葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葡萄糖?6?磷酸脫氫酶缺乏癥轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法，其建立方法包括以下步驟：1）將g6pdM118?144?egfp?PCS2+，gata?1?PBSK?Isce I質(zhì)粒酶切連接構(gòu)建了gata1?g6pdM118?144?egfp?PBSK?Isce I質(zhì)粒；2）將gata1?g6pdM118?144?egfp?PBSK?Isce I質(zhì)粒通過(guò)顯微注射的方式注入1細(xì)胞期斑馬魚胚胎動(dòng)物極胚盤內(nèi)；3）通過(guò)觀察24hpf期胚胎是否表達(dá)綠色熒光篩選出轉(zhuǎn)基因的胚胎并孵化養(yǎng)至成魚作為F0代轉(zhuǎn)基因斑馬魚；4）以F0代轉(zhuǎn)基因斑馬魚與野生型交配后產(chǎn)生的表達(dá)綠色熒光的胚胎孵化并養(yǎng)至成魚作為F1代轉(zhuǎn)基因斑馬魚；5）通過(guò)觀察胚胎EGFP熒光情況和基因組PCR 法鑒定轉(zhuǎn)入的g6pdM118?144?egfp基因的表達(dá)和插入情況。該方法為這種模型在篩選治療G6PD缺乏癥藥物中的應(yīng)用提供了可能。
【專利說(shuō)明】
葡萄糖-6-磯酸脫氨酶缺乏癥轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖-6-憐酸脫氨酶缺乏癥（gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，簡(jiǎn)稱G6PD缺乏癥)俗稱蠶豆病，是世界上最常見的遺傳性溶血性紅細(xì)胞酶缺 陷病。紅細(xì)胞在成熟的過(guò)程中喪失了細(xì)胞核和核糖體，因而不能合成蛋白質(zhì)，無(wú)法進(jìn)行=簇 酸循環(huán)。因此成熟的紅細(xì)胞主要靠憐酸戊糖途徑來(lái)提供能量。G6H)是憐酸戊糖代謝途徑的 限速酶。6-憐酸葡萄糖在G6PD的催化下產(chǎn)生煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ,NADPH)和5-憐酸核糖（ribose-5-phosphate，R5P)。 NADPH對(duì)維持谷脫甘膚(glutathione, G細(xì))的還原狀態(tài)從而保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化劑的損害 極為重要。併機(jī)/基因突變導(dǎo)致G6PD酶活性降低，會(huì)影響NADPH的產(chǎn)生。NADPH是機(jī)體多種物 質(zhì)合成代謝的供氨體，同時(shí)維持還原型谷脫甘膚(G細(xì)的還原狀態(tài)）的生成量。NADPH缺乏 會(huì)減弱機(jī)體抗氧化劑(還原型谷脫甘膚GSH、過(guò)氧化氨也化）的抗氧化效果，使紅細(xì)胞中的血 紅蛋白及紅細(xì)胞膜在接觸氧化性損傷時(shí)受到損害及發(fā)生溶血。目前全世界就G6PD缺乏癥 發(fā)病的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究探討。常見臨床表現(xiàn)包括新生兒黃痘、藥物或 感染造成的急性溶血、蠶豆病和先天性非球形細(xì)胞溶血性貧血(CNSHA)等?，F(xiàn)今，對(duì)G6PD缺 乏癥的治療措施主要為早期篩查，避免誘發(fā)因素等預(yù)防治療措施。一旦經(jīng)確診后的病例給 予服禁用藥物，避免誘發(fā)因素。高膽紅素血癥予W藍(lán)光照射、堿化血液、輸白蛋白、輸血等對(duì) 癥治療，W及相關(guān)輔助治療。國(guó)內(nèi)外仍未有特異性治療G6PD缺乏癥的治療措施。
[0003] 是原始紅系發(fā)育中的特異性的啟動(dòng)子，標(biāo)記早期紅系細(xì)胞。在24hpf，斑馬 魚的血液循環(huán)開始建立時(shí)可檢測(cè)到gata-J-雌卸標(biāo)記的紅細(xì)胞隨循環(huán)流動(dòng)。48h之后 gata-J表達(dá)逐漸減少。所W利用gata-J作為驅(qū)動(dòng)突變的g卸c/基因的啟動(dòng)子可W使突變 型g如c/基因在紅細(xì)胞中特異性表達(dá)。從而實(shí)現(xiàn)突變型g如墟因在紅細(xì)胞中表達(dá)的"可示 踩'觀察。
