基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物技術領域的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，包括如下步驟：構建表達免疫毒素中具有導向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的載體DNA片段，將所述兩種多肽的載體DNA片段與內含肽的N端或C端分別連接，形成融合表達載體；取步驟一所述的融合表達載體，表達，得到融合內含肽N端的融合多肽A以及融合內含肽C端的融合多肽B；取融合多肽A和融合多肽B，混合，在內含肽對應的反式剪接條件下，誘導，得到免疫毒素。本發(fā)明的方法只需要制備不同的導向部分多肽以及毒性部分多肽，就可以將其進行組合，進而產(chǎn)生可以針對不同靶點及擁有不同毒性機制的免疫毒素，具有顯著的多樣性及靈活性。
【專利說明】
基于內含化的藥用重組蛋白的合成方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種生物技術領域的藥用重組蛋白的合成方法，具體地講，設及一種 基于內含膚的藥用重組蛋白的合成方法。
【背景技術】
[0002] 免疫毒素是一種融合蛋白，包含導向多膚部分，毒性多膚部分，和/或接頭多膚部 分。自從單克隆抗體于1957年被Kohlor應用雜交瘤技術首次制備出來，其就在醫(yī)學研究W 及疾病的臨床診斷和治療領域展示出了廣闊的應用前景。長期W來，人們致力于利用單克 隆抗體治療多種疾病，例如腫瘤、自身免疫疾病等等，然而單獨使用單克隆抗體的效果有時 并不理想。為了達到更有效的治療效果，人們將一些具有細胞毒性的蛋白與單抗結合，形成 了具有選擇性殺傷與之相結合的細胞的"免疫毒素"，為疾病的祀向治療的彈藥庫裝備了新 的彈藥。
[0003] 免疫毒素Qmmunotoxins，ITs)是指將具有導向功能的蛋白與毒素蛋白相結合而 產(chǎn)生的一種蛋白分子。其中具有導向性功能的部分主要負責引導免疫毒素蛋白分子與祀細 胞的特異性結合，而毒素蛋白部分則主要是起到對細胞進行殺傷的作用。
[0004] 從免疫毒素發(fā)展演變的進程來看，免疫毒素的制備生產(chǎn)主要有化學偶聯(lián)法和重組 表達法兩大類?；瘜W偶聯(lián)法制備免疫毒素首先需要單獨制備抗體和毒素，隨后通過化學偶 聯(lián)的方式將二者相連而制得免疫毒素。化學偶聯(lián)法的偶聯(lián)效率低，生產(chǎn)成本較高，且由于蛋 白上可能發(fā)生偶聯(lián)反應的位點眾多而導致產(chǎn)品均一性差，另外偶聯(lián)的化學鍵在體內循環(huán)時 傾向于降解，使得裸毒素泄露而導致非特異性毒性，有較大的毒副作用風險，而降解產(chǎn)生的 裸抗體則可能封閉抗原，使得治療效果不佳。而隨著基因工程的發(fā)展，使得免疫毒素的制備 生產(chǎn)進入了新的時代。人們利用基因重組技術將編碼導向功能多膚的基因與編碼毒素多膚 的基因相融合并在適當?shù)谋磉_系統(tǒng)中進行表達。采用運一技術方案生產(chǎn)的免疫毒素我們可 W稱之為基因工程免疫毒素，它相比化學偶聯(lián)法制造的免疫毒素而言在產(chǎn)品均一性和穩(wěn)定 性上有了大幅提高，并且使得大量生產(chǎn)免疫毒素成為可能。但基因工程法生產(chǎn)免疫毒素也 有其局限性:融合基因被限制在單一宿主中進行表達，而構成免疫毒素的導向部分和毒性 部分往往需要不同的宿主表達環(huán)境運一矛盾往往導致采用單一的宿主表達目的免疫毒素 不能獲得很好的產(chǎn)量、收率、純度W及隨之而來的成本的提高。例如目前多采用大腸桿菌表 達系統(tǒng)表達單鏈抗體免疫毒素，由于免疫毒素的導向部分在大腸桿菌表達系統(tǒng)中不能很好 的折疊而往往形成包涵體，而包涵體的復性是一個非常復雜的過程，一般來說，蛋白質的復 性效率在20%左右;而毒素蛋白對真核細胞具有致命毒性，若采用真核表達系統(tǒng)則可能對 宿主細胞產(chǎn)生毒害，但是也有研究人員對利用真核表達系統(tǒng)表達免疫毒素做了大量的工 作，如專利CN1863921公開了一種在畢赤酵母W及EF-2突變型畢赤酵母中表達免疫毒素的 方法，雖然采用分泌表達的方式在畢赤酵母W及EF-2突變型(毒素免疫型)畢赤酵母表達系 統(tǒng)中成功表達了免疫毒素，較長的發(fā)酵周期獲得的較低的產(chǎn)量相比于原核表達系統(tǒng)而言并 不具備競爭力，且毒素蛋白上的糖基化位點可能被宿主進行糖基化修飾，有可能引入產(chǎn)品 不均一性;文獻披露了一種在EF-2突變型的C冊細胞中表達免疫毒素的方法，該方法同樣遭 遇了表達量低下、發(fā)酵周期長、成本高昂W及潛在的糖基化的風險（Protein expression and purification,2000,19(2):304-311)〇
[0005] 內含膚是指存在于前體蛋白當中的一段序列，在前體蛋白轉化為成熟蛋白質的過 程中，依靠自剪接功能將內含膚兩端的外顯膚W膚鍵連接，同時將自身從前體蛋白中釋放 出來。內含膚從結構和功能上可W分割為N端和C端，當N端或C端單獨存在時不能發(fā)生剪接 反應，而只有當N端和C端在適合剪接的條件下接觸時才能發(fā)生剪接反應。斷裂內含膚可W 是人為地將連續(xù)內含膚從適當位置斷開成兩個多膚片段，也可W是天然存在的。天然斷裂 內含膚是一類由兩個分別轉錄和表達的基因編碼的兩個多膚片段，運些斷裂內含膚在接觸 時會自組合并W反式剪接方式催化外顯膚的連接。內含膚在生物技術應用中應用廣泛，包 括使用內含膚的剪接活性介導蛋白質連接（intein-mediated protein ligation, I化）、蛋 白質環(huán)化、蛋白質標記、毒性蛋白表達、引入非天然氨基酸、研究體內蛋白質互作等。利用內 含膚及其變體介導蛋白質純化并在大規(guī)模蛋白質生產(chǎn)中應用也日益受到關注。因此，本領 域需要提供一種通用、易于操作、成本低廉獲取融合免疫毒素的方法。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于內含膚的藥用重組蛋白的 合成方法。本發(fā)明克服現(xiàn)有的利用化學偶聯(lián)或融合表達方法制備免疫毒素技術中產(chǎn)品不均 一、操作步驟多、目的蛋白對表達宿主有毒性等等不足，提供一種分別制備具有導向功能的 多膚和具有細胞毒性的多膚并利用內含膚的反式剪接功能將其連接在一起，從而得到免疫 毒素的方法。
