一種利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種利用CRISPR?Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，該方法通過對多物種進行同源對比選取兩對ALK6基因靶序列，利用gRNA的PAM設(shè)計原則，合成兩對靶序列不同，表達的蛋白相同，帶有相同BsmBI粘性末端的DNA雙鏈，將雙鏈與pPDNA330質(zhì)粒進行連接得到攜帶有多物種的ALK6同源基因的重組載體，重組載體利用熒光蛋白表達法對基因敲除效率進行檢測，選擇敲除效率更高的載體轉(zhuǎn)染多物種受體細胞，進行基因敲除并驗證，完成對多物種ALK6基因進行簡單、高效、精確的基因敲除。
【專利說明】-種利用CR I SPR-Cas9卽向敲除ALK6基因的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學領(lǐng)域，特別設(shè)及一種利用CRISPR-Cas9祀向敲除ALK6基因 的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] ALK6是骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體lB(bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR-IB)的別稱，是是轉(zhuǎn)化生長因子-0(transforming growth factor-P)超家族一型受 體，其通過傳遞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone mor地Ogenetic protein 2,BMP2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋 白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(bone morphogenetic protein 6,BMP6)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 15(bone mor地Ogenetic protein 15,BMP15)等配體 信號，在哺乳動物生殖過程中發(fā)揮非常重要的作用，自然情況下，布魯拉美利奴等綿羊品種 ALK6基因編碼區(qū)第109位堿基A突變?yōu)镚，突變個體的排卵率及多胎率顯著高于野生型個體。
[0003] 第一個被發(fā)現(xiàn)攜帶增加排卵率的主效基因即ALK6的羊是Booroola羊，ALK6位于綿 羊高繁殖力FecB基因所在的6號染色體區(qū)域與其相對應(yīng)人4號染色體q22-q23區(qū)域中，與 Booroola羊的排卵率密切相關(guān)。ALK6基因編碼區(qū)A746G堿基突變，導(dǎo)致了谷氨酷胺被精氨酸 替換(Q249R)，導(dǎo)致綿羊排卵率與產(chǎn)黑數(shù)發(fā)生了變化，證明了對該基因進行突變可W使羊的 排卵率增多，從而增加產(chǎn)黑羊數(shù)量，ALK6基因具有影響卵泡顆粒細胞分化和卵泡發(fā)育、促進 排卵數(shù)增加的作用。水牛是單胎動物，其排卵率低，發(fā)情不明顯，繁殖力相對低于黃牛，自然 情況下極少出現(xiàn)能繁多胎的母本，如果能將動物的ALK6基因進行改變則會大大提高動物的 繁殖能力。
[0004] 改變基因構(gòu)造通常是進行基因突變，即將DNA分子中發(fā)生堿基對的增添、缺失或改 變而引起的基因結(jié)構(gòu)改變，而基因突變往往是不定向的，隨機的，未知的。為提高改變基因 結(jié)構(gòu)的效率，在現(xiàn)今的分子生物學領(lǐng)域中，通常是從特定生物體中提取ALK6基因，再根據(jù)基 因組的編碼順序來編碼進行同源性替代祀基因使上述的ALK6基因被取代或破壞而失活，達 到祀向敲除基因的目的，祀向敲除精確度高、容易進行形狀分析篩選，大大提高了工作效 率。然而該方法僅能對單一物種的某一基因進行基因敲除，不能適用于多物種。
[0005] 基因編輯常用ZF化和TALEN技術(shù)，然而運兩種技術(shù)如果要實現(xiàn)定向編輯，則必須合 成DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊，即DNA剪切的實現(xiàn)有賴于化kl核酸酶結(jié)構(gòu)域。運一要求大 大限制了運兩種技術(shù)的發(fā)展，而CRISPR/cas9技術(shù)則通過曲NA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶實現(xiàn)DNA特異 位點的編輯，突破了ZFNs和TALEN技術(shù)的發(fā)展限制，是更為高效的基因特異位點的編輯技 術(shù)。
