專利名稱：一種高純度達托霉素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種高純度達托霉素的制備方法。
背景技術(shù)：
達托霉素是脂肽類家族的一員，屬于環(huán)十脂肽結(jié)構(gòu)群，由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)發(fā)酵而得,是目前全球首個成功開發(fā)的環(huán)脂肽類抗生素。達托霉素結(jié)構(gòu)新穎，殺菌機制獨特，能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，并殺死革蘭氏陽性菌，特性表現(xiàn)為抑制作用迅速、體內(nèi)與體外殺菌作用所需的濃度低，抗生素作用的有效性時間長。達托霉素的化學(xué)式為C72HltllN17O26，分子量為1620. 67，其結(jié)構(gòu)式如下
O NH2
MCkf 八、ZΓ Y" I
f 丫_4<^ 0 H °
Η\^( ° O.I- (CH-I)8CH'
_CO2Hpj
HN>/=OΗ
HCteMN
HO2C^
達托霉素由美國禮來公司于20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)，1997年Cubist公司獲得了達托霉素的全球獨家開發(fā)、生產(chǎn)及銷售權(quán)。Cubist公司經(jīng)過長達六年的體外試驗證實達托霉素對多重耐藥革蘭氏陽性菌有快速有效的濃度依賴性殺菌作用。在臨床上與萬古霉素相比表現(xiàn)出抗菌譜廣、藥效快、給藥量少、毒副反應(yīng)輕等優(yōu)點，是目前世界上公認(rèn)的萬古霉素等現(xiàn)用抗生素的最佳替代品。此外更重要的是，達托霉素在體外對已呈現(xiàn)甲氧西林、萬古霉素和利奈唑烷等耐藥性質(zhì)的分離菌株如耐甲氧西林金葡菌、糖肽類敏感的金葡菌、耐青霉素類肺炎鏈球菌)等均有高效低毒的殺菌效果，并且用藥次數(shù)少，治療成本低。2003年FDA批準(zhǔn)了達托霉素注射劑用于治療由革蘭氏陽性菌所致的復(fù)雜皮膚和軟組織感染，以及金葡菌引起的菌血癥和右側(cè)心內(nèi)膜炎，其安全性和耐受性好，是一種應(yīng)用前途廣闊的抗生素。目前，關(guān)于高純度達托霉素制備方法的報道不多。美國卡比斯特制藥公司申請的中國專利CN1404487公開了一種用陰離子樹脂純化達托霉素的方法，該方法交替使用陰離子樹脂F(xiàn)P-DA13、大孔樹脂HP-20SS、陰離子樹脂PorosD50或Poros 150對達托霉素進行分離提純，可以得到純度98%的達托霉素產(chǎn)品，但該工藝繁瑣，且成本高，難于實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。中國專利CN101830970A和CN102276696A在CN1404487基礎(chǔ)上進行了工藝改進，CN101830970A是采用緩沖溶液將達托霉素粗品配成樣品溶液，然后上復(fù)合型YT-Ol反相硅膠材料柱吸附，再用強極性溶劑的水溶液作解吸劑進行梯度洗脫或恒定濃度洗脫；CN102276696A是將半純化的達托霉素加載結(jié)合到凝膠型弱陰離子樹脂后進行洗脫。這兩個專利技術(shù)雖然簡化了流程、降低了成本，但仍難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。達托霉素難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，一是因為沒有好的工業(yè)化生產(chǎn)菌種，二是因為沒有合適的工業(yè)化后提取技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡便、成本低廉，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的高純度達托霉素的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種高純度達托霉素的制備方法，包括對達托霉素發(fā)酵液的濾液進行粗提的步驟、精提的步驟，所述粗提是將達托霉素發(fā)酵液的濾液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進行吸附，用解吸劑對大孔吸附樹脂進行梯度解吸，然后對解吸液進行減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得到達托霉素粗品，粗品的HPLC含量為90%左右；所述精提是將達托霉素粗品用極性溶劑溶解，然后將所得的溶解液注入聚合物納米微球柱進行層析分離，再用洗脫劑對聚合物納米微球柱進行梯度洗脫，并收集HPLC含量大于等于 98. 5%的洗脫液，再將此洗脫液減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98. 5%的達托霉素O本發(fā)明的進一步改進在于所述達托霉素發(fā)酵液的濾液的制備是向達托霉素發(fā)酵液中加入助濾劑，經(jīng)攪拌混合后對達托霉素發(fā)酵液進行過濾，而制得達托霉素發(fā)酵液的濾液。