專利名稱：一種新的l-山梨酮脫氫酶的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了ー種新L-山梨酮脫氫酶基因及其編碼蛋白質(zhì)，特別是ー種全新的L-山梨酮脫氫酶基因。
背景技術(shù)：
維生素C，又稱抗壞血酸，作為人體必需的一種維生素和抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于制 藥、食品、飲料、化妝品和飼料等エ業(yè)中，2-KLG是合成維生素C的重要前體。最早實(shí)現(xiàn)維生素Cエ業(yè)化生產(chǎn)的エ藝是德國(guó)Reichstein于1934年發(fā)明的所謂“萊氏法”，包括五步化學(xué)反應(yīng)和一歩生物轉(zhuǎn)化將葡萄糖轉(zhuǎn)化為2-KLG，再經(jīng)酯化生成維生素C。但該法存在能耗高、消耗大量有機(jī)溶劑、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，與“萊氏法”相比，尹光琳等發(fā)明的ニ步發(fā)酵法具有エ藝流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。在這ー過(guò)程中，氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)轉(zhuǎn)化D-山梨醇為L(zhǎng)-山梨糖，L-山梨糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的過(guò)程是由ー個(gè)混菌系統(tǒng)完成的，這ー混菌發(fā)酵系統(tǒng)由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium,俗稱大菌)和普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗稱小菌)組成,其中K. vulgare為產(chǎn)酸菌,單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)微弱，產(chǎn)酸較少；B. megaterium為伴生菌,不產(chǎn)酸,但促進(jìn)K. vulgare生長(zhǎng)或產(chǎn)酸。Ketogulonigenium sp.是Urbance等人與2001年定義的一個(gè)新屬，其分類學(xué)位置為變形菌門(Proteobacteria), α -亞綱(Alpha proteobacteria),紅細(xì)菌目(Rhodobacterales),紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)。在變形菌門中，已經(jīng)有954株微生物進(jìn)行了基因組序列測(cè)定。在K. vulgare所在的紅細(xì)菌科中已有34株微生物進(jìn)行了基因組序列測(cè)定并公布，主要包括紅細(xì)菌屬(8株)、Rueqeria屬(8株)、玫瑰桿菌屬(8株)，這些測(cè)序的結(jié)果將會(huì)在進(jìn)化關(guān)系分析及代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中以江蘇江山制藥有限公司提供的維生素Cエ業(yè)生產(chǎn)菌株K. vulgareWSH-OOl為研究対象，利用焦磷酸測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的454GS FLX高通量測(cè)序法結(jié)合傳統(tǒng)的Sanger shotgun測(cè)序技術(shù)進(jìn)行序列測(cè)定，得到一種新的山梨酮脫氫酶基因，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，為一種新的分子。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供ー種L-山梨酮脫氫酶基因，可以用來(lái)構(gòu)建高產(chǎn)2-KLG的工程菌，簡(jiǎn)化維生素C的生產(chǎn)エ藝。所述L-山梨酮脫氫酶基因，核苷酸序列如以下I)或2)所示I)其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示核苷酸序列；2)在I)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具L-山梨酮脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。含有L-山梨酮脫氫酶基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或基因工程菌也屬于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。含有L-山梨酮脫氫酶基因的表達(dá)載體或克隆載體也屬于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。利用本發(fā)發(fā)明提供的基因構(gòu)建基因工程菌的方法為I)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)K. vulgare WSH-001的全基因組測(cè)序結(jié)果中注釋的sndh序列設(shè)計(jì)引物克隆sndh ；2)將sndh與pET28a(+)質(zhì)粒連接得到重組表達(dá)載體；3)將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21后得到重組菌
株。 下面是本發(fā)明技術(shù)方案的具體描述質(zhì)粒及重組菌的構(gòu)建將本實(shí)驗(yàn)室對(duì)K. vulgare WSH-001的全基因組測(cè)序結(jié)果中注釋的sndh序列擴(kuò)增后連接到克隆載體PMD19-T vector上，將構(gòu)建好的克隆載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落 PCR (PCR 引物 5’ -3’ : GGAATTCCATATGAGCGTTCTGGCCAAATTCACTTC;CCCAAGCTTTTACGCAGCGGAAATCCGCC,下同)，驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(含有 1290bp 條帶)，證明pMD19-T-sndh已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到E. coli中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒測(cè)序，將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后回收sndh片段連接到質(zhì)粒pET28a(+)上構(gòu)建表達(dá)載體，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(含有1290bp條帯)，證明sndh基因已經(jīng)連接到pET28a(+)上并被轉(zhuǎn)化到E. coli中；將提取的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli BL21 (DE3)，得到重組菌 E. coli-pET28a_sndh。