[0007] 本發(fā)明是通過W下的技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明設及一種基于內含膚的藥用重組蛋 白的合成方法，所述方法包括如下步驟：
[0008] 步驟一，構建表達免疫毒素中具有導向功能的多膚和具有毒性功能的多膚的載體 DNA片段，將所述兩種多膚的載體DNA片段與內含膚的N端或C端分別連接，形成融合表達載 體;其中，所述含有內含膚N端的融合表達載體與含有內含膚C端的融合表達載體所表達的 多膚需成對存在，W使得反式剪接反應能夠發(fā)生；
[0009] 步驟二，取步驟一所述的融合表達載體，分別在合適的宿主細胞中進行表達，得到 融合內含膚N端的融合多膚AW及融合內含膚C端的融合多膚B;
[0010] 步驟=，取融合多膚A和融合多膚B，混合，在內含膚對應的反式剪接條件下，誘導 免疫毒素的導向功能的多膚W及具有毒性功能的多膚部分進行反式剪接，得到免疫毒素。
[0011] 優(yōu)選地，步驟一中，所述內含膚為人工斷裂內含膚、或天然斷裂內含膚，或具有剪 接功能的內含膚突變體。
[0012] 優(yōu)選地，步驟一中，所述內含膚為Ssp DnaB、Ssp化aE或化U DnaEo
[OOU]優(yōu)選地，步驟一中，所述內含膚N端的C末端或C端的N末端還融合有功能性多膚。
[0014] 優(yōu)選地，所述功能性多膚為MBP或化抓標簽蛋白。
[0015] 優(yōu)選地，步驟一中，所述融合表達載體的構成為導向功能多膚-內含膚N端、或內含 膚C端-毒性功能多膚，或毒性功能多膚-內含膚N端、或內含膚C端-導向功能多膚，或導向功 能多膚-內含膚N端-功能多膚、或功能多膚-內含膚C端-毒性功能多膚，或毒性功能多膚-內 含膚N端-功能多膚、功能多膚-內含膚C端-導向功能多膚。
[0016] 優(yōu)選地，步驟一中，所述具有導向功能的多膚為抗體、單鏈抗體scFv、二硫鍵穩(wěn)定 抗體dsFv、二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體dsscFvJab抗體、細胞因子、或生長因子。
[0017] 優(yōu)選地，步驟一中，所述具有毒性功能的多膚為RIP型毒素;具體為藍麻毒素、ADP 核糖基化免疫毒素，白喉毒素、或綠脈桿菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的 突變體。
[0018] 優(yōu)選地，步驟二中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
[0019] 優(yōu)選地，所述宿主細胞為大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、高擴酵母細胞、昆蟲細胞、植物 細胞、哺乳動物細胞、酵母、中國倉鼠卵巢細胞、或人腎胚細胞。
[0020] 優(yōu)選地，步驟=中，還包括分離純化進而獲得免疫毒素的步驟。
[0021] 優(yōu)選地，所述分離純化的方法為親和層析方法、離子交換層析方法、或疏水作用層 析方法。
[0022] 優(yōu)選地，步驟=中，所述反式剪接條件為能夠觸發(fā)指定內含膚完成自剪接的條件。
[0023] 優(yōu)選地，當內含膚為化U Dn址時，反式剪接條件為：0-55°C，pH為3-11，接觸時間 ls-60h，終濃度為0.0 SmM-I OOmM的親核試劑。
[0024] 優(yōu)選地，所述親核試劑為DTT，DTE，CYSTEI肥，TCEP，或MESNA親核性試劑。
[0025] 本領域技術人員進一步知曉，本發(fā)明的制備方法中，步驟一中，所述的內含膚是具 有自剪接功能的內含膚，可為野生型或可包含相對于野生型的變異，優(yōu)選為具有反式剪接 功能的內含膚，如人工斷裂內含膚、天然斷裂內含膚，優(yōu)選為天然斷裂內含膚，如Ssp DnaB、 Ssp化aE或化U化址，優(yōu)選為化U DnaE;在設及利用內含膚的剪接功能的實施方案中，內含 膚與目的蛋白之間的接頭可W包含天然外顯膚序列。本文中所用術語"外顯膚"是指天然發(fā) 現(xiàn)的、與內含膚或內含膚結構域鄰近的序列，例如對應野生型化U化址，C端外顯膚可W是 CFNAS、CFNK，CFN，CF，C。步驟一中，所述的毒性功能多膚可W包括RIP型毒素如藍麻毒素、 ADP核糖基化免疫毒素，如白喉毒素、綠脈桿菌外毒素部分的融合蛋白等。毒素部分可W為 截短型（truncated)部分和/或可包含相對于野生型毒素的變異。步驟一中，所述的表達載 體是本領域技術人員已知的各種表達載體或其修改變體，本領域技術人員可根據(jù)常規(guī)手段 來獲得編碼目標多膚的DNA分子，并通過本領域熟知的各種方法，將其與所述的表達載體中 表達調控序列相連;步驟一中，所述的免疫毒素中具有導向功能的多膚可W是抗體、單鏈抗 體scFv、二硫鍵穩(wěn)定抗體dsFv、二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體dsscFv、Fab抗體、細胞因子、生長因子 等本領域技術人員所熟知的具有免疫親和吸附能力的多膚，本領域技術人員可W根據(jù)祀細 胞，選擇在免疫毒素中使用何種多膚。