本發(fā)明的進一步改進在于上述助濾劑的用量為每100L達托霉素發(fā)酵液中加入O. 5kg 5kg助濾劑。優(yōu)選為I kg 3 kg。本發(fā)明的進一步改進在于上述助濾劑為珍珠巖或硅藻土的其中一種或者其混合物。本發(fā)明的進一步改進在于所述大孔吸附樹脂為LX-50、D113或D312樹脂的其中一種。優(yōu)選為D312樹脂。本發(fā)明的進一步改進在于對大孔吸附樹脂進行梯度解吸的解吸劑的體積百分濃度分別為30% 40%和70% 75%。本發(fā)明的進一步改進在于所述聚合物納米微球為UNIPS30RPC。本發(fā)明的進一步改進在于所述對聚合物納米微球進行梯度洗脫的洗脫劑的體積百分濃度分別為30% 40%和55% 60% ;所述極性溶劑為70%體積百分濃度的甲醇或者乙醇水溶液。本發(fā)明的進一步改進在于所述解吸劑或洗脫劑為乙醇水溶液或甲醇水溶液。本發(fā)明的進一步改進在于所述粗提和精提步驟中對解吸液或者洗脫液的濃縮是將解吸液或者洗脫液中達托霉素的濃度濃縮為100 120g/L ;所述結(jié)晶是向濃縮液中加入6 8倍量的丙酮或者異丙醇進行重結(jié)晶，結(jié)晶后所得的結(jié)晶粉在40°C 50°C條件下真空干燥24h。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明取得的技術(shù)進步是本發(fā)明的方法是一種制備高純度達托霉素的方法，其操作簡便、成本低廉，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明在固液分離過程中加入助濾劑，在提高過濾速度、縮短工藝周期的同時提高了濾液質(zhì)量。本發(fā)明采用大孔吸附樹脂對目的產(chǎn)物進行富集和純化，去除了發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物的干擾，提高了目的產(chǎn)物的質(zhì)量。本發(fā)明采用新型層析介質(zhì)一聚合物納米微球，穩(wěn)定提高了層析效果，一步層析分離便可得到純度大于98. 5%的達托霉素產(chǎn)品。本發(fā)明工藝簡單易行，樣品收率穩(wěn)定，收率高，過程總收率達到50%以上。所用溶劑均為常規(guī)溶劑，毒性小，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I本發(fā)明實施例I所制備達托霉素精粉的液相色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明做進一步詳細說明 本發(fā)明所使用的達托霉素發(fā)酵液為華北制藥集團股份公司研發(fā)中心用微生物培養(yǎng)手段得到的達托霉素發(fā)酵液。大孔樹脂LX-50為西安藍曉公司的產(chǎn)品；大孔樹脂D113、D312為安徽三星樹脂科技有限公司的產(chǎn)品；聚合物納米微球UNIPS30RPC為蘇州納微科技公司生產(chǎn)；乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇等試劑均為市售。本發(fā)明進行HPLC檢測所使用的高效液相色譜儀為996型檢測器，515泵(Waters公司)。實施例I
取發(fā)酵單位為1960μ g/mL的達托霉素發(fā)酵液100L，在上述發(fā)酵液中加入3000g珍珠巖作為助濾劑，攪拌Ih后板框過濾，得到達托霉素濾液。將達托霉素濾液以40L/h的流速導(dǎo)入大孔樹脂D312柱(裝量為20L)進行吸附富集，吸附完畢先用35%的乙醇水溶液洗滌，再用72%的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10L/h，當(dāng)HPLC檢測解吸液中達托霉素濃度高于200 μ g/mL時開始收集，當(dāng)濃度低于200 μ g/mL時，停止收集。減壓濃縮收集的解吸液至達托霉素濃度為120g/L，得到達托霉素濃縮液。然后緩慢加入濃縮液體積7倍量的丙酮進行結(jié)晶，將結(jié)晶液過濾、45°C下干燥得到195g達托霉素粗品，此粗品的HPLC含量為89. 1%，粗提過程中收率為88. 6%。稱取上述所得達托霉素粗品10g(HPLC含量為89. 1%)，用20mL 70%的乙醇水溶液溶解，注入聚合物納米微球UNIPS30RPC柱(裝量為1L)進行層析分離，然后依次用濃度分別為35%、55%的甲醇水溶液作為洗脫劑對UNIPS30RPC柱進行梯度洗脫，并分析洗脫液的HPLC含量。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，收集HPLC純度大于等于98. 5%的洗脫液，減壓濃縮收集到的洗脫液至達托霉素濃度為120g/L，再緩慢加入濃縮液體積8倍量的丙醇進行結(jié)晶，將結(jié)晶液過濾，在真空度大于O. 08Mpa、40°C下干燥，得到HPLC純度為98. 6%的達托霉素精粉6. Og,UNIPS30RPC柱層析收率為66. 4%。實施例2