[0004] 目前并沒(méi)有一種十分理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂蒞很好的實(shí)現(xiàn)如機(jī)/基因的結(jié)構(gòu)變化 與功能之間關(guān)系的研究。
[0005] 目前，世界已報(bào)道400多種G6PD缺乏生化型和160多種G6PD基因突變類型。G6PD基 因突變具有W下特點(diǎn)：多為單個(gè)堿基置換的錯(cuò)義突變，尚未發(fā)現(xiàn)整個(gè)基因或大片段基因的 缺失，也未見無(wú)義突變及移碼突變。中國(guó)人群中至少鑒定出31種點(diǎn)突變。1388G-A、1376G-T、 1024C-T、1004C-T、871G-A和95A-T為中國(guó)人最常見的如機(jī)/基因突變類型，其累計(jì)基因頻率 超過(guò)了 86%。通過(guò)蛋白質(zhì)比較，本課題組發(fā)現(xiàn)，人和斑馬魚的蛋白具有很高的相似性(相似度 88%)dA95T是中國(guó)一個(gè)比較常見的突變位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)S維結(jié)構(gòu)(PDB ID: 2B化）的學(xué) 習(xí)，發(fā)現(xiàn)在第32號(hào)氨基酸附近存在著W下二級(jí)結(jié)構(gòu)：32-37號(hào)氨基酸是巧斤疊的區(qū)域，38-40 號(hào)氨基酸是e轉(zhuǎn)角的區(qū)域，40號(hào)氨基酸是NADP+的結(jié)合位點(diǎn)，42-46號(hào)氨基酸是a螺旋的區(qū) 域[19]。通過(guò)和人的G6PD蛋白序列的比對(duì)，擬敲除斑馬魚G6PD的第40-48位氨基酸，即對(duì)斑馬 魚G6PD基因序列118-144位置制造突變，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將突變型如機(jī)/基因裝入特定 載體中，利用顯微注射技術(shù)將目的質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)顯性負(fù)性效應(yīng)，進(jìn)而建立G6PD 缺乏癥的斑馬魚模型，從而進(jìn)一步研究斑馬魚中g(shù)如c/的突變對(duì)其G6PD酶活性的影響，G6PD 的結(jié)構(gòu)及功能的變化導(dǎo)致紅細(xì)胞受損的詳細(xì)機(jī)制。為人類G6PD缺乏癥的詳細(xì)機(jī)制及大規(guī)模 高通量藥物篩選提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問(wèn)題是開發(fā)出由gata-j啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的118-144位點(diǎn)突 變g卸基因與eg卸基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，并提供該轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法及該 轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥藥物的過(guò)程中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明首先提出了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，該模型是由紅系細(xì)胞特異性啟動(dòng)子 ga ta巧區(qū)動(dòng)118-144位點(diǎn)缺失的突變《卸江基因，同時(shí)也是表達(dá)EGFP的可示蹤的轉(zhuǎn)基因斑馬魚 模型。
[0008]運(yùn)種由ga ta J啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)《卸狹變基因與e紅盛因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建 立方法，包括W下步驟： 1)將g如c/ww-w-雌卸-PC似+，阱ta-J-P公細(xì)-/see /質(zhì)粒酶切連接構(gòu)建了阱姑7- g6pcfu8-W-egfp-PBSK-Isce I質(zhì)'粒。