[0026] 步驟二中，所述宿主細胞可W包括原核細胞和真核細胞，例如常用的原核宿主細 胞大腸桿菌、枯草芽抱桿菌等等，常用的真核宿主細胞高擴酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞、 哺乳動物細胞等。本發(fā)明中所述的宿主細胞包括但不限于大腸桿菌、酵母、中國倉鼠卵巢細 胞、人腎胚細胞等。本領域技術人員熟知，用表達載體轉化/轉染宿主細胞的方法有很多種， 所用的轉化方法和轉化程序取決于待轉化的宿主。例如原生質體融合、電穿孔、脂質體介導 轉染、陽離子介導轉染等;在適合目的多膚表達的條件下，培養(yǎng)轉化/轉染獲得的宿主細胞， 隨后根據(jù)目的多膚的性質W及定位，可W選擇本領域技術人員熟知的各種蛋白純化步驟， 如親和層析（包括但不限于Protein AJroteinGProtein L、IMAC等）、疏水作用層析、離子 交換層析、透析等分離純化手段。
[0027] 步驟=中，所述的分離純化可采用常規(guī)的蛋白純化步驟。步驟=中，混合是指將一 種物質置于與另一種物質發(fā)生物理關聯(lián)的條件下接觸。
[0028] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:傳統(tǒng)生產(chǎn)免疫毒素的技術方法中 存在諸多不足之處，如化學偶聯(lián)法中需要加入化學試劑，由于導向多膚部分中修飾位點較 多而導致的產(chǎn)品不均一，同時化學偶聯(lián)鍵容易斷裂而導致毒性滲漏等;而直接表達免疫毒 素融合蛋白的策略中，若采用原核表達系統(tǒng)，則目的蛋白往往W包涵體形式存在，復性效率 低且步驟繁瑣過程復雜，若采用真核表達系統(tǒng)則免疫毒素的表達可能受限于其對宿主細胞 存在的天然毒性。本發(fā)明的方法則克服了在免疫毒素生產(chǎn)的傳統(tǒng)策略中存在的不足，實現(xiàn) 了意想不到的技術效果：
[0029] 1、本發(fā)明的方法只需要制備不同的導向部分多膚W及毒性部分多膚，就可W將其 進行組合，進而產(chǎn)生可W針對不同祀點及擁有不同毒性機制的免疫毒素，具有顯著的多樣 性及靈活性；
[0030] 2、本發(fā)明的方法中，導向部分多膚和毒性部分多膚可W在適當?shù)乃拗骷毎蟹珠_ 表達，如需要特殊的折疊環(huán)境，特別是高級的翻譯后修飾，可W在哺乳動物細胞中進行表 達，而沒有太多修飾需求的多膚可W在大腸桿菌中進行表達，在適合的表達系統(tǒng)中分別表 達目的多膚可W獲得較高的產(chǎn)量、收率W及純度；
[0031] 3、本發(fā)明的方法中，導向部分多膚和毒素部分多膚的連接是位點特異性的，不會 生產(chǎn)副產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物產(chǎn)品均一性高；
[0032] 4、本發(fā)明的方法中，導向性部分多膚和毒素部分多膚經(jīng)由內含膚的自剪接，是由 膚鍵連接在一起，相比于化學偶聯(lián)法等連接方式具有良好的穩(wěn)定性；
[0033] 5、本發(fā)明的方法中，自剪接反應條件溫和、反應高效，易于與其他工藝進行整合、 放大;反應過程無需加入有毒有害作用物質。
【附圖說明】
[0034] 通過閱讀參照W下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0035] 圖1為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例1中用SDS-PAGE檢測經(jīng) 過Ni-S巧harose層析柱純化的融合蛋白化-PE3K呢L的結果示意圖。
[0036] 圖2為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例1中用SDS-PAGE檢測經(jīng) 過Ni-Sepharose層析柱純化的融合蛋白dsscFv CD22-Nn-Fc的結果示意圖。
[0037] 圖3為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例1中用Western Blot檢 測dsscFv CD22-Nn-Fc與化-PE38KDEL反式剪接生成dsscFv CD22-PE38K呢L的結果示意圖。
[0038] 圖4為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例2中用SDS-PAGE檢測經(jīng) 過Protein L層析柱純化的融合蛋白化b-化的結果示意圖。
[0039] 圖5為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例2中用SDS-PAGE檢測 化b-化與化-PE38KDEL反式剪接生成化b-PE38K呢L的結果示意圖。
[0040] 圖6為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例3用Western Blot檢測 Herceptin-化與化-PE38KDEL反式剪接生成Here巧tin-PE38K呢L的結果示意圖。
[0041 ]圖7為實施例中設及表達質粒的結構圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，運些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如薩姆布魯克等分子克隆：實驗手冊第=版(科學出版社，2002)中所述的條件，或者 按照各制造商所建議的條件。
[00創(chuàng) 實施例1、利用化U DnaE的反式剪接功能制備免疫毒素 dsscFv CD22-PE38KDEL
[0044] 1、構建融合了斷裂內含膚化U DnaE C端的毒性多膚表達載體pET-28a( + )-Nc- PE38KDEL
