分泌表達(dá)glp-1的減毒鼠傷寒沙門氏菌的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】一種分泌表達(dá)GLP?1的減毒鼠傷寒沙門氏菌的制備方法及應(yīng)用，是通過化學(xué)合成人源胰高血糖素樣肽I基因，簡稱GLP?1，即1?37個氨基酸的有效功能區(qū)域，并加入真核細(xì)胞特有的分泌表達(dá)穿膜肽基因,構(gòu)建pLive?GLP?1重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)進(jìn)入減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，實現(xiàn)GLP?1的分泌表達(dá)，并通過口服或靜脈注射進(jìn)入人體血液循環(huán)后可以實現(xiàn)GLP?1的持續(xù)表達(dá)，實現(xiàn)對II型糖尿病病癥的緩解和治療作用。
【專利說明】
分泌表達(dá)GLP-1的減毒鼠傷寒沙口氏菌的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種分泌表達(dá)膜高血糖素樣膚I的減毒鼠傷寒沙口氏菌在治療II型糖 尿病中的應(yīng)用，通過構(gòu)建化ive-化P-I表達(dá)載體，在添加真核細(xì)胞穿膜膚后，采用電轉(zhuǎn)的方 法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009，利用減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009穿梭 細(xì)胞的特性，實現(xiàn)化P-I在細(xì)胞中的分泌表達(dá)，并通過靜脈注射等方式實現(xiàn)人體內(nèi)表達(dá)，達(dá) 到緩解和治療II型糖尿病的作用
【背景技術(shù)】
[0002] 膜高血糖素樣膚I，簡稱化P-I，由膜高血糖素原基因表達(dá)，腸粘膜L細(xì)胞、膜島a細(xì) 胞、及神經(jīng)元均有該基因存在，其中腸道細(xì)胞和神經(jīng)元中膜高血糖素原基因的表達(dá)產(chǎn)物是 GLP-IdGLP-I有兩種生物活性形式，分別為GLP-I (7-37)和GLP-I (7-36)酷胺，GLP-I約80% 的循環(huán)活性來自GLP-I (7-36)酷胺。
[0003] GLP-I作為一種腸促膜素，由腸道L細(xì)胞分泌，具有葡萄糖依賴的膜島素促泌作用、 抑制膜高血糖素分泌、刺激e細(xì)胞增殖分化和抑制e細(xì)胞調(diào)亡、抑制食欲及攝食、延緩胃排 空，能恢復(fù)II型糖尿病患者受損的"腸促膜素效應(yīng)"，是一類新型的糖尿病治療藥物。但是， GLP-I在人體血液中極易被二膚氨膚酶IV降解，簡稱DPP IV，僅在血液中存在2分鐘左右，所 W在醫(yī)學(xué)上多采用GLP-I類似物或者DPP IV抑制劑來延長GLP-I的生理作用時間。
[0004] 與此同時，減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009屬于敲除其毒理基因的改造菌株，由于 該改造菌株毒性小，且均有良好的穿梭細(xì)胞的特性，現(xiàn)今已有多種利用減毒鼠傷寒沙口氏 菌VNP20009表達(dá)的藥物進(jìn)入1期、2期、3期臨床實驗，安全性可靠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種分泌表達(dá)膜高血糖素樣膚I的減毒鼠傷寒沙口氏菌的 制備方法及其在治療11型糖尿病中的應(yīng)用，建立了一種GLP-I減速鼠傷寒沙口氏菌 VMNP20009表達(dá)系統(tǒng)，通過該菌穿梭細(xì)胞的特性實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)化P-I的表達(dá)，發(fā)揮化P-I間接降 血糖的功能，從而實現(xiàn)對II型糖尿病的緩解和治療作用；
[0006] 本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟：
[0007] -、pLive-GLP-1 重組質(zhì)粒構(gòu)建
[000引1、通過生物信息學(xué)分析，選擇化P-I氨基酸序列1-37,同時設(shè)計在化P-I前面加一 穿膜膚，序列N端和C端加NheI和BamHI兩個酶切位點。之后將設(shè)計好的序列交測序公司合 成，得到pU巧7-GLP-1重組質(zhì)粒；
[0009] 2、構(gòu)建 pLive-GLP-1 重組質(zhì)粒
[0010] A采用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒，提取pLive，pUC57-GLP-l質(zhì)粒；
[0011] B酶切
[0012] pLive，pUC57-GLP-l酶切體系如下，總體系為25化，37°C酶切4h;
[0013]
[0014] C配制2%瓊脂糖凝膠電泳；IlOV電壓下電泳45min，在片段168bp和載體3400bp切 膠回收；
[0015] D酶連
[0016] 體系如下，總體系IOuLJragment: Vector = S: 1和10:1，10°C過夜；
[0017]
[001引 E轉(zhuǎn)化
[0019] a從-8(TC冰箱中取200化Top 10感受態(tài)細(xì)胞懸液，冰上解凍；
[0020] b加入化L質(zhì)粒溶液，質(zhì)粒濃度不低于2(K)ngAiL，輕輕搖勻，冰上放置30min后；
[0021] c42°C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5min;