[0006] 目前，有些研究開始使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因敲除實驗，例如PCT專利CN 105142669A公開了基于CRISPR的基因組修飾和調(diào)控，說明了 CRISPR系統(tǒng)可用于基因組的修 飾和調(diào)控，用CRISPR系統(tǒng)比ZFN和TALEN更簡單、高效的優(yōu)點，但該專利未公布針對ALK6基因 敲除的特定酶切位點和堿基序列，未公布針對ALK6基因的優(yōu)選片段進行檢測、選擇的方法， 而且也未公布本發(fā)明針對ALK6基因敲除所用的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建。使用CRISPR/Cas9系 統(tǒng)由于其可多位點對基因進行修飾。因此，本發(fā)明需要解決W下幾個問題：（1)構(gòu)建能祀向 敲除多物種的ALK6基因編輯方法；（2)現(xiàn)有技術(shù)在基因編輯過程特別是人和水?；蚪M編 輯的技術(shù)平臺存在效率低，適用性低的特點，整個平臺仍需進行優(yōu)化和條件摸索；（3)現(xiàn)有 技術(shù)沒有一種能快速、精確的找到祀序列的檢測方法，從而進一步提高基因編輯的成功率。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007] 鑒于上述內(nèi)容，有必要提供一種簡單、高效、準確、適用于多物種特別是針對人和 水牛的ALK6基因敲除方法，并進一步提高對祀序列的檢測效率，能快速、精確的找到祀序 列，提局基因編輯的成功率。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] 一種利用CRISPR-化s9祀向敲除ALK6基因的方法，所述方法包括如下步驟：
[0010] (1)構(gòu)建 PPDNA330-ALK6-1 和 PPDNA330-ALK6-2 載體，構(gòu)建方法如下：
[0011] A、從基因數(shù)據(jù)庫中下載多物種ALK6基因的核巧酸序列，并進行同源比對選取兩對 祀序列，分別為ALK6祀序列 1 : 5 ' -ATGATAGAAGAAGATGACTC-3 ' 和ALK6祀序列2 : 5 ' - GGATCAGGCCTCCCTCTGC-3'；
[0012] B.根據(jù)同源對比結(jié)果和排NA的PAM設(shè)計原則，合成兩對與祀序列不同，表達的蛋白 相同，帶有相同BsmBI粘性末端的DNA雙鏈，分別命名為:ALK6-1和ALK6-2;
[0013] C.用BsmBI酶切PPDNA330質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，回收；
[0014] D.用連接酶將ALK6-1和ALK6-2分別與BsmBI酶切后的PPDNA330質(zhì)粒進行連接，得 到重組質(zhì)粒載體，分別命名為:pPDNA330-ALK6-l和PPDNA330-ALK6-2;
[0015] (2)對重組質(zhì)粒載體PPDNA330-ALK6-1和PPDNA330-ALK6-2進行敲除效率的篩選驗 證、對比，選擇ALK6基因敲除效率更高的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染受體細胞；
[0016] (3)轉(zhuǎn)染不同物種的受體細胞，收集轉(zhuǎn)染之后的受體細胞，并提取細胞基因組進行 測序，根據(jù)基因組測序結(jié)果合成檢測引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接入祀ASY-Tl載體，挑 取單克隆細菌，進行測序，對ALK6基因敲除表達結(jié)果進行檢測。
[0017]進一步的，所述ALK6-1 的上游序列為，5'-ACCGATGATAGAAGAAGATGACTC-3'，下游序 ^lJ^,5'-AAACGAGTCATCTTCTTCTATCAT-3'；ALK6-2 6^±|5?j1?^!j5'- ACCGGGATCAGGCCTCCCTCTGC-3'，下游序列為，5' -AAACACAGAGGGAGGCCTGATCC-3'。
[001引進一步的，所述PPDNA330質(zhì)粒構(gòu)建方法如下：
[0019] (1)優(yōu)化puro基因，去除其編碼區(qū)內(nèi)的酶切位點，但不改變其氨基酸組成：應(yīng)用 StuI和ClaI酶切puc57-pu;ro，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，回收獲得puro基因；
[0020] (2)應(yīng)用StuI和bsp 1191酶切PCDNA3.1，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，回 收獲得線性化的PCDNA3.1片段；
[0021] (3)用T4連接酶將puro基因和PCDNA3.1片段進行連接得到pPDNA載體；
[0022] (4)人工合成U6-BsmbI-gRNA序列，片段位于PUC57載體中；
[0023] (5)用MluI和NheI酶切puc57-U6-BsmbI-gRNA，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳， 切膠，回收獲得US-Bsmb I-gRNA片段；
[0024] (6)用Mlu巧日化el酶切pPDNA載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，回收獲 得線性化的pPDNA載體片段；
[00巧](7)T4連接上述U6-BsmbI-gRNA片段和pPDNA載體片段，得到pPDNA-gRNA載體；
[0026] (8)用XbaI和NotI酶切PX330載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，回收獲 得cas9片段；
[0027] (9)用XbaI和NotI酶切pPDNA-gRNA載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠， 回收獲得線性化的pPDNA-gRNA載體片段；
[002引 （10)T4連接上述cas9片段和線性化的pPDNA-gRNA載體片段得到PPDNA330載體。