用發(fā)酵單位為2060 μ g/mL的達托霉素發(fā)酵液10L，在發(fā)酵液中加入IOOg珍珠巖作為助濾劑，攪拌30分鐘后真空抽濾，得到達托霉素濾液。將此達托霉素濾液以4L/h的流速導(dǎo)入裝量為2000mL的大孔樹脂LX-50柱進行吸附富集，吸附完畢先用體積濃度為30%的甲醇水溶液洗滌，再用體積濃度為70%的甲醇水溶液解吸，解吸流速控制在lL/h，當(dāng)HPLC檢測解吸液中達托霉素濃度高于200 μ g/mL時開始收集解吸液，當(dāng)濃度低于200 μ g/mL時，停止收集。將上述解吸液在50°C下減壓濃縮至達托霉素濃度為100g/L，然后緩慢加入濃縮液體積CN 102924572 A書明說4/5頁8倍量的丙酮進行結(jié)晶，得到結(jié)晶液，將結(jié)晶液過濾、干燥得到20. Ig達托霉素粗品，此粗品的HPLC含量為89. 6%，粗提過程中收率為87. 4%。
稱取上述所得達托霉素粗品I. Og (HPLC含量為89. 6%)，用2mL70%的甲醇水溶液溶解，注入聚合物納米微球UNIPS30RPC柱(裝量為IOOmL)進行層析分離，然后依次用40%、 60%的甲醇水溶液梯度洗脫。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，收集HPLC含量大于等于98. 5%的洗脫液，減壓濃縮收集到的洗脫液至達托霉素濃度為100g/L，再緩慢加入濃縮液體積6倍量的異丙醇進行結(jié)晶，結(jié)晶液過濾、干燥(溫度45°C，真空度大于O. OSMpa)，得到達托霉素精粉O.6g, HPLC含量為98. 6%，層析收率為66. 0%。
實施例3取發(fā)酵單位為2300 μ g/mL的達托霉素發(fā)酵液10L，在發(fā)酵液中加入200g硅藻土作為助濾劑，攪拌30分鐘后真空抽濾，得到達托霉素濾液。將濾液以4L/h的流速導(dǎo)入裝量為2000mL的大孔樹脂D113柱進行吸附富集，吸附完畢先用40%的乙醇水溶液洗滌，再用 75%的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在lL/h，當(dāng)HPLC檢測解吸液中達托霉素濃度高于 200 μ g/mL時開始收集，當(dāng)濃度低于200 μ g/mL時，停止收集。解吸完畢，將收集的解吸液減壓濃縮至達托霉素濃度為110g/L，然后緩慢加入濃縮液體積6倍量的異丙酮進行結(jié)晶，將結(jié)晶液過濾、40°C干燥得到達托霉素粗品22. 5g，達托霉 素粗品的HPLC含量為90. 2%，粗提收率為88. 2%ο
稱取上述所得達托霉素粗品10g(HPLC含量為90. 2%)，用20mL 70%的甲醇水溶液溶解，注入聚合物納米微球UNIPS30RPC柱(裝量為1L)進行層析分離，然后依次用30%、58% 的甲醇水溶液梯度洗脫。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，收集HPLC純度大于等于98. 5%的洗脫液， 50°C減壓濃縮洗脫液至達托霉素濃度為110g/L，再緩慢加入濃縮液體積7倍量的異丙醇進行結(jié)晶，將結(jié)晶液過濾，真空度大于O. 08Mpa，40°C下干燥，得到純度為98. 7%的達托霉素精粉5. 9g，層析收率為64. 5%。
實施例4本實施例與實施例I的不同之處在于粗提過程中制備達托霉素發(fā)酵液的濾液時加入的助濾劑為珍珠巖或硅藻土的混合物， 其中珍珠巖Ikg ,娃藻土 3kg。
精提過程按照以下方法進行稱取實施例I粗提所得達托霉素粗品IOg (HPLC含量為89. 1%)，用70%的甲醇水溶液溶解，注入裝量為IOOOmL的聚合物納米微球UNIPS30RPC 柱進行層析分離，然后依次用濃度分別為30%、60%的甲醇水溶液作為洗脫劑對UNIPS30RPC 柱進行梯度洗脫，并分析洗脫液的HPLC含量。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，收集HPLC純度為98. 5% 及以上的洗脫液，在50°C的溫度下減壓濃縮洗脫液至達托霉素濃度為110g/L，再緩慢加入濃縮液體積6倍量的異丙醇進行結(jié)晶，將結(jié)晶液過濾，在真空度大于0. 08Mpa、45°C下干燥， 得到HPLC純度為98. 7%的達托霉素精粉5. 9g，UNIPS30RPC柱層析收率為65. 3%。
實施例5本實施例與實施例I的不同之處在于以下精提方法稱取上述所得達托霉素粗品IOg (HPLC含量為89. 1%)，用70%的乙醇水溶液溶解，注入裝量為IOOOmL的聚合物納米微球UNIPS30RPC柱進行層析分離，然后依次用濃度分別為 30%、55%的乙醇水溶液作為洗脫劑對UNIPS30RPC柱進行梯度洗脫，并分析洗脫液的HPLC含6量。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，收集HPLC純度等于大于98. 5%的洗脫液，在50°C的溫度下減壓濃縮洗脫液至達托霉素濃度為120g/L，再緩慢加入濃縮液體積8倍量的異丙醇進行結(jié)晶，將結(jié)晶液過濾，在真空度大于O. 08Mpa、50°C下干燥，得到HPLC純度為98. 6%的達托霉素精粉 6. 0g, UNIPS30RPC 柱層析收率為 66. 4%。