[0022] d向管中加入80化L LB液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)化，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長 狀態(tài)。離屯、4000巧m，Imin。棄上清80化L，留20化L菌液，混勻；
[0023] e將上述菌液搖勻后取20化L涂布于含SOngAiL Kan的篩選平板上，正面向上放置 半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)16-2地，挑取單克隆；
[0024] F送公司測序；
[00巧]G測序成功后，采用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)?；痠ve-GLP-1，保存?zhèn)溆茫?步驟同步驟一；
[0026] 二、pLive-GLP-1電轉(zhuǎn)減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009
[0027] A減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009感受態(tài)制備
[002引 a取-80°C凍存的減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009接種于5血LB液體培養(yǎng)基中，37°C 過夜培養(yǎng)；
[0029] b將獲得菌液按照1 %接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)至菌體ODso日值為0.3- 0.4，收集備用；
[0030] C將W上收集的菌體培養(yǎng)物冰浴IOmin，4°C離屯、5000巧m/min，5min;收集菌體；
[0031] d沉淀用冰冷的10 %甘油溶液1/10體積清洗兩次，4 °C離屯、8000巧m/min，5min，收 集沉淀。
[0032] e最后沉淀重懸于1/100體積10%甘油溶液中，冰浴IOmin后即可使用。
[0033] B減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009電轉(zhuǎn)化
[0034] a取化L重組質(zhì)粒，濃度不低于ISOngAiL,與上述方法制備的50化冰冷的減毒鼠傷 寒沙口氏菌VNP20009感受態(tài)細(xì)胞懸液輕輕混勻后，加入預(yù)冷的間距0.1 cm電擊杯中，置于冰 上靜置5min，設(shè)置條件為1800V，200Q，2^F;
[0035] b電擊完畢后，迅速將電擊杯中的液體吸入到離屯、管中，同時計入8(K)化的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1.化，取I(K)化轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布在含有SOngAiL Kan抗性的LB平板上，37 °(：靜置培養(yǎng)12h，篩選陽性克隆子；
[0036] =、減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009與人源胚胎腎細(xì)胞293-T細(xì)胞共培養(yǎng)
[0037] A將293-T細(xì)胞按照50000個/孔接種到24孔板中，第二天備用；
[0038] B將重組減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009復(fù)蘇，過夜培養(yǎng)；
[0039] C當(dāng)VNP2009長至10化FU/mL，采用等體積不含雙抗的含有10%胎牛血清的DMEM培 養(yǎng)基洗涂細(xì)菌3次，按照細(xì)菌:細(xì)胞200:1接種24孔板，處理6-化;更換含雙抗的含有10 %胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基，處理36h;
[0040] D收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清和沉淀進(jìn)行蛋白檢測；
[0041 ] 四、Western檢測pLive-GLP-1在293-T細(xì)胞中的分泌表達(dá)
[0042] A 電泳
[0043] a 配制12 % SDS-PAGE 凝膠
[0044] b樣品處理
[0045] 將上述收集的蛋白樣品中加入濃度4 X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，終濃度為1 X， 100°C或沸水浴加熱3-5分鐘，W充分變性蛋白。
[0046] C上樣與電泳
[0047] 冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)；電泳時電泳液可W 使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液;1OOV電泳90~120min;
[004引 B Western檢測
[0049] a采用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，即NC膜;條件為80V 45min;
[0050] b轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗涂液中，漂洗1-2分 鐘，W洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；