[00巧]進一步的，所述MluI和NheI酶的反應(yīng)溫度為35-40°C，時間為2.5-3.化，酶切體系 為：2-4]ig的卵uc57-pu;ro質(zhì)粒，3-6化的 10 XhstDigest，2.5-4化的StuI，3化的ClaI加水至 溶液為45-5扣1^;XbaI和NotI酶的反應(yīng)溫度為35-40°C，時間為2.5-3.化，酶切體系為:2-化邑 的陽330質(zhì)粒，3-6化的10 X化StDigest，2.5-鈕山L XbaI，2.5-4化化NotI加水至溶液為 45-55化。
[0030] 進一步的，所述BsmBI酶切體系反應(yīng)溫度為50-60°C，時間為2.5-3.化，酶切體系 為：2.5-3.5iig的PPDNA330質(zhì)粒，1.5-2.5化的 10 X 肥B Buf f er3，0.2-0.祉L的BsmBI，加水至 溶液為15-2^iL。
[0031] 進一步的，所述重組質(zhì)粒載體PPDNA330-ALK6-巧日PPDNA330-ALK6-2敲除效率的篩 選驗證選用巧光蛋白表達法進行驗證，具體方法如下：
[0032] (1)利用RGS-CR做為驗證報告載體:使用限制性內(nèi)切酶EcoR巧日BamHI對驗證報告 載體RGS-CR進行線性化；
[0033] (2)合成與ALK6祀序列巧日ALK6祀序列2對應(yīng)的兩條帶有EcoRI和BamHI粘性末端的 DNA雙鏈，分別命名為：#ALK6-^P#ALK6-2;
[0034] 其中，#ALK6-1 引物的上游序列為：5'-AATTCGATGATAGAAGAAGATGACTCTGGG-3'，
[0035] 下游序列為：5'-6410：0：46461'〔41'(：1'1'(：1'1'口'41'〔41'〔6-3'；
[0036] #ALK6-2引物的上游序列為：5' -AATTCGCGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGG-3'，
[0037] 下游序列為：5' -GATCCCCAGCAGAGGGAGGCCTGATCCGCG-3' ；
[003引 （3)采用T4連接酶將步驟（1)的RGS-CR線性化產(chǎn)物和步驟(2)帶有EcoR巧郵amHI粘 性末端的#40(6-1和#40(6-2兩對DNA雙鏈進行連接得到重組質(zhì)粒載體，分別命名為:RGS-# ALK6-1和RGS-#ALK6-2;
[0039] (4)取傳代的HEK-293T細胞于4個培養(yǎng)皿中；
[0040] (5)取4個離屯、管編號為1、2、3、4,每個管分別加入含F(xiàn)BS的DMEM;
[0041 ] (6)然后在 1 號管加 PPDNA330-ALK6-1 和 RGS-#ALK6-1，2 號管加 PPDNA330 和 RGS-# ALK6-1，3 號管加 PPDNA330-ALK6-2 和 RGS-#ALK6-2，4 號管加 PPDNA330 和 RGS-#ALK6-2;最后 在每個管中加入羅氏轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置后，將混合液分別加入培養(yǎng)皿，并于培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后在巧光顯微鏡下觀察目的基因的巧光表達情況。
[0042] 進一步的，所述限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI的酶切體系反應(yīng)溫度為35-40°C，時間 為2.5-3.5h，酶切體系為：1.5-2.5iig的RGS質(zhì)粒，1.5-2.5化的 10 X 肥B Buffer3，0.2-0.祉L 的EcoRI，0.2-0.祉L BamHI加水至溶液為 15-2^iL。
[0043] 進一步的，所述受體細胞選用人的化Ia細胞或水牛的成纖維細胞。
[0044] 進一步的，所述的人化Ia細胞和水牛的成纖維細胞的培養(yǎng)條件為:用含F(xiàn)BS的DMEM 的培養(yǎng)基在電轉(zhuǎn)前24小時對人的Hela細胞和水牛的成纖維細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為35- 40°C，4%-6% 的 C〇2。
[0045] 進一步的，所述檢測引物選用人或水牛的ALK6-2基因上下游序列做為檢測引物， 人ALK6-2基因檢測引物命名為:hALK6，hALK6上游序列為5 ' -TTTACTTGGGAAACCATAACTA-3 '， 下游序列為5 ' -TGGATTGTAACCATACACCTAC-3 '，擴增長度為517bp;水牛的ALK6-2基因檢測引 物命名為：bufALK6，bufALK6上游序列為5'-GCATTGGGTTAGAACAGGAT-3'，下游序列為5'- CCTTTGTCCACTGCCCTA-3'，擴增長度為 19化P。
[0046] 進一步的，所述PCR體系為：10化2 XPrimeSTAR?HS(Premix) (Takara),DNA模板化 L，上下游引物各0.5化，水補至20化。反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性Smin，35循環(huán)（95 °C變性 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec)，72°C再延伸7min，4°C終止反應(yīng)。取上述PCR反應(yīng)的 化L PCR產(chǎn)物，直接進行2 %的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，時間約30min。
[0047] 上述的應(yīng)用CRISPR-Cas9祀向敲除ALK6基因的方法可用于人或水牛的ALK6基因敲 除。
[004引本發(fā)明具有W下有益效果：