[0009] 2)將gataj-始護(hù)嚴(yán)W-W-峨曲-視細(xì)-2洗6 /質(zhì)粒通過(guò)顯微注射的方式注入1細(xì)胞期 斑馬魚胚胎動(dòng)物極胚盤內(nèi)。
[0010] 3)通過(guò)觀察24hpf期胚胎是否表達(dá)綠色巧光篩選出轉(zhuǎn)基因的胚胎并解化養(yǎng)至成魚 作為FO代轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
[0011] 4) WFO代轉(zhuǎn)基因斑馬魚與野生型交配后產(chǎn)生的表達(dá)綠色巧光的胚胎解化并養(yǎng)至 成魚作為Fl代轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
[0012] 5)通過(guò)觀察胚胎EGFP巧光情況和基因組PCR法鑒定轉(zhuǎn)入的如機(jī)嚴(yán)W-W-峨曲基因 的表達(dá)和插入情況。
[001引其中，步驟1)中的她7湛因的突變位點(diǎn)是118-144位點(diǎn)，該位點(diǎn)是模擬人類G6TO缺 乏癥中95A-T突變所產(chǎn)生的效應(yīng)。
[0014]進(jìn)一步的，運(yùn)種由gata-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)始護(hù)/"M-W突變基因和娜巧灌因的轉(zhuǎn)基因斑 馬魚模式的應(yīng)用主要是：該模型是通過(guò)顯性負(fù)效應(yīng)建立的葡萄糖-6-憐酸脫氨酶缺乏癥 (G6P孤）的斑馬魚模型用于篩選治療G6PD缺乏癥藥物的過(guò)程中能可示蹤的觀察到藥物處理 過(guò)程中紅細(xì)胞的變化。
[001引相比于傳統(tǒng)的G6PD缺乏癥動(dòng)物模型，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： l.gata-J是原始紅系發(fā)育中的特異性的轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)記早期紅系細(xì)胞。在24hpf，斑馬 魚的血液循環(huán)開始建立，利用gata-J作為驅(qū)動(dòng)突變的g如c/基因的啟動(dòng)子可W使突變型 如機(jī)/基因在紅細(xì)胞中特異性表達(dá)。
[OOW 2. ga ta洞時(shí)驅(qū)動(dòng)她7媽e紅/遙因，可實(shí)現(xiàn)突變型她7湛因在紅細(xì)胞中表達(dá)的"可 不蹤"觀察。
[0017] 3.斑馬魚胚胎與成魚通體透明，構(gòu)建的該動(dòng)物模型可W在顯微鏡下示蹤胚胎和魚 體內(nèi)巧光標(biāo)記紅細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下的變化規(guī)律，為篩選治療G6PD缺乏癥的藥物提供可視的 動(dòng)物模型。
【附圖說(shuō)明】 [001 引 圖1是gataj-g犧/"s-w-e如聰基因斑馬魚胚胎Fl代幼魚巧光表達(dá)鑒定情況。
[0019] 圖1中：A-E分別是Z卿加 ..S曲/iis-w-e紅/潑育至11.24.36.48.72小時(shí)的巧光圖； F-J野生型斑馬魚對(duì)照； 圖2是基因組PCR鑒定結(jié)果。
[0020] 圖2中：]?:0難111曰'1^1.邸3(37.'《如/118-144-邸卸轉(zhuǎn)基因系斑馬魚；2.胖1'; 3. Zga taJ-e 的古；4.空白； 圖3是全胚胎原位雜交檢測(cè)egfp鑒定轉(zhuǎn)基因模型構(gòu)建情況。
[002"1]圖帥：A.zgataJ.'g卸i/iis-i44-端卻轉(zhuǎn)基因系斑馬魚;B.zgataJ-e^卻轉(zhuǎn)基因系斑 馬魚;C. WT斑馬魚。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0023] 實(shí)施例1: 本發(fā)明提供通過(guò)胚胎顯微注射質(zhì)粒得到轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，構(gòu)建了 gata J- g曲的古-/WSJ-Zsce /質(zhì)粒，將新構(gòu)建的質(zhì)粒與Isce I酶通過(guò)顯微注射的方法一起 注入斑馬魚1細(xì)胞期胚胎，達(dá)到ga ta J啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)突變的《卸江基因與端力7基因特異性在紅系 細(xì)胞表達(dá)的效果。
