一種防止雜菌污染的蛹蟲草子實體培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率減少雜菌污染的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作、蛹蟲草培養(yǎng)3個步驟，其特征在于該方法中改變了培養(yǎng)容器的封口膜為封口袋，在于將目前半開放式發(fā)酵工藝徹底改變成密封式發(fā)酵，在于將培養(yǎng)室發(fā)菌改成在接種室原地發(fā)菌來實現(xiàn)的。本發(fā)明提高了蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率，減少雜菌尤其是“吃草菌”污染的方法，對大幅度提高產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義；本發(fā)明具有方便快捷的優(yōu)點，適用于蛹蟲草固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)子實體。
【專利說明】
一種防止雜菌污染的蛹蟲草子實體培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵工程，具體而言涉及蛹蟲草固體培養(yǎng)高產(chǎn)子實體落。
【背景技術(shù)】
[0002]蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Link)，又稱北冬蟲夏草，是一種能寄生于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹及幼蟲上的蟲生真菌，菌性屬中溫型，生長在低海拔的平原地域，主要分布在東北、華北、西北等省區(qū)，但據(jù)報道，云南、貴州、四川、重慶等南方省區(qū)也有分布O
[0003]據(jù)估算我國每年僅蛹蟲草干子實體產(chǎn)量就達(dá)3000噸以上(Wen et al.，2014)，冬蟲夏草產(chǎn)量在100噸左右，產(chǎn)值上百億;另外以蟲草及相關(guān)無性型發(fā)酵產(chǎn)品為原料生產(chǎn)的國藥準(zhǔn)字的藥品有45種，其中金水寶和白令膠囊年銷售總和超過20億元；以蟲草為原料生產(chǎn)的國食健字或衛(wèi)食健字保健品有99種，有33家企業(yè)獲得蟲草類食品生產(chǎn)許可(www.sfda.gov.cn, 2014)，國內(nèi)外以蟲草為原料生產(chǎn)的化妝品有好幾種(Hydeet al.,2010);從蟲草及其相關(guān)真菌中發(fā)現(xiàn)了上百種新活性化合物(胡豐林和李增智，2007);
蛹蟲草子實體及其菌粉在我國作為一類新藥(中藥國藥準(zhǔn)字Z20030034/35)已獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，產(chǎn)品標(biāo)識其具有補肺益腎、止咳化痰之功效，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，提高機(jī)體綜合抗病能力，主要用于慢性支氣管炎、各種腫瘤及其它免疫系統(tǒng)疾病的治療。經(jīng)大量的研究證明，蛹蟲草固體發(fā)酵生產(chǎn)的子實體(衛(wèi)生部2009年批準(zhǔn)的新資源食品)與天然冬蟲夏草的成份極相似，并證明了它與天然冬蟲夏草有相似的藥理作用與臨床效果，甚至在某些方面優(yōu)于天然的冬蟲夏草(如毒性比天然的小)，可以代替冬蟲夏草在臨床廣泛應(yīng)用。
[0004]蟲草多糖由于其顯著的免疫活性和抗腫瘤作用，已被國家食品藥品監(jiān)督局受理進(jìn)入臨床審評階段(CXZL0700014/15)。蟲草菌素的抗菌、降血脂、減肥、抗腫瘤和抗癌作用愈來愈受到人們的重視。降血脂方面的效果尤為明顯，與法國力博福尼制藥公司生產(chǎn)的非諾貝特效果相當(dāng)或優(yōu)于非諾貝特；它還可作為核酸和染色體復(fù)制的終止劑，在生理生化研究方面有重要用途。在治療白血病方面蟲草菌素也由FDA批準(zhǔn)進(jìn)入了臨床研究(1997年11月美國癌癥研究所和OXiGENE (嫩50厶0:0父6幻-叱1'00003005，2008年7月011(30￥18七&(嫩50八0:0￥11')-從:1'00709215)。據(jù)美國011(30￥丨8丨&公司報道，蟲草菌素的市場價值已達(dá)到3.5億美圓。
[0005]蟲草素來源主要是蛹蟲草子實體，目前蛹蟲草已實現(xiàn)了大規(guī)模固體培養(yǎng)，但子實體生產(chǎn)技術(shù)還不完善，發(fā)酵過程雜菌污染環(huán)節(jié)較難控制，尤其是“吃草菌”是一大天敵，處理不好不但嚴(yán)重污染當(dāng)季生產(chǎn)，而且還污染整個廠房的空氣和設(shè)備，導(dǎo)致后續(xù)生產(chǎn)陷入困境，技術(shù)和管控風(fēng)險相當(dāng)大。
