山核桃miR169在提前植物花期中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了山核桃miR169在提前植物花期中的應用。應用山核桃miR169，有望調(diào)控山核桃的花期，使得山核桃童期縮短，提前開花，結實。
【專利說明】
山核桃m i R169在提前植物花期中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及基因功能領域，更具體地設及山核桃miR169在提前植物花期中的應 用。
【背景技術】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于動植物中，含有莖環(huán)結構的miRNA前體，經(jīng)過 Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子(18-25個核巧酸）DmiRNA通過在轉錄水平或者轉 錄后水平對基因組上的祀基因抑制其翻譯或者切割祀基因來調(diào)控基因表達，在基因表達中 起負調(diào)控其祀基因作用。miRNA在植物從成花誘導到花器官特征屬性形成的整個花發(fā)育過 程均發(fā)揮著關鍵作用。
[0003] miR169是一種廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中的miRNA。在擬南芥中， miR169的祀基因為NF-Y家族成員，通過抑制NF-YA基因轉錄來調(diào)控脅迫應答，同時miR169過 表達促進擬南芥提前開花。通過Solexa測序發(fā)現(xiàn)，miR169在山核桃營養(yǎng)生長階段表達量為 1.12，在生殖生長階段的表達量為8.26，生殖生長是營養(yǎng)生長表達量的7.3倍，表明miR169 與花發(fā)育存在一定的關系。為了研究miR169的功能，通過轉山核桃miR169基因，探索其在植 物發(fā)育中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供山核桃miR169在提前植物花期中的應用。
[0005] 本發(fā)明提供了山核桃miR169在提前植物花期中的應用，所述山核桃miR169的堿基 序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0006] 在一個實施例中，所述植物是擬南芥或煙草。
[0007] 在一個實施例中，所述植物是擬南芥。
[000引在一個實施例中，獲得山核桃miR169轉基因植株的具體方法包括:將包含所述山 核桃miR169的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導轉化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉 基因株系。
[0009] 由于山核桃miR169本身序列很短(GGCAGTCTCCTTGGCTAATC)，只有20bp，而前體序 列相對較長，連接到載體上，有利于轉化實現(xiàn)，優(yōu)選地，所述前體基因的堿基序列如 SEQIDN0.2 所示。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點在于，應用山核桃miR169,有望調(diào)控山核桃的花期，使得山核桃童期 縮短，提前開花，結實。
【附圖說明】
[OOW 圖巧為山核桃花芽的總RNA;
[0012] 圖2為山核桃miR169前體的表達載體菌液PCR檢測；
[0013] 圖3為山核桃miR169轉基因擬南芥植株的抗性篩選；
[0014]圖4為野生型(WT)和山核桃miR169轉基因擬南芥的葉片數(shù)目統(tǒng)計；
[001引圖5為觀察到的野生型(WT)和山核桃miR169轉基因擬南芥的表型。
【具體實施方式】
[0016] 1.材料
[0017] 1.1實驗材料
[0018] 山核桃雌花芽、根、莖、葉、果實均采自浙江省杭州市臨安板橋村，選取同一株山核 桃樹進行采樣。樣品采下后立即液氮保存，帶回實驗室并放置在-8(TC冰箱保存待用。擬南 芥種子使用哥倫比亞生態(tài)型(Columbia-O)。
[0019] 1.2實驗試劑與儀器
[0020] DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Marker和TRIzol試劑均購自寶生物工 程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限 公司。PCR儀為美國PE9700 PCR儀，超凈工作臺購自蘇州誠凈凈化科技有限公司。
[0021] 1.3引物合成及測序
