一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法，該方法是：在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的第10～25天期間，引入熱脅迫，其熱脅迫的條件為：蛹蟲草培養(yǎng)溫度為28～35℃；然后將培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度18～25℃，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。本發(fā)明在蛹蟲草特定生長(zhǎng)時(shí)期引入熱脅迫，使蛹蟲草子實(shí)體中的蟲草菌素含量成倍增加；該方法可以在蛹蟲草人工培養(yǎng)中大規(guī)模應(yīng)用，提高蛹蟲草子實(shí)體的藥效成分，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛹蟲草人工栽培【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是ー種人工調(diào)控培養(yǎng)條件以提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]蛹蟲草(Cbroycep1S又名北冬蟲夏草,在真菌分類學(xué)上屬子囊菌亞門，核菌綱，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬，與冬蟲夏草(Cbrみceps sinensis )同為蟲草屬真菌的ー種。蟲草屬真菌是寄生于昆蟲、蜘蛛或大團(tuán)囊屬植物的地下子實(shí)體上形成的ー類蟲菌復(fù)合物的統(tǒng)稱。蛹蟲草是蟲草屬真菌的模式種，在野外主要寄主于鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的ー些昆蟲的幼蟲和蛹上，中醫(yī)典籍記載它的功效為“味甘、性平，有益肺腎，補(bǔ)精髄，止血化痰”，與冬蟲夏草的功能基本一致。過去，由于蛹蟲草在野外產(chǎn)量稀少，其開發(fā)利用并沒有被人們所重視。但自上世紀(jì)九十年代末，其大規(guī)模人工培養(yǎng)獲得成功以來，其開發(fā)利用價(jià)值便越來越被人們認(rèn)識(shí)，所開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，市場(chǎng)需求也越來越大，蛹蟲草子實(shí)體的人エ栽培正成為ー個(gè)具有極大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新興產(chǎn)業(yè)。
[0003]蟲草菌素(cordycepin)又稱蟲草素、3 ' _脫氧腺苷(3' -deoxyadenosine),是第一個(gè)從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，是蛹蟲草中最主要的活性成分之一。早在1950年，Cunningham等觀察到被蛹蟲草Cordyceps militaris寄生的昆蟲組織不易腐爛,進(jìn)而從中分離出ー種抗菌性物質(zhì)，定名為蟲草菌素，并在Nature上發(fā)表，之后許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證研究。蟲草菌素分子式為CltlH13N5O3，其結(jié)構(gòu)式如圖1，分子量為251D，堿性，針狀或片狀結(jié)晶。蟲草菌素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用【王成明等2009 王成明，李磊，楊親正，2009.蟲草活性成分蟲草素臨床應(yīng)用研究進(jìn)展.廣州化工，37 (5): 42-43】，以蟲草素為主要成分的新藥已在臨床上試用于白血病的治療【Kodama et al.2000 Kodama EN, McCaffrey RP, Yusa K，Mitsuya H，2000.Antileukemic activity ana mechanism of action of cordycepm against terminaldeoxynucleotidyl transferasepositive (TdT+) leukemic cells.BiochemicalPharmacology, 59(3): 273-281 ;蔡友華和劉學(xué)銘2007 蔡友華，劉學(xué)銘，2007.蟲草素的研究與開發(fā)進(jìn)展.中草藥，38⑶:1269-1272】，有著良好的臨床應(yīng)用前景，蟲草菌素的研究正成為藥物化學(xué)中ー個(gè)極其活躍的領(lǐng)域【楊濤，董彩虹，蟲草素的研究開發(fā)現(xiàn)狀與思考。菌物學(xué)報(bào) 15 March 2011, 30(2): 180-190】。
[0004]人工培養(yǎng)中提高蟲草菌素含量的生產(chǎn)應(yīng)用主要分為提高液體發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草菌素含量、提高固體發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草菌素含量和提高子實(shí)體中蟲草菌素含量三種途徑。其中液體發(fā)酵培養(yǎng)和固體發(fā)酵培養(yǎng)主要以獲取蟲草菌素純品為目標(biāo)。而提高子實(shí)體中蟲草菌素含量則是以提高蛹蟲草子實(shí)體的商品質(zhì)量為目標(biāo)。在提高蟲草菌素含量的方法上，目前已有的技術(shù)主要可概括為以下幾個(gè)方面:
第一，通過菌種誘變和選育提高蟲草菌素含量。