[0049] 1、本技術(shù)方案發(fā)明人通過對多物種的AKL6基因進行分析，進行同源比對，選擇同 源性最局的兩對基因序列做為勒!序列，進行對ALK6基因的獻除，有效的提局了勒!序列的普 適性，使利用該祀序列進行編輯的重組質(zhì)粒載體能適用于多物種。雖然本發(fā)明對多物種的 ALK6基因進行同源對比選擇同源性高的祀序列，然而并不是每一個選擇的祀序列都能正確 表達，還需要進行表達驗證，而且，不同物種的基因組序列是不一樣的，如果僅僅利用同源 對比選擇祀序列而選用其它編輯技術(shù)，例如:ZF化和TALEN編輯技術(shù)，由于運兩種技術(shù)必須 合成DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊，在進行DNA剪切的時候?qū)艿交痥l核酸酶結(jié)構(gòu)域的限 審IJ，編輯效率大大降低，如果找出的同源比對的ALK6基因上下游沒有化kl核酸酶結(jié)構(gòu)域則 不能完成基因的剪切，不能進行基因編輯，同樣的，要精確找到有表達效果的祀序列，其檢 測手段是必不可少的，檢測手段必須要簡單、高效、準確，才能提高祀序列的準確性。
[(K)加]2、本技術(shù)方案選用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，CRISPR-化s9里面需要兩個組件，一個是 gRNA，另外一個是內(nèi)切酶也就是Cas9. gRNA包括crRNA和tracrRNA，gRNA結(jié)合crRNA的祀標特 異性及化acrRNA的腳手架特性(如何翻譯scffold)成單一轉(zhuǎn)錄子。當gRNA和cas9在細胞內(nèi) 表達時，基因組的祀標會被修飾或永久性的干擾。使用化s9核酸內(nèi)切酶只需要提供一個包 含特異的20bp的小片段S排NA(single guide RNA)來決定祀向特異性。SgRNA是由crRNA (CRISPR RNA)與tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)嵌合構(gòu)成的一個約 100個核巧 酸大小的RNA。crRNA能夠與祀向的DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，運段祀向DNA序列叫做前間隔序 列。crRNA與trancrRNA-起構(gòu)成的SgRNA與化s9相互作用形成核糖核蛋白。SgRNA的5'端的 約20bp (對應(yīng)的是crRNA)通過RNA-DNA互補配對指引化s9與祀序列結(jié)合進而對祀位點進行 切割，造成DNA雙鏈斷裂(doub 1 e S化and break，DSB)。在細胞中，核酸酶造成的DSB在沒有 修復(fù)模板的情況下，W非同源末端連接(nonhomologous日11(1-扣;[]1；[雌，畑6]")的方式進行修 復(fù)。NHEJ能夠引起隨機長度的堿基插入或缺失，可W破壞編碼基因的翻譯閱讀框架，因此， 本發(fā)明使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯不受限制性內(nèi)切酶的限制，能更簡單、高效、多 位點的對基因進行修飾，實現(xiàn)了僅構(gòu)建一個表達載體就能對多物種的同一祀序列進行基因 編輯的效果，同時方法簡單、高效。
[0051] 3、本技術(shù)方案用驗證報告載體RGS-CR對兩對祀基因的敲除效率進行檢驗，采用巧 光蛋白和目的基因連接，當目的基因被同源替代祀向敲除時，能啟動巧光蛋白表達，在綠光 下成像，利用該方法能將基因編輯效果進行體外表達，克服了體內(nèi)表達周期長的問題，能快 速的對基因的轉(zhuǎn)染效率做出迅速和可靠的評估，有效的提高了對祀序列的定向分析、檢測 作用，提高了祀序列選擇的準確度。 【【附圖說明】】
[0052] 圖1為PPDNA330載體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0053] 圖2為ALK6多物種同源比對及祀標1的設(shè)計位點圖；
[0054] 圖3為ALK6多物種同源比對及祀標2的設(shè)計位點圖；
[0化5] 圖4為ALK6打祀效率巧光表達檢測圖；
[0056] 圖5為肥LA細胞ALK6基因突變測序結(jié)果圖；
[0057] 圖6為水牛成纖維細胞ALK6基因突變檢測結(jié)果圖。 【【具體實施方式】】
[0058] 本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟W外，均可W W任何方式組合。
[0059] 本說明書(包括任何附加權(quán)利要求、摘要）中公開的任一特征，除非特別敘述，均可 被其他等效或具有類似目的的替代特征加W替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列 等效或類似特征中的一個例子而已。
[0060] 實施例：
[0061 ] 一、PPDNA330載體的制備：
[0062] (一）優(yōu)化puro基因，去除其編碼區(qū)內(nèi)的酶切位點，并人工合成后，連入PCDNA3.1 (-)載體制備成pPDNA載體。puro優(yōu)化后的序列見序列表。方法如下：
[0063] 1、優(yōu)化puro基因，去除其編碼區(qū)內(nèi)的酶切位點，但不改變其氨基酸組成，于生工生 物工程（上海）股份有限公司進行puro基因人工合成，合成puro基因位于puc57-pu;ro載體 中。
[0064] 2、應(yīng)用 StuI (Ferments)和 ClaKFe;rmen1:as)酶切 puc57-pu;ro,膠回收獲得 puro 基 因，酶切體系為：酶切體系為puc57-pu;ro質(zhì)?；痝，10 XhstDigest !5化，化L StuI，化L ClaI,加水至50化，37°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將約1638bp的目的片段 回收，測定濃度，存于-20°C，備用；