[0022] 引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0023] 2.方法
[0024] 2.1山核桃花芽總RNA的提取
[00巧]采用改良CTAB+Trizol法提取花芽樣品總RNA，步驟如下：
[0026] (1)在IOmL離屯、管中加入3血65°C預熱的CTAB提取緩沖液（10%CTAB，10%PVP40， 1.OM Tris-HCKpH 8.0),51 NaCl,0.6M EDTA(抑 8.0))，加入200化 0-琉基乙醇；
[0027] (2)取-70°C保存的花芽2g，放入液氮充分預冷的研鉢中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[002引（3)將白色粉末迅速轉入預熱的提取液中，立即充分振蕩混勻，65°C水浴30min，期 間振蕩3-4次；
[0029] (4)在混合物中加入等體積的25:24:1(酸性飽和酪:氯仿:異戊醇），約3ml。混合均 勻后14000巧m離屯、IOmin(常溫）；
[0030] (5)取上清轉入新的IOml離屯、管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)上下顛倒混 勻，12000巧m 4°C離屯、IOmin后取上清；
[0031 ] (6)重復步驟4 一次，直至中間層消失；
[0032] (7)上清轉移至1.5mL離屯、管中，加入等體積的異丙醇后放置于-2(TC冰箱冷凍 30minJ2000巧m 4°C離屯、IOmin棄掉上清，沉淀加入65°C預熱好的SSTE 400化溶液至全溶；
[0033] (8)溶液中加入ImL TRIzol試劑，室溫靜置5min。再加入2(K)化氯仿?lián)u勻，室溫靜置 2-3min;
[0034] (9)4。(：12000巧111離屯、15111111;
[0035] (10)吸取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置IOmin;
[0036] (11 )4°C 12000巧m離屯、IOmin，棄掉上清，肉眼可見RNA沉于管底；
[0037] (12)加入1血預冷的75%乙醇洗涂沉淀，溫和振蕩，800化pm 4°C離屯、5min，棄掉上 清；
[0038] (13)重復步驟11，并將沉淀真空干燥7-lOmin;加入適量DEPC水溶解沉淀，-80°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0039] 2.2 cDNA合成
[0040] 使用TAKARA試劑盒Prime ScriptTME 1st Strand cDNA Synthesis Kit,詳細內(nèi) 容如下：
[0041 ] (I)在經(jīng)過DEPC處理過的PCR管中配置下列反應體系： Ol i go dT 巧i mei* (前 W 娘 1 H L dNTP MixturedO iiM each) 1 L
[0042] 模城RM T州al臟U日P g臥下) RNase free 也0 LJp tolO ix L
[0043] (2)65它保溫5min，冰上迅速冷卻。（模板RNA變性）
[0044] (3)再次配置反應體系如下： 上述變性后反應液 .1.日iiL 5 X 化iiT腳-Script Buffer 4 P L
[0045] RNa洗 Inh化itQr(:40U/W L) 0.5 UL Pri隨茲億ript RTa色e 巧0 U/'nL) 1 w L
[0046] 區(qū)扼I留'e '掙芭e孤Z-O 'Up樹撕W'L
[0047] (4)緩慢搖勻。
[004引（5)42°C反應30-60min。
[0049] (6) 95 °C 5min酶失活后，冰上冷卻。
[0050] 2.3前體序列的引物設計 [0051 ]依據(jù)前體序列：
[0化2] TCTTGTATGCAAAAATAAATATATATAGTAGTGTTCATGATGAGGGATGTTCAGACGTTGCAGTTCGAAGAAGAGAA GACCTGGCATGAGAATGAAGAGACTGTAAGATTAGCCAAGGAGACTGCCTACGAATCACAGAAAGAGTTTCTAGGGA TCCAAACACACAAAACTACTAATTATATCTTGAAGCCGCTTGGAGGAGCAGGCAAGTCATCCTTGGCTACCAAACAA AGACTCTTATCCTCATGATAGATCTCTCCTCTCAAAAATATATTTCCTTA，使用Primer Primer 日.0設計 引物，引物兩端分別加上酶切位點Kpn巧肋bal，正向引物:5' -GGGGTACCGATGAGGGATGTTCAGA CGT-3，反向引物:5 ' -GCTCTAGATTGTTTGGTAGCCAAGGATG-3 '，克隆所需序列。