[0005]就菌株而言，自然界原始菌株的蟲草素產(chǎn)量往往不高。Das et al.(2008)用質(zhì)子束誘變(proton beam irradiation)的方法篩選出了蟲草素的高產(chǎn)菌株，比出發(fā)菌株的蟲草素含量高出72% ;李文等(2009)選擇合適劑量的低能離子束注入蛹蟲草，獲得菌株的蟲草素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高30% ;周禮紅等(2009)通過對(duì)蛹蟲草原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變處理，篩選出優(yōu)良菌株，經(jīng)固體發(fā)酵后，蟲草素含量為出發(fā)菌株的2倍，連續(xù)15代傳代培養(yǎng)，蟲草素的含量依然保持穩(wěn)定。航天誘變技術(shù)也用在了蛹蟲草的育種研究之中。2005年8月29日中國(guó)發(fā)射的第22顆返回式科學(xué)與技術(shù)試驗(yàn)衛(wèi)星中有3支蛹蟲草試管菌種，研究表明航天搭載蛹蟲草的蟲草素含量較原始菌株提高2.5倍(溫魯?shù)?008)。[0006]第二，通過對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化提高蟲草菌素含量。
[0007]關(guān)于蟲草菌素培養(yǎng)基的優(yōu)化研究較多，基本上所有的實(shí)驗(yàn)均考慮到了碳源、氮源以及碳氮比的影響，但是不同的實(shí)驗(yàn)可能因?yàn)榫旰推渌麑?shí)驗(yàn)條件的不同，優(yōu)化的碳源、氮源不盡相同，但是碳源米用葡萄糖的較多(Mao et al.2005 ；Masuda et al.2006)。氮源以酵母提取物(Shih et al.2007)者酵母提取物與蛋白胨混合物(Masuda et al.2006 ；Gu et al.2007)為主，較低的碳氮比有利于提高蛹蟲草的蟲草素產(chǎn)量(Mao et al.2005 ；Shih et al.2007)。Xie et al.(2009)以農(nóng)副產(chǎn)品糖米糊(brownrice paste)、麥芽汁和大豆汁作為培養(yǎng)基也得到了較高產(chǎn)量的蟲草素。無機(jī)鹽離子影響蟲草素的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基中加入適量的硒可促進(jìn)蛹蟲草蟲草素的合成(王志高等2007 ;賁松彬等2009);硫酸亞鐵和氯化鈣是影響蟲草素產(chǎn)量的關(guān)鍵因子(毛先兵和馬開森2004)，這些離子可能作為酶的輔因子發(fā)揮作用。此外，NH4+有類似的作用，它對(duì)蟲草素產(chǎn)量的提高可能不僅在于提供了氮源，而且與能量代謝有關(guān)，因?yàn)镹H4+能激活H+-ATPase (Mao & Zhong 2006)。無機(jī)鹽離子的添加雖然能增加蟲草素的產(chǎn)量，但會(huì)給后續(xù)的分離純化鑒定等過程帶來不利影響。
[0008]第三，通過在培養(yǎng)基中添加前體物提高蟲草菌素含量。
[0009]前體物質(zhì)及激活子對(duì)蟲草菌素合成有促進(jìn)作用，貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所在此方面開展了大量的工作并顯著提高了蟲草菌素的產(chǎn)量。腺嘌呤核苷和腺嘌呤是蟲草菌素合成的前體物質(zhì)，培養(yǎng)基中添加適量的腺苷和腺嘌呤，蟲草菌素的產(chǎn)量顯著提高，其中添加腺嘌呤的效果好于腺嘌呤核苷(李祝等2008;文庭池等2010)。甘氨酸、L-谷氨酰胺也能刺激蛹蟲草液體發(fā)酵胞外蟲草菌素產(chǎn)量的提高，而且和前體物質(zhì)腺苷、腺嘌呤有協(xié)同作用(文庭池等2010)。
[0010]第四，通過真菌激發(fā)子提高蟲草菌素含量。步M等(2002)將曲霉Aspergillumsp.、青霉Penicillium sp.、根霉 Rhizopus sp.、疫霉Phytophthora sp.、灰霉 Cinereasp.等配制的真菌激發(fā)子培養(yǎng)液加入到蛹擬青霉的培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)疫霉、灰霉做激發(fā)子菌株可提高蟲草菌素的含量，但是發(fā)揮作用的成分不明；分別提取真菌多糖作為激發(fā)子，發(fā)現(xiàn)不同來源的多糖激發(fā)作用并不完全相同，疫霉YL和曲霉P6-1兩株真菌的菌絲體多糖可以提高蟲草菌素的產(chǎn)量和生物量。在發(fā)酵起始階段加入疫霉多糖，72h后再加入曲霉多糖，蟲草菌素的含量可達(dá)到對(duì)照的5.7倍(李祝等2006)。有意思的是，蛹蟲草與紅曲霉菌株Monascus rubber MT305共培養(yǎng)也能提高蟲草菌素含量(周禮紅和蔣春玲2008)。炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌Xylaria sp.YX-28菌株提取液制備的激發(fā)子和非生物型誘導(dǎo)子乙酸鈉、硫酸銨也能促進(jìn)蟲草菌素的產(chǎn)生(劉小莉等2009 )。
[0011]第五，通過改變培養(yǎng)條件提高蟲草菌素含量。
[0012]Shih et al.2007對(duì)蛹蟲草蟲草菌素培養(yǎng)條件的研究認(rèn)為其最適pH為6左右；溫魯?shù)?005研究認(rèn)為，最適溫度為20 — 25°C，采用遮光培養(yǎng)能促進(jìn)蟲草菌素的合成。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是提供一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法，它主要是通過人工調(diào)控，在蛹蟲草人工培養(yǎng)的特定時(shí)期改變培養(yǎng)溫度以提高蟲草菌素含量。該方法與目前已使用的提高蟲草菌素含量的方法可疊加使用，可以大幅提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量，是ー種極具創(chuàng)新性和應(yīng)用價(jià)值的方法。