[00化]3、應(yīng)用5化1巧61'1116]11:日3)和6391191(化1'1116]11:日3)酶切9。0魁3.1(-)，膠回收獲得線 性化的PCDNA3.U-)片段，酶切體系為：酶切體系為PCDNA3.U-)質(zhì)?；痝，10X化StDigest 扣L，化L StuI，化L bspl 191，加水至50化，37°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳， 將約5427bp的目的片段回收，測定濃度，存于-20°C，備用；
[0066] 4、連接上述2、3兩步獲得的產(chǎn)物，連接體系：1化T41igase巧ermen化S)，化L 10 X T41igase Buffer(Fermentas)，線性化的pcDNA3.1(-)載體片段30ng，p;ruo基因30ng，加水 至10化，16°C過夜連接。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細胞D冊a進行轉(zhuǎn)化，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并 進行序列測定，得到pPDNA載體。
[0067] (二）從攜帶CRISPR/Cas9的PX330載體上獲得Cas9編碼區(qū)，人工合成Ue-BsmbI- 曲NA區(qū)，克隆至pPDNA載體中制備了含有CRISPR/Cas9的PPDNA330載體，方法如下：
[006引 1、人工合成U6-BsmbI-gRNA序列，序列見序列表，片段位于PUC57載體中。
[0069] 2、應(yīng)用MluI (Fermentas)和 NheKFermentas)酶切puc57-U6-BsmbI-gRNA，膠回收 獲得U6-BsmbI-gRNA片段，酶切體系為：酶切體系為puc57-pim)質(zhì)粒化g，10 X化StDigest 5 化，化L S化I，化L ClaI，加水至50化，37°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將約 1638bp的目的片段回收，測定濃度，存于-20°C，備用；
[0070] 3、應(yīng)用MluI (Fermentas)和NheI (Fermentas)酶切pPDNA載體，膠回收獲得線性化 的pPDNA載體片段，酶切體系為：酶切體系為pPDNA質(zhì)?；痝，10 X FastDigest扣L，化L MluI，化L NheI，加水至50化，37°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，巧U 定濃度，存于-20°C，備用；
[0071 ] 4、連接上述b、c兩步獲得的產(chǎn)物，連接體系：1化T41igase巧ermen化S)，化L 10 X T41igase Buffer(F'ermentas)，線性化的pPD NA載體片段30ng，UG-BsmbI-gRNA片段30ng， 加水至10化，16 °C過夜連接。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細胞DH5a進行轉(zhuǎn)化，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì) 粒并進行序列測定，得到pPDNA-gRNA載體。
[0072] 5、應(yīng)用XbaI (Fermentas)和Not I (Fermentas)酶切pX330載體，膠回收獲得cas9片 段，酶切體系為：酶切體系為陽330質(zhì)粒化g，10 X化StDigest扣L，化L XbaI,化L NotI,加 水至50化，37°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，測定濃度，存于-20°C， 備用；
[0073] 6、應(yīng)用XbaI (Fermen 化 S)和 NotI (Fermentas)酶切 pPDNA-gRNA 載體，膠回收獲得線 性化的pPDNA-gRNA載體片段，酶切體系為：酶切體系為pPDNA-gRM質(zhì)?；痝，10X 化StDigest扣L，化L XbaI，化L NotI，加水至50化，37 °C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝 膠電泳，切膠回收，測定濃度，存于-20°C，備用；
[0074] 7、連接上述5、6兩步獲得的產(chǎn)物，連接體系：1化T41igase巧ermen化S)，化L 10 X T41 igase Buff er(F'ermen^s)，線性化的pPDNA-gRNA載體片段30ng，cas9片段60ng，加水至 1化L，16 °C過夜連接。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細胞D冊a進行轉(zhuǎn)化，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進 行序列測定，得到PPDNA330載體，載體序列見序列表，載體示意圖見說明書附圖1。
[0075] 二、祀向敲除基因克隆載體的構(gòu)建：
[0076] 祀向多物種ALK6的gRNA寡核巧酸的設(shè)計及載體構(gòu)建。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載多物種 ALK6基因的核巧酸序列，并進行同源比對。同源比對結(jié)果見說明書附圖2和說明書附圖3。根 據(jù)gRNA的PAM設(shè)計原則及同源比對的結(jié)果，合成了 ALK6-1和ALK6-2共2對引物，引物序列分 別為，載體構(gòu)建具體步驟如下：