[0045] 利用表中引物分別克隆編碼PE38KD化毒素的基因W及化U Dn址的C端基因，采用 I^KaRa公司的PrimerStar Max進行擴增，PCR條件為94°C IOs，55°C IOs，72°C IOs，30個循環(huán)， 將得到的片段瓊脂糖凝膠電泳回收后利用重疊PCR將編碼化U DnaE的C端基因與編碼 PE38KD化的基因按化U Dn址的C端在融合多膚N端的順序合成，PCR條件為94°C10s，55°C IOs，72°C 10s，30個循環(huán)，將此基因片段用NdeI和NotI處理，并與同樣經(jīng)過Nde巧日NotI處理 的祀T-28a( + )進行連接，質粒結構圖如圖7所示。將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細 胞，將轉化細胞涂布于含50yg/mL卡那霉素的瓊脂平板培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的單克 隆，于5mL含50iig/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，并提取質粒，對其進行測序，:J則 序結果表明所構建的化-PE38KD化序列正確。
[0046] 表 1
[0047]
[0048] 2、融合蛋白化-PE38K呢L的表達和純化
[0049] 將測序正確的質粒轉化進大腸桿菌表達菌株化21感受態(tài)中，37°C過夜培養(yǎng)出單菌 落后，挑單菌落于含50iig/mL卡那霉素的5ml LB培養(yǎng)基中37°C，180rmp，過夜培養(yǎng)。
[(K)加]取5ml培養(yǎng)液加入500ml含50iig/mL卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 為0.6-0.8時加入終濃度為0.2mM的IPTG，在30 °C下誘導16h后，400化pm離屯、IOmin收集菌 體。
[0化1] 將收集的菌體用結合緩沖液(20mM PBS、500mM化ClJOmM咪挫、pH7.5,每Ig菌體 用20ml結合緩沖液)重懸，高壓均質機破碎菌體，4 °C下1200化pm離屯、30min，收集上清，上清 用0.45皿過濾，準備用Ni化NTA進行純化。
[0052]裝填Ni2+重力柱，柱床體積1ml，用5倍柱體積水洗之后用10倍柱體積結合緩沖液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，將收集到的上清上柱，流速為Iml/min，上 柱完畢后，用5倍柱體積的Binding Buffer沖洗，隨后用10倍柱體積包含60mM咪挫的洗脫緩 沖液(20mM PBS、500mM NaCl、60mM咪挫、PH7.5)沖洗非特異性結合蛋白，隨后用10倍柱體積 150mM咪挫的洗脫緩沖液(20mM PBS、SOOmM化Cl、150mM咪挫、pH7.5)洗脫，分管收集，每管 Iml，SDS-PAGE檢測洗脫情況，合并目標蛋白，得到融合蛋白NC-PE38K呢L。圖1為本發(fā)明的利 用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例1中用SDS-PAGE檢測經(jīng)過Ni-Sepharose層析柱純化 的融合蛋白化-PE3K呢L的結果示意圖。
[0053] 3、構建融合了斷裂內含膚化U DnaE N端的CD22抗體表達載體祀T-22b( + )-dsscFv CD22-Nn-Fc
[0054] 利用表2中引物分別克隆化U Dn址的N端基因W及人IgG的化片段，采用TaKaRa公 司的PrimerStar Max進行擴增，PCR條件為94°C 10s，55°C 10s，72°C 10s，30個循環(huán)，將得 到的片段瓊脂糖凝膠電泳回收后利用重疊PC時尋按照化U DnaE N端-Fe片段的順序將擴增 得到的片段進行合成，PCR條件為94°C 10s，55°C 10s，72°C10s，30個循環(huán)，將此基因片段用 BamHI和NotI處理，并與同樣經(jīng)過BamH巧日NotI處理的攜帶dsscFv CD22的祀T-22b( + )進行 連接，融合基因順序為dsscFv CD22-Nn-Fc。
[0055] 將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于含50iig/mL氨節(jié)青 霉素的瓊脂平板培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的單克隆，于5mL含50yg/mL氨節(jié)青霉素的LB培 養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，并提取質粒，對其進行測序，測序結果明所構建的dsscFv CD22-Nn- Fc序列正確。圖2為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例1中用SDS-PAGE檢測 經(jīng)過Ni-Sepharose層析柱純化的融合蛋白dsscFv CD22-Nn-Fc的結果示意圖。
[0化6] 表2
[0化7]
[0化引 4、融合蛋白dsscFv-Nn-Fc的表達與純化
[0059] 將測序正確的質粒轉化進大腸桿菌表達菌株化21感受態(tài)中，37°C過夜培養(yǎng)出單菌 落后，挑單菌落于含50iig/mL氨節(jié)西林的5ml LB培養(yǎng)基中37°C，180rmp，過夜培養(yǎng)。
[0060] 取5ml培養(yǎng)液加入500ml含50yg/mL氨節(jié)西林的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 為0.6-0.8時加入終濃度為0.02111]\1的1?了6，在25°(：下誘導1611后，4000巧111離屯、10111111收集菌 體。
[0061 ] 將收集的菌體用結合緩沖液(20mM PBS、500mM化ClJOmM咪挫、PH7.5,每Ig菌體 用20ml結合緩沖液)重懸，高壓均質機破碎菌體，4 °C下1200化pm離屯、30min，收集上清，上清 用0.45皿過濾，準備用Ni2+NTA進行純化。