[0014]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法，該方法是:在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的第10~25天期間，引入熱脅迫，其熱脅迫的條件為:蛹蟲草培養(yǎng)溫度為28~35°C;然后將培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度18~25°C，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲；具體包括以下步驟:
i蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
將用常規(guī)方法制備好蛹蟲草菌種接種于蛹蟲草大米等糧食培養(yǎng)基中，分別經(jīng)過避光培養(yǎng)、見光培養(yǎng)等常規(guī)培養(yǎng)過程(培養(yǎng)溫度18~25攝氏度)，培養(yǎng)至第10天或以后。
[0015]ii蛹蟲草子實(shí)體熱脅迫培養(yǎng)
將步驟i中培養(yǎng)至第10~15天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)高到28~35攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行熱脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)至第20~25天。
[0016]iii蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
將步驟ii中培養(yǎng)至第20~25天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度18~25攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。
[0017]本發(fā)明在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的第10~25天期間，引入熱脅迫，可以使蛹蟲草子實(shí)體中的蟲草菌素含量比對(duì)照培養(yǎng)的蟲草菌素含量顯著增加，是ー種未見報(bào)道但簡(jiǎn)単、高效提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法；在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的第15天到第20天期間，引入熱脅迫，能夠使子實(shí)體中蟲草菌素含量提高達(dá)到最佳效果，子實(shí)體中蟲草菌素含量可以成倍增長(zhǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為蟲草素的結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
1.1蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
用常規(guī)方法制備好蛹蟲草液體菌種，接種于蛹蟲草大米培養(yǎng)基中，分別經(jīng)過避光培養(yǎng)、見光培養(yǎng)等常規(guī)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)至第10天。常規(guī)培養(yǎng)方法在該領(lǐng)域已相當(dāng)成熟，該領(lǐng)域的技術(shù)人員均能實(shí)行。具體方法也可參考文獻(xiàn)【高新華2008,蛹蟲草(Cordyceps militaris)的交配型研究，食用菌學(xué)報(bào)15 (1):1~5.】所述相關(guān)內(nèi)容。
[0020]1.2蛹蟲草子實(shí)體熱脅迫培養(yǎng)
將步驟1.1中培養(yǎng)至第10天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)高到28攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行熱脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)至第20天。
[0021]1.3蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
將步驟1.2中培養(yǎng)至第20天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度22攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。
[0022]2012年8月至10月期間培養(yǎng)結(jié)果表明，相比于未經(jīng)熱脅迫處理的常規(guī)培養(yǎng)的對(duì)照組子實(shí)體中蟲草菌素含量為1.8%。而言，按以上方法培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量4.1%。，是對(duì)照組的2.3倍左右。
[0023]實(shí)施例2
2.1蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
用常規(guī)方法制備好蛹蟲草菌種，接種于蛹蟲草大米培養(yǎng)基中，分別經(jīng)過避光培養(yǎng)、見光培養(yǎng)等常規(guī)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)至第15天。