[0051] C加入Western封閉液，即5%脫脂牛奶，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉90分鐘；
[0052] d兔源化P-I多克隆抗體按照1:1000采用5%脫脂牛奶稀釋;將蛋白膜轉(zhuǎn)移至含一 抗的5 %脫脂牛奶中4°C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動解育過夜，TBST洗涂S次，每次IOmin;
[0053] e辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG按照1:1000采用5%脫脂牛奶稀釋;將蛋白膜 轉(zhuǎn)移至含二抗的5 %脫脂牛奶中，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動解育60min，TBST洗涂S次，每次 IOmin；
[0化4] f顯色液A液和B液各25化L 1:1避光混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，曝光。
[0055] 本發(fā)明所述分泌表達(dá)膜高血糖素樣膚I的減毒鼠傷寒沙口氏菌的應(yīng)用為：
[0056] -、鏈脈佐菌素誘導(dǎo)二型糖尿病小鼠模型的建立
[0化7] SPF級小鼠隨機分為正常對照組10只和模型組10只。正常對照組小鼠飼喂普通飼 料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶劑(巧樣酸緩沖液，即0.1 M巧樣酸鋼:0.1 M巧樣酸為1:1.32，pH = 4.5)，飼喂普通飼料3周;模型組小鼠飼喂高脂高糖飼料4周后，腹腔一次性注射lOOmg/kg 的STZ，繼續(xù)飼喂高脂高糖飼料3周。小鼠II型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖> 11. Immo 1/L，且 有多飲、多尿、多食、體重增加不明顯，即為造模成功。
[005引二、減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009灌胃
[0059] 將造模成功后的小鼠，灌胃重組減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009,菌液經(jīng)生理鹽水 洗涂2次后，隔天灌胃一次，標(biāo)準(zhǔn)為5 X IO6CFUAg，共進(jìn)行5次;正常組飼喂普通飼料，造模組 飼喂局脂局糖飼料；
[0060] S、組織樣品收集
[0061] 正常對照組和造模組分別在尾靜脈注射后第屯天，取小鼠血液、腸組織和肝組織， 組織破碎后檢測是否表達(dá)GLP-I;并檢測小鼠血糖含量和膜島素含量是否與正常組一致。
[0062] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過構(gòu)建pLive-GLP-1表達(dá)載體，在添加真核細(xì)胞穿膜 膚后，采用電轉(zhuǎn)的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009，利用減毒鼠傷寒沙 口氏菌VNP20009穿梭細(xì)胞的特性，實現(xiàn)GLP-I在細(xì)胞中的分泌表達(dá)，并通過靜脈注射等方式 實現(xiàn)人體內(nèi)表達(dá)，達(dá)到緩解和治療II型糖尿病的作用。
【具體實施方式】
[0063] 本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟：
[0064] -、pLive-GLP-1 重組質(zhì)粒構(gòu)建
[0065] 1、通過生物信息學(xué)分析，選擇化P-I氨基酸序列1-37,同時設(shè)計在化P-I前面加一 穿膜膚，序列N端和C端加NheI和BamHI兩個酶切位點。之后將設(shè)計好的序列交測序公司合 成，得到pU巧7-GLP-1重組質(zhì)粒；
[0066] 2、構(gòu)建 pLive-GLP-1 重組質(zhì)粒
[0067] A采用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒，提取pLive，pUC57-GLP-l質(zhì)粒；
[006引 B酶切
[0069] pLive，pUC57-GLP-l酶切體系如下，總體系為25化，37°C酶切4h;
[00701
[0071] C配制2%瓊脂糖凝膠電泳；Iiov電壓下電泳45min，在片段168bp和載體3400bp切 膠回收；
[0072] D 酶連
[0073] 體系如下，總體系IOuLJragment: Vector = S: 1和10:1，10°C過夜；
[0074]
[0075] E 轉(zhuǎn)化
[0076] a從-80°C冰箱中取20化L Top 10感受態(tài)細(xì)胞懸液，冰上解凍；
[0077] b加入化L質(zhì)粒溶液，質(zhì)粒濃度不低于20化g/jiL，輕輕搖勻，冰上放置30min后；
[0078] c42°C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5min;
[00巧]d向管中加入80化L LB液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)化，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長 狀態(tài)。離屯、4000巧m，Imin。棄上清80化L，留20化L菌液，混勻；
[0080] e將上述菌液搖勻后取20化L涂布于含SOngAiL Kan的篩選平板上，正面向上放置 半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)16-2地，挑取單克隆；