[0062] 裝填Ni2+重力柱，柱床體積1ml，用5倍柱體積水洗之后用10倍柱體積結合緩沖液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，將收集到的上清上柱，流速為Iml/min，上 柱完畢后，用5倍柱體積的Binding Buffer沖洗，隨后用10倍柱體積包含60mM咪挫的洗脫緩 沖液(20mM PBS、500mM NaCl、60mM咪挫、PH7.5)沖洗非特異性結合蛋白，隨后用10倍柱體積 150mM咪挫的洗脫緩沖液(20mM PBS、SOOmM化Cl、150mM咪挫、pH7.5)洗脫，分管收集，每管 Iml，SDS-PAGE檢測洗脫情況，合并目標蛋白，得到融合蛋白dsscFv-Nn-Fc。
[0063] 5、利用化U DnaE的反式剪接制備dsscFv CD22-PE38KDEL
[0064] 將步驟2得到的融合多膚NC-PE38邸化與步驟4得到的融合多膚dsscFv CD22-Nn- Fc W摩爾比I: I進行混合，并加入終濃度為ImM的DTT，于25°C下保溫60min，取樣品進行SDS- PAGEW及Western Blot檢測。圖3為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施例1中 用Western Blot檢測dsscFv CD22-Nn-Fc與NC-PE38KDEL反式剪接生成dsscFv CD22- 陽38K呢L的結果示意圖。
[0065] 6、經(jīng)由化U DnaE反式剪接產(chǎn)生的dsscFv CD22-PE38邸化的分離純化
[0066] 利用Ni2^NTA去除步驟5中為發(fā)生反式剪接反應的融合多膚W及反式剪接說產(chǎn)生的 副產(chǎn)物來純化dsscFv CD22-PE38KDEL。
[0067] 裝填Ni2+重力柱，柱床體積1ml，用5倍柱體積水洗之后用10倍柱體積結合緩沖液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，將步驟5得到的反應體系上柱，流速為Iml/ min,收集流穿，上柱完畢后，用5倍柱體積包含40mM咪挫的洗脫緩沖液（20mM PBS、500mM 化Cl、40mM咪挫、pH7.5)沖洗，隨后用IO倍柱體積包含150mM咪挫的洗脫緩沖液(20mM PBS、 SOOmM化Cl、150mM咪挫、pH7.5)沖洗，SDS-PAGE檢測收集的蛋白樣品，依需要，可冷凍和在- 20°C或-80°C保存，或者用于更高純度的純化，例如離子交換層析，疏水層析，W及分子排阻 層析等。
[006引 實施例2、利用化U化aE的反式剪接功能制備免疫毒素化r Fab-PE38KDEL
[0069] 1、構建融合了斷裂內含膚化U DnaE N端的Her VH-CHl表達載體pCEP4-Her VH- CHl-Nn
[0070] 利用表3中引物分別克隆編碼化rceptin重鏈VH-CHl部分的基因W及化U化aE的N 端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max進行擴增，PCR條件為94°C IOs，55° ClOs，72°C 10s，30個循環(huán)，將得到的片段瓊脂糖凝膠電泳回收后利用重疊PCR將編碼化rceptin重鏈 VH-CHl部分的基因與編碼化U DnaE的N端基因化U化址的N端在融合多膚C端的順序合成， PCR條件為94°C IOs，55 °C IOs，72 °C IOs，30個循環(huán)，將此基因片段用HindII I和BamHI處理，并 與同樣經(jīng)過化ndn I和BamHI處理的pCEP4進行連接，質粒結構圖7如圖所示。
[0071] 將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于含50iig/mL氨節(jié)西 林的瓊脂平板培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的單克隆，于5mL含50yg/mL氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基 中震蕩培養(yǎng)過夜，并提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所構建的化r VH-CHl-Nn序列 正確。
[0072] 表 3
[0073]
[0074] 2、構建Herceptin輕鏈的表達載體pCEP4-Her LC
[00對利用表4中引物分別克隆編碼Hercept in輕鏈的基因，采用TaKaRa公司的 PrimerStar Max進行擴增，PCR條件為94°C IOs，55°C IOs，72°C IOs，30個循環(huán)，將得到的片段 瓊脂糖凝膠電泳回收后用HindHI和BamHI處理，并與同樣經(jīng)過化ndIII和BamHI處理的 PCEP4進行連接，質粒結構圖7如圖所示。
[0076]將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于含50iig/mL氨節(jié)西 林的瓊脂平板培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的單克隆，于5mL含50yg/mL氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基 中震蕩培養(yǎng)過夜，并提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所構建的化r LC序列正確。 [0077]表 4 [007引
[0079] 3、融合多膚化r Fab-化的表達與純化
[0080] 本實施例中利用HEK293-E系統(tǒng)中的瞬時表達系統(tǒng)表達融合多膚化r Fab-化。
[0081 ]用SFM4皿K293培養(yǎng)基化yClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基（Gibco)Wl = I的 比例，添加10化g/ml遺傳霉素(geneticinKGibco)培養(yǎng)皿K293-E細胞(表達邸病毒核抗原 的人胚腎細胞系293;美國典型培養(yǎng)物中屯、，保藏號ATCC#C化-10852，Lot.959218)，轉染前 一天用新鮮培養(yǎng)基將細胞稀釋至1.5-2.5 X IO6個細胞/ml，W37°C，120巧m，5%C02培養(yǎng)，W 待次日轉染。