權(quán)利要求
1.一種高純度達托霉素的制備方法，包括對達托霉素發(fā)酵液的濾液進行粗提的步驟、精提的過程，其特征在于所述粗提是將達托霉素發(fā)酵液的濾液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進行吸附，用解吸劑對大孔吸附樹脂進行梯度解吸，然后對解吸液進行減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得到達托霉素粗品；所述精提是將達托霉素粗品用極性溶劑溶解，然后將所得的溶解液注入聚合物納米微球柱進行層析分離，再用洗脫劑對聚合物納米微球柱進行梯度洗脫，并收集HPLC含量大于等于98. 5%的洗脫液，再將此洗脫液減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98. 5%的達托霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述達托霉素發(fā)酵液的濾液的制備是向達托霉素發(fā)酵液中加入助濾劑，經(jīng)攪拌混合后對達托霉素發(fā)酵液進行過濾，而制得達托霉素發(fā)酵液的濾液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述助濾劑的用量為每IOOL達托霉素發(fā)酵液中加入O. 5kg 5kg助濾劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3任一項所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述助濾劑為珍珠巖或硅藻土的其中一種或者其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂為LX-50、Dl 13或D312樹脂的其中一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述對大孔吸附樹脂進行梯度解吸的解吸劑的體積百分濃度分別為30% 40%和70% 75%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述聚合物納米微球為 UNIPS30RPC。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述對聚合物納米微球進行梯度洗脫的洗脫劑的體積百分濃度分別為30% 40%和55% 60% ;所述極性溶劑為70%體積百分濃度的甲醇或者乙醇水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5 8任一項所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述解吸劑或洗脫劑為乙醇水溶液或甲醇水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高純度達托霉素的制備方法，其特征在于所述粗提和精提步驟中對解吸液或者洗脫液的濃縮是將解吸液或者洗脫液中達托霉素的濃度濃縮為100 120g/L ;所述結(jié)晶是向濃縮液中加入6 8倍量的丙酮或者異丙醇進行重結(jié)晶，結(jié)晶后所得的結(jié)晶粉在40°C 50°C條件下真空干燥24h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度達托霉素的制備方法，包括對達托霉素發(fā)酵液的濾液進行粗提的步驟、精提的步驟，粗提是將達托霉素濾液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進行吸附，吸附飽和后的樹脂用解吸劑梯度解吸，然后對解吸液進行減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得到達托霉素粗品；精提是將達托霉素粗品用極性溶劑溶解，然后將所得的溶解液注入聚合物納米微球柱進行層析分離，再用洗脫劑對聚合物納米微球柱進行梯度洗脫，并收集HPLC含量大于等于98.5%的洗脫液，再將此洗脫液減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98.5%的達托霉素。本發(fā)明的優(yōu)點是可以制備純度大于98.5%的達托霉素產(chǎn)品，該方法操作簡便，收率穩(wěn)定、成本低，適宜工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)高純度的達托霉素產(chǎn)品。
文檔編號C07K1/14GK102924572SQ20121044765
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者段寶玲, 張雪霞, 任風(fēng)芝, 李曉露, 朱秀良, 李寧, 陳書紅, 成曉迅, 林毅, 王海燕, 李麗紅, 張艷立, 董愛華 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司