蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法。
【背景技術】
[0002]納米銀(Silver nanoparticles , AgNPs)是研究和應用最為廣泛的納米抗菌材料O納米銀是一種粒徑在I?100 nm之間的金屬銀微粒。近年來研究發(fā)現(xiàn)納米銀以其大的比表面積和小尺寸效應，極大提高了對細菌表面的吸附性和滲透性，具有抑菌性強、抗菌譜廣、不易產生耐藥性等優(yōu)點，為新型抗菌材料的研發(fā)開辟了新的方向。
[0003]納米銀的制備技術種類繁多，采用較多的是化學法還原法，但化學方法采用的化學試劑常對環(huán)境和人體健康造成危害。另外，銀納米粒子極易團聚和被氧化，導致在應用時失去其應有的功能，不利于長期穩(wěn)定使用。近年來納米生物合成法利用植物、微生物等生物中的活性物質作為還原劑和穩(wěn)定劑制備納米銀，具有價格低廉、合成效率高、反應條件溫和、產物穩(wěn)定、綠色環(huán)保等優(yōu)點。
[0004]蛹蟲草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草、北蟲草等。為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬。蛹蟲草是現(xiàn)代珍稀中草藥，在藥效成分種類上與傳統(tǒng)冬蟲夏草相近，蛹蟲草中富含蟲草多糖、蟲草素(37 -脫氧腺苷)、蟲草酸(D-甘露醇)、麥角留醇、腺苷、超氧化物歧化酶(SOD)等多種有效成分。其中豐富的還原性物質為納米銀的生物合成提供了保障，并且由于其菌絲體提取物中富含糖類、脂類、蛋白質等生物大分子，能夠與納米材料結合而賦予其優(yōu)異的理化性狀和獨特的生物學特性，為新型納米抑菌材料的制備打下了基礎。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種生產成本低，得到的銀納米粒子抗菌譜廣，能夠避免傳統(tǒng)化學方法合成納米銀危害環(huán)境弊端的蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法。
[0006]本發(fā)明的技術解決方案是:
一種蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法，其特征是:包括下列步驟:
(1)蛹蟲草菌絲體的制備:
取保藏于試管斜面上的蛹蟲草菌苔2-3 Cm2，置于100 ml PDA液體培養(yǎng)基中，23°C、130rpm空氣浴震蕩器中培養(yǎng)4-5 d，獲得蛹蟲草菌絲體；
(2)蛹蟲草菌絲體浸提液制備:
將步驟(I)中含有蛹蟲草菌絲體的液體培養(yǎng)基用雙層紗布過濾收集蛹蟲草菌絲體，再用超純水對收集到的蛹蟲草菌絲體沖洗3次，按照質量比:蛹蟲草菌絲體:水=1:10的比例加入滅菌超純水，懸浮菌絲體，置于23°C恒溫搖床150 rpm震蕩培養(yǎng)24 h，用雙層紗布過濾收集濾液，得到蛹蟲草菌絲體浸提液；
(3)納米銀的生物合成
取2mL 0.0lM AgNO3溶液加入到18mL蛹蟲草菌絲體浸提液中，將溶液攪拌，120°C油浴加熱回流2 h，即得到生物合成的納米銀材料，4 °C避光保存。
[0007]PDA液體培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L。
[0008]得到的納米銀材料還進行抑菌圈實驗進行驗證抑菌效果:
分別選用4種臨床病原菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和4種水產病原菌:鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、點狀氣單胞作為指示菌，采用瓊脂擴散法檢測合成納米銀的抑菌活性；臨床病原菌采用LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng);供試水產病原菌采用2216E培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng);將指示菌培養(yǎng)液50 yL加到5 mL液體培養(yǎng)基中，200 rpm震蕩8?10h，培養(yǎng)至對數(shù)增長期，菌液用生理鹽水稀釋至16 CFU/mL，分別取10yL均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，然后在培養(yǎng)基上放置杯外徑為8mm的牛津杯，杯中加入得到的納米銀材料20 yL，用蛹蟲草菌絲體浸提液和生理鹽水做陰性對照，做三次重復;將培養(yǎng)平皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察。
[0009]本發(fā)明生產成本低，得到的銀納米粒子抗菌譜廣，能夠避免傳統(tǒng)化學方法合成納米銀危害環(huán)境的弊端。
[0010]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
【具體實施方式】
[0011]—種蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法，包括下列步驟:
(1)蛹蟲草菌絲體的制備:
取保藏于試管斜面上的蛹蟲草菌苔2-3 Cm2，置于100 ml PDA液體培養(yǎng)基中，23°C、130rpm空氣浴震蕩器中培養(yǎng)4-5 d，獲得蛹蟲草菌絲體；
(2)蛹蟲草菌絲體浸提液制備:
將步驟(I)中含有蛹蟲草菌絲體的液體培養(yǎng)基用雙層紗布過濾收集蛹蟲草菌絲體，再用超純水對收集到的蛹蟲草菌絲體沖洗3次，按照質量比:蛹蟲草菌絲體:水=1:10的比例加入滅菌超純水，懸浮菌絲體，置于23°C恒溫搖床150 rpm震蕩培養(yǎng)24 h，用雙層紗布過濾收集濾液，得到蛹蟲草菌絲體浸提液；