[0082] 轉染當日，按照每106個細胞用0.化g DNA的用量，等質量比混合PCEP4-化r VH- CHl-化和pCEP4-Her LC，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至（40ngAiL)，DNA:PEI = 1:3加入混勻的DNA中室溫解育20min備用。同時1000巧m 5min離屯、收集細胞，經(jīng)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗涂細胞1次，1000 rpm 5min離屯、收集細胞，用150ml Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細胞至細胞密度為4 X IO6個細胞/ml置于新的IL搖瓶(Coming) 中。
[0083] 將解育的DNA-PEI復合物加入細胞中，37°C，110巧m，5%C02轉染4小時，隨后加入 等體積預熱的SFX4皿K293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticinKGibco)繼續(xù)37°C， 13化pm，5 % C02培養(yǎng)10天。直接收集上清純化或者收集上清-80°C冷凍保存。
[0084] 所收集的上清用PBS(20mMPBS，150mM化Cl，pH6.8-7.4)l:l混合，上到預先用 PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用5倍柱體積的PBS洗涂，用P冊.0 的IOOmM巧樣酸緩沖液洗除去雜組份，用pH3.0的IOOmM巧樣酸緩洗脫抗體，用PH9.0的IM tris-Hcl緩沖液立即中和收集到的洗脫樣品。
[00化]取小樣進行SDS-PAGG分析，非還原樣品60邸左右出現(xiàn)組裝好的化r化b-Nn，還原 樣品中出現(xiàn)35KD的VH+CH1+化鏈和25KD的輕鏈。圖4為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的 方法的實施例2中用SDS-PAGE檢測經(jīng)過Protein L層析柱純化的融合蛋白化b-Nn的結果示 意圖。
[0086] 合并含有目的蛋白的樣品，W用于下一步斷裂intein介導的體外剪接。如果需要， 利用MIliJPORE Amicon叫tra(30MWC0)超濾離屯、管濃縮，冷凍和在-20°C或-80°C保存。
[0087] 4、利用化U DnaE反式剪接制備Her Fab-PE38KDEL
[0088] 將實施例1中所述步驟2得到之融合多膚化-陽38K呢L與步驟3得到的融合多膚化r 化b-化W摩爾比I: I進行混合，并加入終濃度為ImM的DTT，于25°C下保溫60min，取樣品進行 SDS-PAGEW及Western Blot檢測。圖5為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法的實施 例2中用SDS-PAGE檢測化b-化與化-PE38K呢L反式剪接生成化b-PE38K呢L的結果示意圖。
[0089] 5、經(jīng)由化U化aE反式剪接產(chǎn)生的化r Fab-PE38K呢L的分離純化
[0090] 利用Ni2^NTA捕獲步驟4中未發(fā)生反式剪接反應的融合多膚W及反式剪接所產(chǎn)生的 副產(chǎn)物來純化化r化b-PE38KDEL。
[0091] 裝填Ni2+重力柱，柱床體積1ml，用5倍柱體積水洗之后用10倍柱體積結合緩沖液 (20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，將步驟4得到的反應體系上柱，流速為Iml/ min,收集流穿，上柱完畢后，用5倍柱體積包含40mM咪挫的洗脫緩沖液（20mM PBS、500mM NaCl、40mM咪挫、pH7.5)沖洗，收集沖洗液，隨后用10倍柱體積包含150mM咪挫的洗脫緩沖液 (20mM PBS、500ml化Cl、150mM咪挫、pH7.5)沖洗，SDS-PAGE檢測收集的蛋白樣品，依需要， 可冷凍和在-20°C或-80°C保存，或者用于更高純度的純化，例如離子交換層析，疏水層析， W及分子排阻層析等。
[009。實施例3、利用化U DnaE的反式剪接功能制備免疫毒素!Ierceptin-PE38KDEL
[0093] 1、構建融合了斷裂內含膚化U DnaE N端的化r肥表達載體pCEP4-Her肥-Nn
[0094] 利用下表5引物，W合成的包含編碼信號膚基因的化rceptin重鏈核酸分子為模板 利用表中引物克隆編碼化rceptin重鏈的基因W合成的包含化U DnaE的核酸分子為模板， 克隆化U Dn址的N端基因，采用TaKaRa公司的PrimerStar Max進行擴增，PCR條件為94°C 1〇3,55°(：1〇3,72°(：1〇3,30個循環(huán)，將得到的片段瓊脂糖凝膠電泳回收后利用重疊?(：時尋編 碼化rceptin重鏈的基因與編碼化U化址的N端基因化U DnaE的N端在融合多膚C端的順序 合成，PCR條件為94°(：1〇3,55°(：1〇3,72°(：1〇3,30個循環(huán)，將此基因片段用些旦(111巧郵曰抽11處 理，并與同樣經(jīng)過化ndn I和BamHI處理的PCEP4進行連接，質粒結構圖如圖7所示。
[00M]將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于含50iig/mL氨節(jié)西 林的瓊脂平板培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的單克隆，于5mL含50yg/mL氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基 中震蕩培養(yǎng)過夜，并提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所構建的化r HC-化序列正確。