[0053] 2.4 PCR擴增反應
[0054] W山核桃CDNA為模板擴增，反應體系如下： 細做(lOOng/uD 2 化 上游引物SI 0>& H L 下游引物S2 化B WL IOXPCR buf抬r CM'g&'plus) 2 w L
[0化5] dNTP 1. 6 W L MgcI2 L2 P丄 rTaq聚合酶 化2 V L 加也(） 11. 4 WL
[0056] PCR 反應條件為：94°C 預變性 5min，94°C 變性 3〇8,56。(：退火3〇3,72。(：延伸1111111。30 個循環(huán)后，72°C延伸IOmin dPCR反應完成后4°C暫時保存，其中退火溫度可根據(jù)Tm值進行調(diào) 整。
[0057] 2.5瓊脂糖凝膠電泳檢測與膠回收
[005引將PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為TAE(40mM Tris-乙酸鹽， ImM抓TA),核酸燃料為邸。紫外光檢測電泳結果并回收PCR產(chǎn)物。利用上海生工公司的DNA膠 回收試劑盒進行膠回收，具體步驟如下：
[0059] (1)通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術刀 片將含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1.5mL離屯、管中。每個膠塊盡量不要超過 400mg，否則將會導致溶膠不完全。另外切膠過程應盡可能快，從而減少DNA在紫外線中暴露 時間來降低對DNA的損傷。
[00側 （2)根據(jù)膠塊的質(zhì)量和濃度，每IOOmg瓊脂糖力日300~600化的比例加入Buffer B2。
[0061] (3)置于55°C金屬浴lOmin，期間混勻2~3次直至膠塊完全溶化為止。
[0062] (4)當目的片段<500bp時，可加入1/3體積的Buffer B2的異丙醇，混勻。若> 50化P，則此步驟可W省略。
[0063] (5)將溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000xg離屯、30sec。倒掉收集管中的液體， 并將吸附柱放入同一個收集管中。
[0064] (6)加入500化Wash Solution,9000xg離屯、30sec。再次倒掉收集管中的液體。 [00化](7)重復一次步驟6。
[0066] (8)將帶有收集管的吸附柱放入離屯、機，9000xg空離Imin。扔掉收集管，并將吸附 柱置于滅過菌的1.5mL EP管中。
[0067] (9)打開吸附柱的蓋子，室溫放置lOmin。為了去除殘留的酒精，否則會嚴重影響回 收得率和后續(xù)實驗結果。
[006引 （10)在吸附膜中央加入15-30化dd此0。室溫靜置5min，9000xg離屯、Imin。1.5mL EP管底部收集的DNA溶液即為回收的DNA，-20°C保存。
[0069] 2.6 DNA回收片段與PMD-19T載體連接
[0070] 根據(jù)PMD19-T載體使用說明書，在滅過菌的PCR反應管中將Vector與回收DNA片段 進行T-A克隆連接，反應體系如下： PCR克隆回收產(chǎn)物 ：3 P L Solution I 好 ti L
[0071] PMD19-T vector I tt L ddH2〇 up to 10 H L
[0072] 輕輕混勻后16°C過夜連接IOhW上，轉化D冊a感受態(tài)。
[0073] 2.7連接產(chǎn)物轉化D冊a感受態(tài)
[0074] 轉化感受態(tài)具體操作步驟如下：取出適量DH5a感受態(tài)細胞并至于冰上凍融。在超 凈工作臺內(nèi)向冰冷的感受態(tài)細胞中加入上述連接混合液，并用移液器吸頭輕輕吸打混勻。 置于冰上20min。快速平穩(wěn)放入42°C水浴中60s(熱激，使細胞膜開放，重組質(zhì)粒進入細胞）， 并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使細胞膜關閉）。加入50化L無抗LB液體培養(yǎng)基，37°C 恒溫振蕩培養(yǎng)化。室溫下4000rpm離屯、5min，棄掉上清（保留少許培養(yǎng)基，約50化）。超凈臺 內(nèi)，用槍頭輕輕吸打并重懸菌液，涂于氨節(jié)抗性平板。倒置瓊脂平板于37°C，平板通常在37 °C溫育1地。
[0075] 2.8重組子的篩選和鑒定