[0024] 其中，制備G6PD轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的方法，包括如下步驟： (1)運(yùn)用重疊延伸定點(diǎn)誘變的方法制備突變型Zg卸/Ii^44基因： A.通過(guò)和人的G6PD蛋白序列的比對(duì)，確定致變斑馬魚G6PD的第40-48位氨基酸。根據(jù) NCBI所提供的斑馬魚cDNA(NCBI Reference Sequence: XM_694076.5)序列，分別設(shè)計(jì)了兩 對(duì)引物，第一對(duì)引物的上游加入BamHI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，第二對(duì)引物的下游加入EcoRI 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成： 第一對(duì)正向引物反向引物：
B.制備斑馬魚cDNA: 分別收集野生型斑馬魚24、36、48、72、96119巧巧個(gè)時(shí)相的胚胎各10枚，將裂解液吸入 1.5ml的化P管中，室溫5分鐘，加入20化1氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min; 12000g離屯、12min(4°C)，將上清移入RNase Free的EPP管中，加入50化1異丙醇，充分混 勻后，-20°C放置化； 將EPP管取出，12000g離屯、10min(4°C )，棄上清，向試管中加入1ml預(yù)冷的75%乙醇，充分 混勻后，7500g離屯、5分鐘(4°C)，棄上清； 重復(fù)上一步； 室溫驚干IOmin. 加入預(yù)熱的1化1 DEPC-出O溶解RNA，55 °C放置1 Omin，使其完全溶解； 取山1的總RNA樣品，用2%凝膠電泳檢測(cè)其完整性，電壓5V/cm，時(shí)間15min，并用紫外分 光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。
[0025] 利用隨機(jī)引物法將上述步驟制備所得的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到斑馬魚cDNA。
[0026] C.采用第一對(duì)引物對(duì)和第二對(duì)引物分別WcDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。分別將PCR 產(chǎn)物跑凝膠電泳后割膠回收引物一和引物二的擴(kuò)增片段。W回收的目的片段為模板，引物 一的上游片段與引物二的下游片段為配對(duì)引物進(jìn)行第S次PCR反應(yīng)。切膠回收該次PCR產(chǎn)物 即為^如機(jī)/11^44基因片段。
[0027] (2)zg6機(jī)/"W-W-/7C5A重組質(zhì)粒的建立： 將8^44基因及P C5"+載體分別用公amW巧進(jìn)行雙酶切，雙酶切后跑凝膠電 泳回收開鏈酶切產(chǎn)物，采用如下體系對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，獲得Zg?卸/Iis-I44-Z^C戶+重組質(zhì) 粒： 組分 體積山1) /7(5""+割膠回收產(chǎn)物（lOOng/yl) 3 Zg卸/11W44割膠回收產(chǎn)物(200ng/y 1) 5 IOX T4 DNA Ligase Buffer I T4 DNA Ligase I 總體積 10 (3 ) Z ga ta 7-游細(xì)重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 將Zga虹7-游細(xì)及游細(xì)/5邸進(jìn)行雙酶切，將Zga虹7啟動(dòng)子連接到游細(xì)/S彷/。