[0006]近年來，人們關(guān)注提高蟲草菌素含量的技術(shù)，涉及蟲草菌素的專利申請有01124109.8號“發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)蟲草素的方法(液體培養(yǎng))”、200810068734.8號“紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實體和蟲草素產(chǎn)量的方法”等。然而，目前關(guān)于蛹蟲草固體發(fā)酵的專利主要集中在子實體生產(chǎn)工藝研究方面，很少涉及大規(guī)模生產(chǎn)過程中污染的防控和“吃草菌”的預(yù)防。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率，減少雜菌污染的方法，從而大幅度提高產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率減少雜菌污染的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作和蛹蟲草培養(yǎng)三個步驟，其中
1.菌種活化
(1)配PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，水煮30min，用4層紗布過濾，取濾液，葡萄糖20g，瓊脂15?20g,加水至100mL;
(2)將配好的PDA培養(yǎng)基分裝到試管，包扎，121°C滅菌30mim;
(3)滅好菌的試管培養(yǎng)基凝固前擺斜面，冷卻；
(4)將原始菌種從4°C冰箱中取出，室溫下在超凈操作臺上無菌接種；
(5)接種蛹蟲草的斜面置26°C下黑暗恒溫培養(yǎng)；
(6)4?6天后，等菌種長滿斜面，用無菌水洗斜面制成孢子懸液(在超凈操作臺上無菌操作)。
[0009]2.液體菌種制作
將蛹蟲草孢子懸液稀釋到合適濃度，然后將孢子懸液接入液體母種培養(yǎng)基中，于18°C?25°C下?lián)u床以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4d。
[0010]上述液體母種培養(yǎng)基的配方為蛋白胨2%，蔗糖2% ,MgSO4.7H20 0.05%, KH2PO4
0.1%,水100mL，pH自然；裝液量為200mL/500mL三角瓶。
[0011]蛹蟲草培養(yǎng)
是用無色玻璃瓶中裝入20份大米、小麥或大米和小麥的混合物，按I: 1.6-1.8的料水比加入營養(yǎng)液;用耐高溫塑料袋封口后在118-121°C，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫塑料袋進(jìn)行接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續(xù)用耐高溫塑料袋封口密封，在接種區(qū)原地置18-20°C下黑暗恒溫培養(yǎng)5天;第6天將長滿菌絲的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至78-82%左右；蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持20-25°C，空氣濕度83-87% ;待蛹蟲草培養(yǎng)50天后，蛹蟲草培養(yǎng)50天后收獲橙黃色的子實體。
[0012]所述的耐高溫塑料袋為耐高溫透明聚丙烯塑料袋。
[0013]所述的耐高溫透明聚丙烯塑料袋的深度為40-45cm。
[0014]4耐高溫透明聚丙烯塑料袋通過皮筋密封連接在無色玻璃瓶瓶口。
[0015]所使用的菌株為:蛹蟲草菌株(Cordycepsmilitaris)的無性型蛹草擬青霉(paeci lomycesmi Ii tar is)菌株。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明將目前培養(yǎng)容器的封口膜戳孔接種的半開放式發(fā)酵工藝徹底改變成不破壞封口袋的基礎(chǔ)上打開封口皮筋接種后的密封式發(fā)酵，這樣徹底杜絕發(fā)菌和生長過程中任何雜菌的污染。改變發(fā)菌地點，將目前接種后在培養(yǎng)室發(fā)菌改成在接種室原地發(fā)菌，這樣減少了從接種室到培養(yǎng)室的運輸過程，待3-5天后蟲草菌完全覆蓋配以后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室，這樣進(jìn)一步防止了污染。耐高溫透明聚丙烯塑料袋的深度為40-45cm，這樣可以確保子實體的伸展長度，不至于受壓彎曲；不采用玻璃罐頭瓶而采用直口瓶，這樣方便將子實體取出。
[0017]同時本發(fā)明的能提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率，減少雜菌污染，經(jīng)大量實驗，采用本方法雜菌污染率為3%，相對現(xiàn)有的培養(yǎng)方法(雜菌污染了達(dá)10%)具有大幅度提高，其對提高整個蛹蟲草子實體的產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]實施例1:在10個容積為350ml、內(nèi)徑為6.2cm、高度為15cm的圓柱形無色玻璃瓶中分別裝入20g大米，按1: 1.6的料水比加入32mL營養(yǎng)液(采用葡萄糖I %，蛋白胨1.5%，K2HPO4 0.05%, MgSO4.7H20 0.05%, VBi (2mg/L)，水 1000mL，pH 自然的配方配制而成的營養(yǎng)液)，用耐高溫透明聚丙烯塑料袋(長40cm)封口后118°C，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫透明聚丙烯塑料袋袋口接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續(xù)用皮筋扎帶封口，在接種區(qū)原地置18_20°C下黑暗恒溫培養(yǎng)5天。第6天將長滿菌絲的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至78% ;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持20°C左右，空氣濕度83%;待蛹蟲草培養(yǎng)50天后，每瓶收獲橙黃色的新鮮子實體30g。