[0076] 用10化小號槍頭挑取平板上至少5個單菌落(每個菌落均做好標記），并置于含有 800化LB培養(yǎng)基(含相應抗生素）的1.5mL EP管中，37°C振蕩培養(yǎng)地左右至培養(yǎng)基渾濁，并 對培養(yǎng)基渾濁的菌樣進行菌檢驗證，菌檢驗證載體構建成功的菌液取1血送上海生工測序。 利用BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等軟件對序列進行分析。
[0077] 2.9表達載體的構建
[0078] 將測序獲得完全正確的序列，提取質(zhì)粒后用KpnI和XbaI雙酶切中間載體和表達載 體PCAMBIA13011 (PC13011)，再用T4連接酶連接經(jīng)過雙酶切的PC13011載體和miRNA169前體 片段，然后轉化到大腸桿菌中提取質(zhì)粒酶切驗證。
[0079] 2.10轉化農(nóng)桿菌
[0080] 2.10.1電擊杯的處理
[0081 ] (1)用移液槍吸取dd出0反復沖洗電擊杯3-5次。
[0082] (2)用75%的乙醇反復沖洗電擊杯3-5次。
[0083] (3)將電擊杯浸泡在無水乙醇中化，然后倒掉乙醇，置于超凈工作臺中讓殘余酒精 揮發(fā)。
[0084] (4)酒精揮發(fā)完全后，蓋好電擊杯蓋子，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0085] 2.10.2 電轉化
[00化]采用儀器為伯樂公司GeneP y Lser Xcell電穿孔儀進行感受態(tài)細胞的轉化。主要 參數(shù)為:電脈沖2.化F、電壓2.5kV、電阻200 Q。操作步驟如下：
[0087] (1)取出保藏的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞放置冰上融化。
[0088] (2)取化L質(zhì)粒加入到解凍的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻。
[0089] (3)將混合液加到電擊杯中（-20°C預冷），在電脈沖為2.扣F、電壓2.化V、電阻200 Q的參數(shù)條件下電擊。
[0090] (4)取出電擊杯，迅速加入S(K)化預熱的無抗的YEP液體培養(yǎng)基，懸浮細胞后，轉移 到1.5mL的離屯、管中。
[0091] (5)28°(：，220巧111震蕩培養(yǎng)化左右。
[0092] (6)取30-4化L菌液，用無菌的涂布棒將菌液均勻的涂在含有相應抗生素 YEP平板 上，倒置放入28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。
[0093] 2.10.3電轉化農(nóng)桿菌及其檢測
[0094] 將酶切驗證正確的pC13011-miRNA169質(zhì)粒轉化到農(nóng)桿菌GV3101中，再從農(nóng)桿菌中 提取質(zhì)粒后，轉化到大腸桿菌中提質(zhì)粒，酶切驗證。驗證正確的含有pC13011-miRNA169質(zhì)粒 的農(nóng)桿菌，-70°C保存菌種。
[00M] 2.11擬南芥遺傳轉化及其轉基因植株純合子的篩選
[0096] 2.11.1擬南芥的種植
[0097] (1)將野生型擬南芥種子均勻撒在1/2MS固體培養(yǎng)基中。
[0098] (2)4°C冰箱避光春化處理3天。
[0099] (3)3天后，移至培養(yǎng)室培養(yǎng)，條件為溫度23°C，光強7000-90(K)Lx，光照16小時，黑 暗8小時。
[0100] (4)待擬南芥長出2片子葉和2片真葉后，將其移植到含基質(zhì)的盆中，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0101] 2.11.2擬南芥的遺傳轉化
[0102] (1)農(nóng)桿菌菌液的準備:配制含有卡那霉素和利福平的YEP固體培養(yǎng)基，倒平板，劃 線W活化保存的農(nóng)桿菌，28°C倒置培養(yǎng)2天。挑單菌落至ImL含相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基 中，28°C培養(yǎng)2天，再轉移至IOOmL相同的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，直至培養(yǎng)液渾濁變?yōu)槌紊?，巧U 其OD值達到1.2時停止培養(yǎng)。
[0103] (2)400化pm，離屯、IOmin，倒掉上清液，用浸染介質(zhì)懸浮菌體。
[0104] (3)浸花法轉化擬南芥
[0105] a.選取開花初期的擬南芥，將花序浸入含有目的基因農(nóng)桿菌的轉化介質(zhì)中，約10- 20秒。