[0096] 表 5
[0097]
[0098] 2、融合多膚化rceptin-化的表達與純化
[0099] 本實施例中利用HEK293-E系統(tǒng)中的瞬時表達系統(tǒng)表達融合膚化rceptin-化。
[0100] 用SFX4皿K293培養(yǎng)基化yClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基（Gibco)Wl = I的 比例，添加10化g/ml遺傳霉素(geneticinKGibco)培養(yǎng)皿K293-E細胞(表達邸病毒核抗原 的人胚腎細胞系293;美國典型培養(yǎng)物中屯、，保藏號ATCC#C化-10852，Lot.959218)，轉染前 一天用新鮮培養(yǎng)基將細胞稀釋至1.5-2.5 X IO6個細胞/ml，W37°C，120巧m，5%C〇2培養(yǎng)，W 待次日轉染。
[0101] 轉染當日，按照每IO6個細胞用0.扣g DNA的用量，等質量比混合PCEP4-化r肥-Nn 和實施例3步驟2中構建的Herceptin輕鏈表達載體pCEP4-Her LC，用Gibco Freestyle293 培養(yǎng)基稀釋DNA至（40叫/化），0麻:？61 = 1:3加入混勻的0麻中室溫解育20111111備用。同時 1000 rpm離屯、5min收集細胞，經(jīng)Gibco FYeestyle 293培養(yǎng)基洗涂細胞1次，1000 rpm離屯、 5min收集細胞，用150ml G化CO Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細胞至細胞密度為4 X IO6個細 胞/ml置于新的IL搖瓶(Coming)中。
[0102] 將解育的DNA-PEI復合物加入細胞中，37°C，110rpm，5%C02轉染4小時，隨后加入 等體積預熱的SFX4皿K293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticinKGibco)繼續(xù)37°C， 130 巧m，5%C02 培養(yǎng) 10 天。
[0103] 直接收集上清純化或者收集上清-8(TC冷凍保存。
[0104] 所收集的上清用PBS(20mMPBS，150mM化Cl，pH6.8-7.4)l:l混合，上到預先用 PBS平衡完畢的Protein A(蛋白A)親和層析柱，上樣完畢用10倍柱體積的PBS洗涂，用抑3.0 的IOOmM巧樣酸緩沖液洗脫抗體，用抑9.0的IM化is-Hcl緩沖液立即中和收集到的洗脫樣 品。取小樣進行SDS-PAGG分析，非還原樣品于170kD左右出現(xiàn)組裝好的Herceptin-Nn,還原 樣品中出現(xiàn)約70kD的化r HC-Nn鏈和25KD的輕鏈。合并含有目的蛋白的樣品，W用于下一步 斷裂intein介導的體外剪接。如果需要，利用M比LIPORE Amicon叫tra(30MWC0)超濾離屯、 管濃縮，冷凍和在-20°C或-80°C保存。
[01化]3、利用化U DnaE反式剪接制備Herceptin-PE38KDEL
[0106] 將實施例1中所述步驟2得到之融合多膚NC-PE38KD化與步驟3得到的融合多膚 Here邱t in-Nn W摩爾比1:1進行混合，并加入終濃度為ImM的DTT，于25 °C下保溫60min，取樣 品進行SDS-PAGEW及Western Blot檢測。圖6為本發(fā)明的利用內含膚制備免疫毒素的方法 的實施例3用Western Blot檢測Herceptin-Nn與NC-PE38KDEL反式剪接生成Herceptin- 陽38K呢L的結果示意圖。
[0107] 4、經(jīng)由化U DnaE反式剪接產(chǎn)生的Herceptin-PE38K呢L的分離純化
[0108] 利用Ni2^NTA捕獲步驟3中未發(fā)生反式剪接反應的融合多膚W及反式剪接所產(chǎn)生的 副產(chǎn)物來純化化rceptin-陽38KD化。裝填Ni2+重力柱，柱床體積1ml，用5倍柱體積水洗之后 用10倍柱體積結合緩沖液(20mM PBS、SOOmM化Cl、20mM咪挫、pH7.5)平衡，將步驟3得到的 反應體系上柱，流速為Iml/min，收集流穿，上柱完畢后，用5倍柱體積包含40mM咪挫的洗脫 緩沖液(20mM PBS、SOOmM NaCl、40mM咪挫、pH7.5)沖洗，收集沖洗液，隨后用10倍柱體積包 含150mM咪挫的洗脫緩沖液(20mM PBS、500mM NaCl、150mM咪挫、pH7.5)沖洗，SDS-PAGE檢測 收集的蛋白樣品，依需要，可冷凍和在-20° C或-8(TC保存，或者用于更高純度的純化，例如 離子交換層析，疏水層析，W及分子排阻層析等。
[0109] 可見，本發(fā)明的方法則克服了在免疫毒素生產(chǎn)的傳統(tǒng)策略中存在的不足，實現(xiàn)了 改善了傳統(tǒng)生產(chǎn)免疫毒素的技術方法中存在諸多不足之處，如化學偶聯(lián)法中需要加入化學 試劑，由于導向多膚部分中修飾位點較多而導致的產(chǎn)品不均一，同時化學偶聯(lián)鍵容易斷裂 而導致毒性滲漏等;而直接表達免疫毒素融合蛋白的策略中，若采用原核表達系統(tǒng)，則目的 蛋白往往W包涵體形式存在，復性效率低且步驟繁瑣過程復雜，若采用真核表達系統(tǒng)則免 疫毒素的表達可能受限于其對宿主細胞存在的天然毒性。本發(fā)明的方法改善了現(xiàn)有技術的 不足：1、本發(fā)明的方法只需要制備不同的導向部分多膚W及毒性部分多膚，就可W將其進 行組合，進而產(chǎn)生可W針對不同祀點及擁有不同毒性機制的免疫毒素，具有顯著的多樣性 及靈活性;2、本發(fā)明的方法中，導向部分多膚和毒性部分多膚可W在適當?shù)乃拗骷毎蟹?開表達，如需要特殊的折疊環(huán)境，特別是高級的翻譯后修飾，可W在哺乳動物細胞中進行表 達，而沒有太多修飾需求的多膚可W在大腸桿菌中進行表達，在適合的表達系統(tǒng)中分別表 達目的多膚可W獲得較高的產(chǎn)量、收率W及純度;3、本發(fā)明的方法中，導向部分多膚和毒素 部分多膚的連接是位點特異性的，不會生產(chǎn)副產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物產(chǎn)品均一性高;4、本發(fā)明的 方法中，導向性部分多膚和毒素部分多膚經(jīng)由內含膚的自剪接，是有膚鍵連接在一起，相比 于化學偶聯(lián)法等連接方式具有良好的穩(wěn)定性;5、本發(fā)明的方法中，自剪接反應條件溫和、反 應高效，易于與其他工藝進行整合、放大;反應過程無需加入有毒有害作用物質。