[0077] 1、合成ALK6祀序列1 :5'-ATGATAGAAGAAGATGACTC-3'，其中上游序列5'- ACCGATGATAGAAGAAGATGACTC-3 '，其互補序列5 ' -AAACGAGTCATCTTCTTCTATCAT-3 ' ；祀序列2: 5 ' -GGATCAGGCCTCCCTCTGC-3 '，其中上游序列5 ' -ACCGGGATCAGGCCTCCCTCTGC-3 '，其互補序 列5 ' -AAACACAGAGGGAGGCCTGATCC-3 '，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。溶解 后，各取4.扣L，再加入化L IOXLA PCR Buffer(^kara)，混勻，95°C加熱lOmin，然后置于 室溫化，形成帶有BsmBI粘性末端的DNA雙鏈；
[0078] 2、酶切PPDNA330質(zhì)粒，酶切體系為PPDNA330質(zhì)?；痝，10X肥B Buffers化L，0.化 L BsmBI，加水至20化，55°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，測定濃度， 存于-20°C，備用；
[0079] 3、連接上述a、b兩步獲得的產(chǎn)物，連接體系：1化酶切PPDNA330質(zhì)粒，酶切體系為 PPDNA330質(zhì)粒化g，10X肥B Buffers化L，0.化L BsmBI,加水至20化，55°C解育化；將酶切 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，測定濃度，存于-20°C，備用，2化10XT41igase Buffer(Fermentas) ,BsmBI酶切的pPDNA330載體30ng，祀序列及其互補序列形成的雙鏈 DNA化L，加水至20化，16 °C過夜連接。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細胞D冊a進行轉(zhuǎn)化，擴大培養(yǎng)， 提取質(zhì)粒并進行序列測定，得到PPDNA330-ALK6-1和PPDNA330-ALK6-2載體。
[0080] S、基因敲除效率的驗證
[0081 ] 1、祀序列敲除效率驗證報告載體RGS-CR購自ToolGen,使用限制性內(nèi)切酶EcoR巧口 Ba恤I對RGS載體進行線性化，酶切體系為：RGS質(zhì)?；痝，10 X Buf ferK化L，0.化L EcoRI， 0.扣L BamHI，加水至20化，37°C解育化;將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段切膠回 收，測定濃度，存于-20°C，備用。
[0082] 2、合成ALK6的2條祀序列對應(yīng)的RGS-邸報告載體序列#40(6-1和#40(6-2共2對引 物，其中#ALK6-1的上游引物序列為5 ' -AATTCGATGATAGAAGAAGATGACTCTGGG-3 '，下游引物序 列為5 ' -GATCCCCAGAGTCATCTTCTTCTATCATCG-3 '，#ALK6-2的上游引物序列為5 ' - AATTCGCGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGG-3 '，下游引 物序列為5 ' - GATCCCCAGCAGAGGGAGGCCTGATCCGCG-3 '，引物溶解成 1 OOiiM濃度后，經(jīng)95°C處理 15min，而后 自然降溫過夜退火，分別得到2條帶有EcoRI和BamHI粘性末端的DNA雙鏈退火產(chǎn)物。
[0083] 3、T4連接RGS線性化產(chǎn)物和DNA雙鏈退火產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取單菌落培養(yǎng)， 去內(nèi)毒提取重組質(zhì)粒，并通過測序驗證質(zhì)粒，獲得RGS-#ALK6-1和RGS-#ALK6-2重組質(zhì)粒。
[0084] 4、轉(zhuǎn)染前一天，傳代HEK-293T細胞于4個35mm的培養(yǎng)皿中。
[0085] 5、轉(zhuǎn)染當天，準備4個1.5mL的離屯、管，每個管中分別加入100化的含10%FBS的 DMEM，再添加質(zhì)粒；其中，1號管中力日500ng的pPDNA330-ALK6-l，100ng的RGS-#ALK6-1;2號管 中加 500ng 的 pPDNA330，100ng 的 RGS-#ALK6-1;3 號管中加 500ng 的 pPDNA330-ALK6-2，100ng 的RGS-#ALK6-2; 4號管中加500ng的PPDNA330，IOOng的RGS-#ALK6-2;最后每個管中加入化L 的羅氏轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜止15min后，將混合液分別加入4個35mm的培養(yǎng)皿，并于37 °C、 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4化觀察巧光表達情況(見說明書附圖4)。巧光顯示，PPDNA330-ALK6- 2的綠色巧光的表達明顯多于陰性對照PPDNA330,表明PPDNA330-ALK6-2能有效地引起 DSBs,造成ALK6基因突變。
[0086] 四、篩選出作用效果更好的表達載體，對人和牛的細胞進行轉(zhuǎn)染，敲除ALK6基因。
[0087] 1、轉(zhuǎn)染前一天，人化Ia細胞培養(yǎng)于35mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10%進口胎牛血 清(FBS)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C，5%的C02，轉(zhuǎn)染當天，按照Life 3000試劑盒說明書導(dǎo)入2 iig的PPDNA330-ALK6-2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后4她，膜酶消化收集細胞，并提取細胞基因組。