[002引組分 體積(yl) /7公細(xì)淵(lOOng/yl) 3 zgataJ(200ng/yl) 5 IOX T4 DNA Ligase Buffer I T4 DNA Ligase I 總體積 10 (4 ) Zga ta J .'g 卸 i/iis-i44- e 紅 重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 將Zg曲/11S-144-峨曲-成滬和Z卿虹游細(xì)/淵巧feffl化和Afe t德切，分別跑凝膠電泳 切膠回收開鏈片段，將兩種開鏈片段用W下體系連接，獲得部?ata厶?g如/ll8-l44-邸?卸- JO公5?75c^重組質(zhì)粒： 組分 體積山1) zgatal-pBSKiscE I 3 g 卸(/"8-144-eg卸 5 IOX T4 DNA Ligase Buffer 1 T4 DNA Ligase 1 總體積 10 (5) 顯微注射 取斑馬魚1細(xì)胞胚胎，采用如下體系用將Zga ta J .?始1W44- eg?曲-恤細(xì)75^￡產(chǎn)組質(zhì)粒 注入斑馬魚1細(xì)胞胚胎內(nèi)。
[0029] 組分 體積(yl) 質(zhì)粒(終濃度SOngAil) 1山 I-SceI 酶 0.5山 I-SceIbuffer 0.3山 水 3.化1 總體積 扣1 (6) 轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的篩選： A.將顯微注射后的胚胎置于egg water中培養(yǎng)至24小時(shí)后，在巧光顯微鏡下挑出綠色 胚胎進(jìn)行培養(yǎng)。
[0030] B.轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的篩選 將培養(yǎng)至性成熟的斑馬魚作為FO代，與野生型的斑馬魚進(jìn)行交配;將收獲的胚胎置于 egg water中培養(yǎng)至24小時(shí)，挑選出可W表達(dá)綠色巧光的胚胎作為Fl代。同時(shí)將FO代斑馬魚 進(jìn)行編號(hào)；將Fl代魚培養(yǎng)至性成熟W后，進(jìn)行自交。挑選出純合子作為F2代;將F2代魚培養(yǎng) 至性成熟W后，進(jìn)行自交。挑選出純合子作為F3代。
[0031] (7)轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的鑒定 A. EGFP綠色巧光蛋白觀察鑒定： 按照常規(guī)方法將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的胚胎解化出幼魚并飼養(yǎng)至性成熟，然后將其和野生型斑馬 魚交配，在巧光顯微鏡下挑選出可W表達(dá)綠色巧光蛋白的斑馬魚作為Fl代。
[0032] B. PCR法鑒定： 收集出生后5天的陽(yáng)性胚胎，同時(shí)W野生型和zgataJ:egfp的斑馬魚做對(duì)照，提取基因 組DNA，W如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)： 組份 體積山1) IOX Buffer K孤-Plus- 5 2mM dNTPs? 5 25mM MgS〇4 4 lOymol/山 Primer g6pd上游 I lOymol/山 Primer g6pd下游 I 基因組DNA 2 PCR grade water 31 KOD-Plus- (I.OU/yI) I 總體積 50 C.原位雜交鑒定： 采用egfp探針對(duì)受精后25h轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎進(jìn)行原位雜交，雜交過(guò)程如下： 甲醒梯度脫水： 加入1ml 25%甲醒/PBST，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 50%甲醒/PBST，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 75%甲醒/PBST，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 100%甲醒，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 100%甲醒，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 100%甲醒-20°C保存。