[0110] W上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實施方式，本領域技術人員可W在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，運并不影 響本發(fā)明的實質內容。
【主權項】
1. 一種基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 步驟一，構建表達免疫毒素中具有導向功能的多肽和具有毒性功能的多肽的載體DNA 片段，將所述兩種多肽的載體DNA片段與內含肽的N端或C端分別連接，形成融合表達載體； 其中，所述含有內含肽N端的融合表達載體與含有內含肽C端的融合表達載體所表達的多肽 需成對存在，以使得反式剪接反應能夠發(fā)生； 步驟二，取步驟一所述的融合表達載體，分別在合適的宿主細胞中進行表達，得到融合 內含肽N端的融合多肽A以及融合內含肽C端的融合多肽B; 步驟三，取融合多肽A和融合多肽B，混合，在內含肽對應的反式剪接條件下，誘導免疫 毒素的導向功能的多肽以及具有毒性功能的多肽部分進行反式剪接，得到免疫毒素。2. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟一 中，所述內含肽為人工斷裂內含肽、或天然斷裂內含肽，或具有剪接功能的內含肽突變體。3. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟一 中，所述內含肽為Ssp DnaB、Ssp DnaE或Npu DnaE04. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟一 中，所述內含肽N端的C末端或C端的N末端還融合有功能性多肽。5. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，所述功能 性多肽為MBP或ChBD標簽蛋白。6. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟一 中，所述融合表達載體的構成為導向功能多肽-內含肽N端、或內含肽C端-毒性功能多肽，或 毒性功能多肽-內含肽N端、或內含肽C端-導向功能多肽，或導向功能多肽-內含肽N端-功能 多肽、或功能多肽-內含肽C端-毒性功能多肽，或毒性功能多肽-內含肽N端-功能多肽、功能 多肽-內含肽C端-導向功能多肽。7. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟一 中，所述具有導向功能的多肽為抗體、單鏈抗體scFv、二硫鍵穩(wěn)定抗體dsFv、二硫鍵穩(wěn)定單 鏈抗體dsscFv、Fab抗體、細胞因子、或生長因子。8. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟一 中，所述具有毒性功能的多肽為RIP型毒素;具體為蓖麻毒素、ADP核糖基化免疫毒素，白喉 毒素、或綠膿桿菌外毒素部分的融合蛋白，或具有毒素生物活性的突變體。9. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟二 中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。10. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，所述宿 主細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、高擴酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、酵 母、中國倉鼠卵巢細胞、或人腎胚細胞。11. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟三 中，還包括分離純化進而獲得免疫毒素的步驟。12. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，所述分 離純化的方法為親和層析方法、離子交換層析方法、或疏水作用層析方法。13. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，步驟三 中，所述反式剪接條件為能夠觸發(fā)指定內含肽完成自剪接的條件。14. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，當內含 肽為Npu DnaE時，反式剪接條件為:0-55°C，pH為3-11，接觸時間Is-60h，終濃度為0.05mM-IOOmM的親核試劑。15. 根據(jù)權利要求1所述的基于內含肽的藥用重組蛋白的合成方法，其特征是，所述親 核試劑為DTT，DTE，CYSTEINE，TCEP，或MESNA親核性試劑。
【文檔編號】C12N15/62GK105925596SQ201610099711
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年2月23日
【發(fā)明人】陳俊生, 朱建偉, 韓雷, 丁凱, 謝躍慶, 江華, 路慧麗, 張寶紅, 張蕾
【申請人】上海交通大學, 美國杰科實驗室有限公司, 杰科（天津）生物醫(yī)藥有限公司