達托霉素解吸液； 3)將步驟2)所得達托霉素解吸液經(jīng)大孔樹脂吸附、解吸脫色后得達托霉素脫色液； 4)將步驟3)所得達托霉素脫色液經(jīng)截留分子量為50-500的納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到達托霉素濃縮液； 5)將步驟4)所得達托霉素濃縮液調(diào)節(jié)pH5.0-7. 0，然后加入無機鈣鹽和醇類溶劑進行結(jié)晶，晶體過濾干燥后得到固體達托霉素。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中洗滌所用的pH2.0-4. O酸性水溶液米用磷酸溶液，其用量是發(fā)酵液體積的1_2倍。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述堿性水溶液為氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，其用量為發(fā)酵液體積的4-5倍。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)所述弱堿性陰離子交換樹脂為D301樹脂，其裝填內(nèi)徑和高度比為I : 5 I : 7。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)采用pH5.5-6. O的NaCl溶液將達托霉素從弱堿性陰離子交換樹脂上洗脫下來。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)所述大孔樹脂為HZ20樹脂，其裝填內(nèi)徑和高度比為I : 5 I : 7。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)用大孔樹脂吸附達托霉素后，先用15% -20%乙醇溶液清洗大孔樹脂，再用30% -35%的乙醇溶液將達托霉素洗脫下來。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟4)所用納濾膜的截留分子量為100-200。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟5)中無機鈣鹽的加入量是濃縮液中所含達托霉素質(zhì)量的30% 50% ;醇類溶劑的加入量為濃縮液體積的3-6倍。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟5)中所述無機鈣鹽是下列鈣鹽中的一種或多種乙酸鈣和氯化鈣；所述醇類溶劑為乙醇或異丙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離純化達托霉素的方法，該方法使達托霉素形成膠束，經(jīng)陶瓷膜系統(tǒng)過濾后，再采用弱堿性陰離子交換樹脂分離系統(tǒng)和大孔樹脂分離系統(tǒng)進行分離純化和脫色處理，最后結(jié)晶，獲得色譜純度大于98％的達托霉素固體。本發(fā)明方法簡單易行，成本低廉，適合進行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/36GK102875652SQ20111019474
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者趙燕, 趙德, 肖祖梅 申請人:北大方正集團有限公司, 北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大國際醫(yī)院集團有限公司