[008引 2、合成人ALK6基因敲除檢測引物hALK6，其中上游引物5 ' -TTTACTTGGGAAACCATAACTA- 3 '，下游引物5 '-TGGATTGTAACCATACACCTAC-3 '，擴增長度為517bp，WpPDNA330-ALK6-2質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染的細胞基因組為模板，進行PCR擴增，PCR體系為：10化2 X於im熱書\及@HS (PremiX) (Takara)，DNA模板化L，上下游引物各0.扣L，水補至20化。反應(yīng)程序:95 °C預(yù)變性5min，35循 環(huán)(95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec)，72°C再延伸7min，4°C終止反應(yīng)。取上 述PCR反應(yīng)的扣L PCR產(chǎn)物，直接進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，時間約30min。將PCR 產(chǎn)物切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，進行測序，PCR擴增產(chǎn)物連接入pEASY-Tl載體中， 并通過挑取單克隆細菌，測序，對ALK6基因突變進行檢測，結(jié)果表明PPDNA330-ALK6-2能有 效地對人化Ia細胞ALK6基因進行編輯(檢測結(jié)果見說明書附圖5)。
[0089] 3、水牛成纖維細胞培養(yǎng)于60mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10%進口胎牛血清(FBS) 的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C，5 %的C02，電轉(zhuǎn)當天，膜酶消化收集細胞，通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入化g的 PPDNA330-ALK6-2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后4她，收集細胞并提取細胞基因組。
[0090] 4、合成水牛ALK6基因敲除檢測引物bufALK6，其中上游引物5 ' -GCATTGGGTTAGAACAGGAT- 3 '，下游引物5 ' -CCTTTGTCCACTGCCCTA-3 '，擴增長度為 196bp，WpPDNA330-ALK6-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 的細胞基因組為模板，進行P C R擴增，P C R體系為：10化2 X P ri m CS TA R及H S (P r e m i X) (Takara)，DNA模板化L，上下游引物各0.扣L，水補至20化。反應(yīng)程序:95 °C預(yù)變性5min，35循 環(huán)(95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec)，72°C再延伸7min，4°C終止反應(yīng)。取上 述PCR反應(yīng)的扣L PCR產(chǎn)物，直接進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，時間約30min。將PCR 產(chǎn)物切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，進行測序，PCR擴增產(chǎn)物連接入pEASY-Tl載體中， 并通過挑取單克隆細菌，測序，對ALK6基因突變進行檢測，結(jié)果表明PPDNA330-ALK6-2能有 效地對人化Ia細胞ALK6基因進行編輯(檢測結(jié)果見說明書附圖6)。
[0091] 綜上所述，本發(fā)明通過同源對比選擇不同物種控制ALK6基因的兩對同源性最高的 祀序列，利用CRISPR-Casg編輯系統(tǒng)構(gòu)建帶有祀序列基因的重組質(zhì)粒，通過巧光蛋白表達法 檢測能對敲除試驗結(jié)果進行精確分析，構(gòu)建了并選擇了能祀向敲除ALK6基因的重組載體， 通過轉(zhuǎn)染人的化Ia細胞和水牛的成纖維細胞，驗證了該方法能適用于不同物種，甚至多物 種ALK6基因的敲除。本發(fā)明的方法具有打祀率高、準確、簡單、高效、具有普適性的特點，有 效的提高了基因敲除效率和準確性。
[0092] 上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細說明，但實施例并非用W限定本發(fā) 明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬 于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： (1) 構(gòu)建 PPDNA330-ALK6-1 和 pPDNA330-ALK6-2 載體，構(gòu)建方法如下： A. 從基因數(shù)據(jù)庫中下載多物種ALK6基因的核苷酸序列，并進行同源比對選取兩對靶序 列，分別為ALK6靶序列 I : 5 ' -ATGATAGAAGAAGATGACTC-3 ' 和ALK6靶序列2 : 5 ' -GGATCAGGCCTCCCTCTGC-3'； B. 