[0033] 原位雜交第一天再水化胚胎： 加入1ml 75%甲醒/PBST，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 50%甲醒/PBST，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 加入1ml 25%甲醒/PBST，室溫輕搖IOmin，棄廢液； 清洗胚胎:用1 X PBST清洗S遍，1 X quick，1 X 5min，1 X quick，室溫下輕搖； 胚胎再固定:加入1ml 4%多聚甲醒/PBST，4°C輕搖比后，于室溫下輕搖20min; 清洗胚胎：用1 XPBST清洗S遍，1 Xqui ck，1 X 5min，1 X quick,室溫輕搖，將胚胎移入 RNase化ee的EPP管中； 預(yù)雜交：向RNase化ee的EPP管中加入1ml 68°C預(yù)熱的HYB(-)液體，置于雜交爐中68°C 輕搖15min; 雜交:用RNase Free槍頭將HYB(-)液體棄掉，加入預(yù)熱的HYB( + )溶液40化1/管，68°C雜 交爐中輕搖Ih，再加入帶有Dig標(biāo)記的峨曲探針(使其終濃度為Ing/y 1 )，68 °C雜交爐輕搖過(guò) 夜。
[0034] 原位雜交第二天 洗涂胚胎： 2 X SOmin，2 X SSCT/50%甲酯胺2ml，68 °C雜交爐中輕搖； IX 15min，2XSSCT 2ml，68°C雜交爐中輕搖； 2X SOmin，0.2XSSCT 2ml，68°C雜交爐中輕搖， 將胚胎移至12孔板； MABT洗涂3 X 5min，室溫輕搖； 每孔加入2.5ml阻滯液，室溫輕搖Ih; 加入抗地高辛抗體(anti-Dig FAB antibody)，抗體終濃度為1:5000。將12孔板移入4 °C，搖床上輕搖過(guò)夜。
[0035] 原位雜交第S天 洗涂胚胎： lX30min，阻滯液2.5ml，室溫輕搖； IX lh，MABT2ml，室溫輕搖； 3X 5min，staining buffe;r(PH=9.5)2ml,搖床上室溫避光輕搖；IX 5min，0.1M Tris(PH=9.5)2ml,室溫避光輕搖； 染色:在O. IM Tris(PH=9.5)中，每2.5ml 內(nèi)加入Vector BCIP/NBT試劑盒中的solution 1 一滴，混勻，加入solution 2 -滴，混勻，加入solution 3-滴，充分混勻即成。將染液加 入12孔板后，用侶錐包裹12孔板避光，室溫下輕搖，每隔20min觀察一次，直至染色成功； 終止染色:染色成功后，加入1 X PBST Iml洗涂，2 X 5min，室溫輕搖； 固定:加入4%多聚甲醒/PBST固定液，4 °C輕搖過(guò)夜； 保存:加入1ml 4%多聚甲醒/PBST固定液，4 °C保存； 當(dāng)然，W上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同替換 或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法，其特征在于:該模 型是由ga i a 2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)g φ c/突變基因與嘆辦基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，其建立方法 包括以下步驟： 1)將邱廣於，抑fa _7 ce ^質(zhì)粒酶切連接構(gòu)建了抑j _ g6pcf118-144-egfp-PBSK-Isce I質(zhì)MU 2 )將ga ia』-冰I質(zhì)粒通過(guò)顯微注射的方式注入1細(xì)胞期斑馬 魚胚胎動(dòng)物極胚盤內(nèi)； 3) 通過(guò)觀察24hpf期胚胎是否表達(dá)綠色熒光篩選出轉(zhuǎn)基因的胚胎并孵化養(yǎng)至成魚作為 代轉(zhuǎn)基因斑馬魚； 4) 以FO代轉(zhuǎn)基因斑馬魚與野生型交配后產(chǎn)生的表達(dá)綠色熒光的胚胎孵化并養(yǎng)至成魚 作為Fl代轉(zhuǎn)基因斑馬魚； 5) 通過(guò)觀察胚胎EGFP熒光情況和基因組PCR法鑒定轉(zhuǎn)入的基因的表 達(dá)和插入情況。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立方法， 其特征在于:步驟1)中的於ipc/基因的突變位點(diǎn)是118-144位點(diǎn)，該位點(diǎn)是模擬人類G6H)缺乏 癥中95A-T突變所產(chǎn)生的效應(yīng)。
【文檔編號(hào)】A01K67/02GK105925607SQ201610385063
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】舒莉萍, 何志旭, 周艷華, 庹媛媛, 夏海雄, 崔冬冰
【申請(qǐng)人】貴州醫(yī)科大學(xué)