[0024]2.2蛹蟲草子實(shí)體熱脅迫培養(yǎng)
將步驟2.1中培養(yǎng)至第15天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)高到32攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行熱脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)至第20天。
[0025]2.3蛹蟲草子 實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
將步驟2.2中培養(yǎng)至第20天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度22攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。
[0026]2012年8月至10月期間培養(yǎng)結(jié)果表明，相比于未經(jīng)熱脅迫處理的常規(guī)培養(yǎng)的對(duì)照組子實(shí)體中蟲草菌素含量為1.8%。而言，按以上方法培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量
7.5%。，是對(duì)照組的約4.1倍。
[0027]實(shí)施例3
3.1蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
用常規(guī)方法制備好蛹蟲草菌種，接種于蛹蟲草大米培養(yǎng)基中，分別經(jīng)過避光培養(yǎng)、見光培養(yǎng)等常規(guī)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)至第15天。
[0028]3.2蛹蟲草子實(shí)體熱脅迫培養(yǎng)
將步驟3.1中培養(yǎng)至第15天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)高到35攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行熱脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)至第25天。
[0029]3.3蛹蟲草子實(shí)體常規(guī)培養(yǎng)
將步驟3.2中培養(yǎng)至第25天的培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)高到常規(guī)培養(yǎng)溫度22攝氏度，其它條件不變，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。
[0030]2012年8月至10月期間培養(yǎng)結(jié)果表明，相比于未經(jīng)熱脅迫處理的常規(guī)培養(yǎng)的對(duì)照組子實(shí)體中蟲草菌素含量為1.8%。而言，按以上方法培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量
4.7%。，是對(duì)照組的約2.6倍左右。
[0031]本發(fā)明所述方法并非簡(jiǎn)單地引入熱脅迫就能實(shí)現(xiàn)，而是在大量試驗(yàn)探索的基礎(chǔ)上，找到了在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的特定時(shí)間階段引入熱脅迫提高子實(shí)體蟲草菌素含量的方法。為了更好地說明此點(diǎn)，以下附上部分試驗(yàn)結(jié)果，以說明不同熱脅迫時(shí)機(jī)和時(shí)間長(zhǎng)度對(duì)子實(shí)體中蟲草菌素和腺苷含量的影響。見表1。
[0032]表1.不同熱脅迫時(shí)機(jī)和時(shí)間長(zhǎng)度對(duì)子實(shí)體中蟲草菌素和腺苷含量的影響
【權(quán)利要求】
1.一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法，其特征在于，在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的第10~25天期間，引入熱脅迫，其熱脅迫的條件為:蛹蟲草培養(yǎng)溫度為28~35°C ；然后將培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度18~25°C，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。
2.一種提高蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量的方法，其特征在于，在蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的第15~20天期間，引入熱脅迫，其熱脅迫的條件為:蛹蟲草培養(yǎng)溫度為28~35°C ；然后將培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度調(diào)至常規(guī)培養(yǎng)溫度18~25°C，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到收獲。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK103598006SQ201310503872
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】高新華, 張紅霞, 黃開華, 陳偉, 楊建軍 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院