[0081] F送公司測序；
[0082] G測序成功后，義用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒化ive-GLP-1，保存?zhèn)溆茫?步驟同步驟一；
[0083] 二、pLive-GLP-1電轉(zhuǎn)減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009
[0084] A減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009感受態(tài)制備
[0085] a取-80°C凍存的減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009接種于5血LB液體培養(yǎng)基中，37°C 過夜培養(yǎng)；
[0086] b將獲得菌液按照1 %接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)至菌體ODso日值為0.3- 0.4，收集備用；
[0087] C將W上收集的菌體培養(yǎng)物冰浴IOmin，4°C離屯、5000巧m/min，5min;收集菌體；
[008引 d沉淀用冰冷的10 %甘油溶液1/10體積清洗兩次，4 °C離屯、8000巧m/min，5min，收 集沉淀。
[0089] e最后沉淀重懸于1/100體積10%甘油溶液中，冰浴IOmin后即可使用。
[0090] B減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009電轉(zhuǎn)化
[0091] a取化L重組質(zhì)粒，濃度不低于150ng/化，與上述方法制備的50化冰冷的減毒鼠傷 寒沙口氏菌VNP20009感受態(tài)細(xì)胞懸液輕輕混勻后，加入預(yù)冷的間距0.1 cm電擊杯中，置于冰 上靜置5min，設(shè)置條件為1800V，200Q，2^F;
[0092] b電擊完畢后，迅速將電擊杯中的液體吸入到離屯、管中，同時計入80化L的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1.化，取I(K)化轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布在含有SOngAiL Kan抗性的LB平板上，37 °(：靜置培養(yǎng)12h，篩選陽性克隆子；
[0093] =、減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009與人源胚胎腎細(xì)胞293-T細(xì)胞共培養(yǎng)
[0094] A將293-T細(xì)胞按照50000個/孔接種到24孔板中，第二天備用；
[00M] B將重組減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009復(fù)蘇，過夜培養(yǎng)；
[0096] C當(dāng)VNP2009長至10化FU/mL，采用等體積不含雙抗的含有10%胎牛血清的DMEM培 養(yǎng)基洗涂細(xì)菌3次，按照細(xì)菌:細(xì)胞200:1接種24孔板，處理6-化;更換含雙抗的含有10 %胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基，處理36h;
[0097] D收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清和沉淀進(jìn)行蛋白檢測；
[0098] 四、Western檢測pLive-GLP-1在293-T細(xì)胞中的分泌表達(dá)
[0099] A 電泳
[0100] a 配制12 % SDS-PAGE 凝膠
[0101] b樣品處理
[0102] 將上述收集的蛋白樣品中加入濃度4XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，終濃度為IX， 100°C或沸水浴加熱3-5分鐘，W充分變性蛋白。
[0103] C上樣與電泳
[0104] 冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)；電泳時電泳液可W 使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液;1OOV電泳90~120min;
[01 化]B Western檢測
[0106] a采用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，即NC膜;條件為80V 45min;
[0107] b轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗涂液中，漂洗1-2分 鐘，W洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；
[0108] C加入Western封閉液，即5%脫脂牛奶，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉90分鐘；
[0109] d兔源化P-I多克隆抗體按照1:1000采用5%脫脂牛奶稀釋;將蛋白膜轉(zhuǎn)移至含一 抗的5 %脫脂牛奶中4°C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動解育過夜，TBST洗涂S次，每次IOmin;