重組菌Ε· coli-pET28a-sdh/sndh的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定固體培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化鈉10 ;瓊脂20，pH 7. 0，121° C滅菌15min,卡那霉素終濃度50 μ g/mL。LB培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化鈉10 ;pH 7.0,121° C滅菌15min。TB培養(yǎng)基蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸ニ氫鉀2. 31，磷酸氫ニ鉀12. 54，pH 7. 0,121。C 滅菌 15min，卡那霉素終濃度 50 μ g/mL，IPTG 終濃度 O. 5mM。培養(yǎng)條件從平板中接種重組菌于25mL的LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，接種量10%,裝液量10%，誘導(dǎo)前菌體OD6tltl值為O. 6，添加IPTG至終濃度O. 5mM,于30°C、220rpm進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間20h。發(fā)酵結(jié)束后取IOD的菌液離心，以O(shè). IM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次菌體，然后加入O. 5mL磷酸鹽緩沖液超聲波破壁處理，將全細(xì)胞、破壁上清及破壁沉淀進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。分析山梨酮脫氫酶活性的基本反應(yīng)液由以下組成3ml O. IM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0，含 O. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP，4. 95ml 的蒸餾水，在測(cè)量之前準(zhǔn)備好。取0. ImL破壁后粗酶液加入10 μ L的輔酶吡咯喹啉醌(PQQ)30°C孵育lOmin。采用可控溫、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)吸光度的分光光度計(jì)，用光程0. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反應(yīng)液，0. Iml濃度為IM的こニ醛溶液(因?yàn)樯嚼嫱环€(wěn)定，根據(jù)文獻(xiàn)采用こニ醛代替)，混合后30°C預(yù)熱5min，加入經(jīng)孵育后的酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。一個(gè)酶活単位定義為Imin內(nèi)Iumol DCIP被催化還原所需的酶量。DCIP在600nm處的摩爾消光系數(shù)為I. 91 X IO4L.mo I οL-山梨酮脫氫酶Km值的測(cè)定
配制不同濃度的こニ醛溶液，分別為O. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M，按上述酶活測(cè)定的檢測(cè)方法，分別求出每個(gè)こニ醛濃度下線性范圍內(nèi)的斜率k，按V= (kX60)/I. 91 X 104(單位mol.じ1. mirT1)求出反應(yīng)的初速度V,以初速度的倒數(shù)IVvi對(duì)こニ醒的濃度倒數(shù)1/[S]作圖得一直線，求出米氏常數(shù)Km值。實(shí)驗(yàn)證明此酶促反應(yīng)光吸收-時(shí)間曲線前40s基本呈直線關(guān)系，因此試驗(yàn)中可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在前40s內(nèi)的平均速度來(lái)代替反應(yīng)初速度V。L-山梨酮脫氫酶的體外催化作用取50D菌液離心后用pH 7. O磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，再重懸于O. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁，離心后得到粗酶液，各取O. ImL L-山梨糖/山梨酮脫氫酶(本研究中發(fā)現(xiàn))和L-山梨酮脫氫酶的粗酶液混勻，加入10 μ L PQQ在30°C下孵育lOmin，再將O. 2mL濃度為IM的L-山梨糖、O. 7mL上述基本反應(yīng)液在30°C下預(yù)熱5min，然后加入酶液立即混 勻，30°C保溫15min后用O. lmL50%的三氯こ酸終止酶促反應(yīng)，反應(yīng)液以O(shè). 45 μ m濾膜過(guò)濾后進(jìn)行液相檢測(cè)Agilent IlOOsystem, RioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱；流動(dòng)相2. 75 μ mo I/L濃硫酸；柱溫35° C ;流速0. 6mL/min ;進(jìn)樣量5 μ L ;檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器。山梨糖脫氫酶及山梨酮脫氫酶在維生素Cエ業(yè)化生產(chǎn)中具有重要價(jià)值，因此編碼此酶的新的基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于維生素C生產(chǎn)エ藝的改進(jìn)及用于維生素C重組菌的構(gòu)建具有重要的意義與價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I表達(dá)載體的構(gòu)建將本實(shí)驗(yàn)室對(duì)K. vulgare WSH-001的全基因組測(cè)序結(jié)果中注釋的sndh基因序列擴(kuò)增后連接到克隆載體PMD19-T vector上，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，經(jīng)過(guò)抗生素篩選轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒測(cè)序，將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind III及Nde I雙酶切回收sndh基因片段連接到同樣經(jīng)Hind III及Nde