[0106] b.將浸染過的擬南芥植株平放于一個大容器中，避光培養(yǎng)24小時。
[0107] C.第二天，放置正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0108] d.收獲擬南芥種子，干燥。
[0109] 2.11.3擬南芥轉基因種子的篩選及種植
[0110] (1)將轉基因種子均勻撒在1/2MS的固體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中潮霉素的濃度為 50mg/L)。同時將野生型擬南芥種子撒在不含潮霉素培養(yǎng)基中，作為對照。
[0111] (2)4°C避光春化處理3天。
[0112] (3)3天后將撒有野生型擬南芥種子的培養(yǎng)皿打開，置于培養(yǎng)室中正常培養(yǎng)，而含 有轉基因種子的培養(yǎng)皿則避光培養(yǎng)。
[0113] (4)48小時后，將含有轉基因種子的培養(yǎng)皿置于光下正常培養(yǎng)。轉基因成功的植株 就會生長，反之不生長。
[0114] (5)待擬南芥長出2-4片真葉后，移植到含有泥炭的盆中，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0115] (6)觀察對照擬南芥(野生型WT擬南芥）和山核桃miR169轉基因擬南芥的生長情 況。
[0116] 3.實驗結果
[0117] 3.1山核桃花芽的總RNA提取分析
[0118] 利用改良CTAB巧Rizol法提取山核桃花芽及擬南芥葉片總RNA(見圖I)，并通過紫 外分光光度計測定每個RNA樣品260nm及280nm的吸光度，并W此計算RNA的濃度及純度，并 在1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。所提RNA的光密度比值均在2.0-2.2之間，說明總 RNA基本無糖類、酪及蛋白質(zhì)的污染;電泳結果則顯示RNA樣品的18s和28s兩條帶非常清晰， 可推斷RNA沒有降解，符合下步實驗的要求。
[0119] 3.2山核桃11111?169前體序列的克隆
[0120] 根據(jù)所設計的引物序列，使用PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)連接到pMD19-T(simple)，菌檢PCR 進行檢測（圖2)，并送到上海生工測序，驗證了山核桃miRNA169前體的存在。
[0121] 3.3山核桃11111?169的功能驗證
[0122] 將所獲得前體序列，進行表達載體的構建，將miR169前體序列連接到PC13011表達 載體上，轉化到DH5a感受態(tài)細胞中，將連接成功的單克隆提取質(zhì)粒，轉化到上壤農(nóng)桿菌 GV3101中，進行擬南芥轉基因。對山核桃miRl69轉基因擬南芥植株進行抗性篩選，篩選到純 合后，對其表型進行觀察可W發(fā)現(xiàn)轉基因植株葉片數(shù)目在2016年3月19日-2016年3月25日 期間，明顯多于野生型（圖4);同時觀察發(fā)現(xiàn)，轉基因植株與野生型相比，花期提前（圖5)。
[0123] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾 也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 山核桃miR169在提前植物花期中的應用，其特征在于，所述山核桃miR169的堿基序 列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述植物是擬南芥或煙草。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述植物是擬南芥。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，包括:將包含所述山核桃miR169的前體基 因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導轉化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉基因株系。5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述山核桃miR169的前體基因的堿基序列 如SEQ ID NO .2所示。
【文檔編號】A01H5/00GK105925602SQ201610373785
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】王正加, 孫志超, 舒李露
【申請人】浙江農(nóng)林大學