[0110] e辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG按照1:1000采用5%脫脂牛奶稀釋;將蛋白膜 轉(zhuǎn)移至含二抗的5 %脫脂牛奶中，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動解育60min，TBST洗涂S次，每次 IOmin；
[0111] f顯色液A液和B液各25化L 1:1避光混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，曝光。
[0112] 本發(fā)明所述分泌表達(dá)膜高血糖素樣膚I的減毒鼠傷寒沙口氏菌的應(yīng)用為：
[0113] -、鏈脈佐菌素誘導(dǎo)二型糖尿病小鼠模型的建立
[0114] SPF級小鼠隨機分為正常對照組10只和模型組10只。正常對照組小鼠飼喂普通飼 料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶劑(巧樣酸緩沖液，即0.1 M巧樣酸鋼:0.1 M巧樣酸為1:1.32，pH = 4.5)，飼喂普通飼料3周;模型組小鼠飼喂高脂高糖飼料4周后，腹腔一次性注射lOOmg/kg 的STZ，繼續(xù)飼喂高脂高糖飼料3周。小鼠II型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖> 11. Immo 1/L，且 有多飲、多尿、多食、體重增加不明顯，即為造模成功。
[0115] 二、減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009灌胃
[0116] 將造模成功后的小鼠，灌胃重組減毒鼠傷寒沙口氏菌VNP20009,菌液經(jīng)生理鹽水 洗涂2次后，隔天灌胃一次，標(biāo)準(zhǔn)為5 X IO6CFUAg，共進(jìn)行5次;正常組飼喂普通飼料，造模組 飼喂局脂局糖飼料；
[0117] S、組織樣品收集
[0118] 正常對照組和造模組分別在尾靜脈注射后第屯天，取小鼠血液、腸組織和肝組織， 組織破碎后檢測是否表達(dá)GLP-I;并檢測小鼠血糖含量和膜島素含量是否與正常組一致。
【主權(quán)項】
1. 一種分泌表達(dá)GLP-1的減毒鼠傷寒沙門氏菌的制備方法，其特征在于： 一、pLive_GLP_l重組質(zhì)粒構(gòu)建 a) 通過生物信息學(xué)分析，選擇GLP-1氨基酸序列1-37,同時設(shè)計在GLP-1前面加一穿膜 肽，序列N端和C端加 Nhel和BamHI兩個酶切位點。之后將設(shè)計好的序列交測序公司合成，得 到pUC57-GLP-l重組質(zhì)粒； b) 構(gòu)建pLive-GLP-Ι重組質(zhì)粒 A采用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒，提取pLive，pUC57-GLP-l質(zhì)粒； B酶切 pLi ve，pUC57-GLP-l酶切體系如下，總體系為25yL，37 °C酶切4h;〇配制2%瓊脂糖凝膠電泳；110￥電壓下電泳451]1；[11，在片段168&口和載體340(^口切膠回 收； D酶連 體系如下，總體系10此，？抑81116111::￥6(31：(^ = 5:1和10:1，10°(^過夜；E轉(zhuǎn)化 a從-80°C冰箱中取200yL Top 10感受態(tài)細(xì)胞懸液，冰上解凍； b加入2yL質(zhì)粒溶液，質(zhì)粒濃度不低于200ng/yL，輕輕搖勻，冰上放置30min后； c42°C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5min; d向管中加入800yL LB液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀 態(tài)。離心4000rpm，lmin;棄上清800yL，留200yL菌液，混勾； e將上述菌液搖勻后取200yL涂布于含50ng/yL Kan的篩選平板上，正面向上放置半小 時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37 °C培養(yǎng)16-24h，挑取單克隆； F送公司測序； G測序成功后，采用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒pLive-GLP-Ι，保存?zhèn)溆茫襟E 同步驟一； 二、 pLive-GLP-Ι電轉(zhuǎn)減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 A減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009感受態(tài)制備 a取-80°C凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜 培養(yǎng)； b將獲得菌液按照1 %接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 °C靜置培養(yǎng)至菌體OD600值為0.3-0.4， 收集備用； c將以上收集的菌體培養(yǎng)物冰浴10min，4°C離心5000rpm/min，5min;收集菌體； d沉淀用冰冷的10 %甘油溶液1 /10體積清洗兩次，4 °C離心8000rpm/min，5min，收集沉 淀； e最后沉淀重懸于1/100體積10%甘油溶液中，冰浴lOmin后使用； B減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009電轉(zhuǎn)化 a取2yL重組質(zhì)粒，濃度不低于150ng/yL，與上述方法制備的50yL冰冷的減毒鼠傷寒沙 門氏菌VNP20009感受態(tài)細(xì)胞懸液輕輕混勻后，加入預(yù)冷的間距0.1cm電擊杯中，置于冰上靜 