[0020]實施例2:在10個容積為350ml、內(nèi)徑為6.2cm、高度為15cm的圓柱形無色玻璃瓶中分別裝入20g小麥，按1: 1.7的料水比加入34mL營養(yǎng)液(采用葡萄糖I %，蛋白胨1.5%，K2HPO4 0.05%, MgSO4.7H20 0.05%, VBi (2mg/L)，水 1000mL，pH 自然的配方配制而成的營養(yǎng)液)，用耐高溫透明聚丙烯塑料袋(長43cm)封口后120°C，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫透明聚丙烯塑料袋袋口接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續(xù)用皮筋扎帶封口，在接種區(qū)原地置18_20°C下黑暗恒溫培養(yǎng)5天。第6天將長滿菌絲的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至80% ;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持22°C左右，空氣濕度85%;待蛹蟲草培養(yǎng)50天后，每瓶收獲橙黃色的新鮮子實體31g。
[0021]
實施例2:在10個長20cm、寬12cm、高為15cm的白色透明聚丙烯培養(yǎng)盆中分別裝入225g大米和225g小麥組合，按1:1.8的料水比加入810mL營養(yǎng)液(采用葡萄糖1%，蛋白胨1.5%，K2HPO4 0.05%, MgSO4.7H20 0.05%, VBi (2mg/L)，水 1000mL，pH 自然的配方配制而成的營養(yǎng)液)，用耐高溫透明聚丙烯塑料袋(長45cm)封口后12rC，30min高壓滅菌，冷卻后立即接種蛹蟲草液體母種，在接種區(qū)原地置18-20°C下黑暗恒溫培養(yǎng)5天。第6天將長滿菌絲的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至82%;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持25°C左右，空氣濕度87%;待蛹蟲草培養(yǎng)50天后，每盆收獲橙黃色的新鮮子實體450g。
【主權(quán)項】
1.一種提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率減少雜菌污染的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作和蛹蟲草培養(yǎng)三個步驟，其特征在于:蛹蟲草培養(yǎng)是用無色玻璃瓶中裝入20份大米、小麥或兩者的混合物，按1:1.6-1.8的料水比加入營養(yǎng)液；用耐高溫塑料袋封口后在118-12rC，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫塑料袋進(jìn)行接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續(xù)用耐高溫塑料袋封口密封，在接種區(qū)原地置18-20°C下黑暗恒溫培養(yǎng)5天;第6天將長滿菌絲的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至78-82%左右;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持20-25°C，空氣濕度83-87 待蛹蟲草培養(yǎng)50天后，蛹蟲草培養(yǎng)50天后收獲橙黃色的子實體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率減少雜菌污染的方法，其特征在于:所述的耐高溫塑料袋為耐高溫透明聚丙烯塑料袋。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率減少雜菌污染的方法，其特征在于:所述的耐高溫透明聚丙烯塑料袋的深度為40-45cm。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高蛹蟲草子實體生產(chǎn)效率減少雜菌污染的方法，其特征在于:耐高溫透明聚丙烯塑料袋通過皮筋密封連接在無色玻璃瓶瓶口。
【文檔編號】A01G1/04GK105838624SQ201610262936
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】刁朝強, 文庭池, 廖勇, 康冀川, 周建云
【申請人】貴州省煙草公司貴陽市公司, 貴州大學(xué)