(3)納米銀的生物合成
取2mL 0.0lM AgNO3溶液加入到18mL蛹蟲草菌絲體浸提液中，將溶液攪拌，120°C油浴加熱回流2 h，即得到生物合成的納米銀材料，4 °C避光保存。
[0012]PDA液體培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L。
[0013]得到的納米銀材料還進行抑菌圈實驗進行驗證抑菌效果:
分別選用4種臨床病原菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和4種水產病原菌:鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、點狀氣單胞作為指示菌，采用瓊脂擴散法檢測合成納米銀的抑菌活性;臨床病原菌采用LB培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L)，37°C培養(yǎng);供試水產病原菌采用2216E培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，酵母膏I g，磷酸高鐵0.01 g，陳海水定容至1000 mL)，28°C培養(yǎng);將指示菌培養(yǎng)液50 yL加到5 mL液體培養(yǎng)基中，200 rpm震蕩8?10 h，培養(yǎng)至對數(shù)增長期，菌液用生理鹽水稀釋至16 CFU/mL，分別取10yL均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，然后在培養(yǎng)基上放置杯外徑為8mm的牛津杯，杯中加入得到的納米銀材料20 yL，用蛹蟲草菌絲體浸提液和生理鹽水做陰性對照，做三次重復;將培養(yǎng)平皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察。抑菌圈實驗表明生物合成的納米銀對供試的臨床病原菌和水產病原菌均產生顯著的抑菌圈，說明合成的納米銀抑菌劑能有效抑制供試病原菌的生長;而作為對照的蛹蟲草浸提液和生理鹽水則對病原菌完全沒有抑制作用。
【主權項】
1.一種蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法，其特征是:包括下列步驟: (1)蛹蟲草菌絲體的制備: 取保藏于試管斜面上的蛹蟲草菌苔2-3 Cm2，置于100 ml PDA液體培養(yǎng)基中，23°C、130rpm空氣浴震蕩器中培養(yǎng)4-5 d，獲得蛹蟲草菌絲體； (2)蛹蟲草菌絲體浸提液制備: 將步驟(I)中含有蛹蟲草菌絲體的液體培養(yǎng)基用雙層紗布過濾收集蛹蟲草菌絲體，再用超純水對收集到的蛹蟲草菌絲體沖洗3次，按照質量比:蛹蟲草菌絲體:水=1:10的比例加入滅菌超純水，懸浮菌絲體，置于23°C恒溫搖床150 rpm震蕩培養(yǎng)24 h，用雙層紗布過濾收集濾液，得到蛹蟲草菌絲體浸提液； (3)納米銀的生物合成 取2mL 0.0lM AgNO3溶液加入到18mL蛹蟲草菌絲體浸提液中，將溶液攪拌，120°C油浴加熱回流2 h，即得到生物合成的納米銀材料，4 °C避光保存。2.根據(jù)權利要求1所述的蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法，其特征是:PDA液體培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/Lo3.根據(jù)權利要求1所述的蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法，其特征是:得到的納米銀材料還進行抑菌圈實驗進行驗證抑菌效果: 分別選用4種臨床病原菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和.4種水產病原菌:鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、點狀氣單胞作為指示菌，采用瓊脂擴散法檢測合成納米銀的抑菌活性；臨床病原菌采用LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng);供試水產病原菌采用.2216E培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng);將指示菌培養(yǎng)液50 yL加到5 mL液體培養(yǎng)基中，200 rpm震蕩8?.10 h，培養(yǎng)至對數(shù)增長期，菌液用生理鹽水稀釋至16 CFU/mL，分別取10yL均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，然后在培養(yǎng)基上放置杯外徑為8mm的牛津杯，杯中加入得到的納米銀材料20 μL，用蛹蟲草菌絲體浸提液和生理鹽水做陰性對照，做三次重復;將培養(yǎng)平皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛹蟲草提取液生物合成納米銀抑菌劑的方法，包括蛹蟲草菌絲體的制備、蛹蟲草菌絲體浸提液制備、納米銀的生物合成等步驟。本發(fā)明生產成本低，得到的銀納米粒子抗菌譜廣，能夠避免傳統(tǒng)化學方法合成納米銀危害環(huán)境的弊端。
【IPC分類】B82Y40/00, B22F9/24, C12R1/645, C12N1/14
【公開號】CN105499603
【申請?zhí)枴緾N201510984435
【發(fā)明人】王磊, 徐慧, 周美紅
【申請人】魯東大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月25日