置5min，設(shè)置條件為 1800ν，200Ω，25yF; b電擊完畢后，迅速將電擊杯中的液體吸入到尚心管中，同時計入800yL的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)1.5h，取100yL轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布在含有50ng/yL Kan抗性的LB平板上，37°C靜 置培養(yǎng)12h，篩選陽性克隆子； 三、 減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009與人源胚胎腎細(xì)胞293-T細(xì)胞共培養(yǎng) A將293-T細(xì)胞按照50000個/孔接種到24孔板中，第二天備用； B將重組減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009復(fù)蘇，過夜培養(yǎng)； C當(dāng)VNP2009長至108CFU/mL，采用等體積不含雙抗的含有10%胎牛血清的01^1培養(yǎng)基洗 滌細(xì)菌3次，按照細(xì)菌:細(xì)胞200:1接種24孔板，處理6-8h;更換含雙抗的含有10 %胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)基，處理36h; D收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清和沉淀進(jìn)行蛋白檢測； 四、 Western檢測pLive-GLP-Ι在293-T細(xì)胞中的分泌表達(dá) A電泳 a配制12 % SDS-PAGE凝膠 b樣品處理 將上述收集的蛋白樣品中加入濃度4 X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，終濃度為1 X，100°C 或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白； c上樣與電泳 冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)；電泳時電泳液可以使用 碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液；100V電泳90~120min; B Western檢測 a采用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，即NC膜;條件為80V 45min; b轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以 洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液； c加入Western封閉液，即5 %脫脂牛奶，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉90分鐘； d兔源GLP-1多克隆抗體按照1:1000采用5%脫脂牛奶稀釋;將蛋白膜轉(zhuǎn)移至含一抗的 5 %脫脂牛奶中4°C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育過夜，TBST洗滌三次，每次lOmin; e辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG按照1:1000采用5%脫脂牛奶稀釋;將蛋白膜轉(zhuǎn)移 至含二抗的5 %脫脂牛奶中，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育60min，TBST洗滌三次，每次lOmin; f顯色液A液和B液各250yL 1:1避光混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，曝光。2. -種分泌表達(dá)GLP-1的減毒鼠傷寒沙門氏菌的應(yīng)用，其特征在于： 一、 鏈脲佐菌素誘導(dǎo)二型糖尿病小鼠模型的建立 SPF級小鼠隨機分為正常對照組10只和模型組10只，正常對照組小鼠飼喂普通飼料4周 后，小鼠腹腔注射STZ溶劑，所述溶劑為檸檬酸緩沖液，即0.1M檸檬酸鈉:0.1M檸檬酸為1: I. 32，pH = 4.5,飼喂普通飼料3周；模型組小鼠飼喂高脂高糖飼料4周后，腹腔一次性注射 100mg/kg的STZ，繼續(xù)飼喂高脂高糖飼料3周，小鼠 II型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖多 II. lmmol/L，且有多飲、多尿、多食、體重增加不明顯，即為造模成功； 二、 減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009灌胃 將造模成功后的小鼠，灌胃重組減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009,菌液經(jīng)生理鹽水洗滌2 次后，隔天灌胃一次，標(biāo)準(zhǔn)為5X106CFU/kg，共進(jìn)行5次；正常組飼喂普通飼料，造模組飼喂 尚脂尚糖伺料； 二、組織樣品收集 正常對照組和造模組分別在尾靜脈注射后第七天，取小鼠血液、腸組織和肝組織，組織 破碎后檢測是否表達(dá)GLP-1;并檢測小鼠血糖含量和胰島素含量是否與正常組一致。
【文檔編號】C12N15/62GK105925598SQ201610318452
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】辛洪波, 陳廷濤, 王鑫
【申請人】南昌大學(xué)