I雙酶切的pET28a(+)載體上，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a(+)-sndh，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，經(jīng)抗生素篩選轉(zhuǎn)化子并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind III及Nde I雙酶切后出現(xiàn)1290bp的條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建表達(dá)載體pET28a(+)-sndh;將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌E.coli-pET28a_sndh0實(shí)施例2L-山梨酮脫氫酶的表達(dá)及其酶活測(cè)定將E. coli-pET28a-sndh及對(duì)照E. coli_pET28a分別接種于TB培養(yǎng)基中，ー組ー直培養(yǎng)至結(jié)束，另ー組當(dāng)0D_達(dá)到0. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0. 5mM誘導(dǎo)L-山梨酮脫氫酶的表達(dá)，培養(yǎng)20h后分別取10D的菌液12000rpm離心5min，以0. IM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，然后重懸于0. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁處理20min，將全細(xì)胞、破壁上清及破壁沉淀分別進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，與E. coli-pET28a對(duì)照，重組菌E. coli-pET28a-sndh出現(xiàn)一條分子量約為43kD的蛋白條帶。分析山梨酮脫氫酶活性的基本反應(yīng)液由以下組成3ml 0. IM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0，含 0. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸餾水，在測(cè)量之前準(zhǔn)備好。取O. ImL破壁后粗酶液加入IOyL的PQQ在30°C孵育lOmin。采用可控溫、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)吸光度的分光光度計(jì)，用光程O. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反應(yīng)液，O. Iml濃度為IM的こニ醒溶液,混合后30°C預(yù)熱5min,加入經(jīng)孵育后的酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),檢測(cè)反應(yīng)液在波長(zhǎng)600nm處實(shí)時(shí)的吸光度值，以一定線性范圍時(shí)間內(nèi)反應(yīng)液的吸光度變化斜率計(jì)算L-山梨酮脫氫酶酶活，計(jì)算此山梨酮脫氫酶的酶活為226. 8±7. 4U，一個(gè)酶活単位定義為Imin內(nèi)Ιμπιο DCIP被催化還原所需的酶量。DCIP在600nm處的摩爾消光系數(shù)為I. 91 X IO4L.mo I ο實(shí)施例3L-山梨酮脫氫酶的米氏常數(shù)Km值的測(cè)定
分別配制濃度為O. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M的こニ醛溶液，按上述酶活測(cè)定的檢測(cè)方法，分別在各個(gè)こニ醛的濃度下檢測(cè)反應(yīng)液的OD6tltl實(shí)時(shí)變化值，然后分別求出每個(gè)こニ醛濃度下線性范圍內(nèi)的斜率k，按V= (kX60)/1. 91 XlO4(單位mol.じ1. mirT1)求出反應(yīng)的初速度V，以初速度的倒數(shù)Ι/Vi對(duì)こニ醛的濃度倒數(shù)1/[S]作圖得一直線，求出此山梨酮脫氫酶米氏常數(shù)Km值為O. 09±0. Olmol/L。實(shí)驗(yàn)證明此酶促反應(yīng)光吸收-時(shí)間曲線前40s基本呈直線關(guān)系，因此實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在前40s內(nèi)的平均速度來(lái)代替反應(yīng)初速度V。實(shí)施例4L-山梨酮脫氫酶的體外催化作用取50D菌液12000rpm離心5min后以pH 7. O磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，再重懸于0. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁20min，離心后得到粗酶液，各取0. ImL L-山梨糖/山梨酮脫氫酶(KVU 0203，本研究中發(fā)現(xiàn))和L-山梨酮脫氫酶的粗酶液混勻，加入10 μ L PQQ在30°C下孵育lOmin，再將0. ImL濃度為IM的こニ醛、0. 4mL上述基本反應(yīng)液在30°C下預(yù)熱5min，然后加入酶液立即混勻，30°C保溫15min后用0. lmL50%的三氯こ酸終止酶促反應(yīng)，反應(yīng)液以0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后進(jìn)行液相檢測(cè)Agilent IlOOsystem, RioRad公司AminexHPX-87H色譜柱；流動(dòng)相2. 75ymol/L濃硫酸；柱溫:35。C ;流速0. 6mL/min ;進(jìn)樣量5μ L ;檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器。通過(guò)液相結(jié)果計(jì)算得消耗L-山梨糖4. 19±0. 2g.じ1，2-KLG濃度為3. 89±0. Ig.じ1，L-山梨糖的消耗速率為15.6±0. 6/g(L. h)—1，分別比L-山梨糖/山梨酮脫氫酶單獨(dú)作用高出12. 0%、12. 1%，12. 3%。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種新的L-山梨酮脫氫酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示 1)其核苷酸序列為SEQID NO. I所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有L-山梨酮脫氫酶活性的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求I所述基因編碼的蛋白質(zhì)。
3.含有權(quán)利要求I所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4.含有權(quán)利要求I所述基因的基因工程菌。
5.含有權(quán)利要求I所述基因的表達(dá)載體或克隆載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的L-山梨酮脫氫酶基因，該基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，DCIP法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物具有酶活性，且具有山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶雙功能作用，可用于將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，并且可與本研究中的L-山梨酮脫氫酶協(xié)同進(jìn)行由L-山梨糖至2-KLG的轉(zhuǎn)化。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102676552SQ20121016855
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者劉杰, 周景文, 堵國(guó)成, 陳堅(jiān), 高麗麗 申請(qǐng)人:江南大學(xué)