根據(jù)同源對比結(jié)果和gRNA的PAM設(shè)計原則，合成兩對與靶序列不同，表達的蛋白相 同，帶有相同BsmBI粘性末端的DNA雙鏈，分別命名為:ALK6-1和ALK6-2; C. 用BsmBI酶切pPDNA330質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，再進行切膠回收； D. 用連接酶將ALK6-1和ALK6-2分別與BsmB頂每切后的pPDNA330質(zhì)粒進行連接，得到重 組質(zhì)粒載體，分別命名為:pPDNA330-ALK6-l和pPDNA330-ALK6-2; (2) 對重組質(zhì)粒載體pPDNA330-ALK6-l和pPDNA330-ALK6-2進行敲除效率的篩選驗證、 對比，選擇ALK6基因敲除效率更高的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染受體細胞； (3) 轉(zhuǎn)染不同物種的受體細胞，收集轉(zhuǎn)染之后的受體細胞，并提取細胞基因組進行測 序，根據(jù)基因組測序結(jié)果合成檢測引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接入pEASY-Tl載體，挑取 單克隆細菌，進行測序，對ALK6基因敲除表達結(jié)果進行檢測。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述ALK6-1 的上游序列為，5 ' -ACCGATGATAGAAGAAGATGACTC-3 '，下游序列為，5 ' -AAACGAGTCATCTTCTTCTATCAT-3 ' ；ALK6-2的上游序列5 ' -ACCGGGATCAGGCCTCCCTCTGC-3 '，下 游序列為，5' -AAACACAGAGGGAGGCCTGATCC-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述PPDNA330質(zhì)粒構(gòu)建方法如下： (1) 優(yōu)化puro基因，去除其編碼區(qū)內(nèi)的酶切位點，但不改變其氨基酸組成:應(yīng)用StuI和 Cla頂每切puc57-pur〇，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠，回收獲得puro基因； (2) 應(yīng)用StuI和bspll9頂每切pcDNA3.1，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切凝膠，回收 獲得線性化的pcDNA3.1片段； (3) 用T4連接酶將puro基因和pcDNA3.1片段進行連接得到pPDNA載體； (4) 人工合成U6-Bsmb I-gRNA序列，片段位于puc57載體中； (5) 用MluI和NheI酶切puC57-U6-Bsmb I-gRNA，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切凝 膠，回收獲得U6-Bsmb I-gRNA片段； (6) 用MluI和NheI酶切pPDNA載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，再進行切膠回收 獲得線性化的PPDNA載體片段； (7) T4連接上述U6-Bsmb I-gRNA片段和pPDNA載體片段，得到pPDNA-gRNA載體； (8) 用XbaI和NotI酶切pX330載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，再進行切膠回收 獲得cas9片段； (9) 用XbaI和No?酶切pPDNA-gRNA載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，再進行切膠 回收獲得線性化的pPDNA-gRNA載體片段； (10 )T4連接上述cas9片段和線性化的pPDNA-gRNA載體片段得到pPDNA330載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述重組質(zhì)粒載體PPDNA330-ALK6-1和pPDNA330-ALK6-2敲除效率的篩選驗證選用熒光蛋白 表達法進行驗證，具體方法如下： (1) 利用RGS-CR做為驗證報告載體:使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對驗證報告載 體RGS-CR進行線性化； (2) 合成與ALK6靶序列1和ALK6靶序列2對應(yīng)的兩條帶有EcoR I和BamH I粘性末端的 DNA雙鏈，分別命名為：#ALK6-0P#ALK6-2; 其中，MLK6-1 引物的上游序列為:5 '-AATTCGATGATAGAAGAAGATGACTCTGGG-3 '， 下游序列為：5 ' -GATCCCCAGAGTCATCTTCTTCTATCATCG-3 ' ； #ALK6-2引物的上游序列為：5 '-AATTCGCGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGG-3 '， 下游序列為:5 ' -GATCCCCAGCAGAGGGAGGCCTGATCCGCG-3 ' ； (3) 采用T4連接酶將步驟（1)的RGS-CR線性化產(chǎn)物和步驟(2)帶有EcoR I和BamH I粘性 末端的#ALK6-0P#ALK6-2兩對DNA雙鏈進行連接得到重組質(zhì)粒載體，分別命名為：RGS_# ALK6-1 和 RGS-MLK6-2; (4) 取傳代的HEK-293T細胞于4個培養(yǎng)皿中； (5) 取4個離心管編號為1、2、3、4,每個管分別加入含F(xiàn)BS的DMEM; (6) 然后在 1 號管加 pPDNA33〇-ALK6_l和RGS-MLK6-I，2號管加 Pl3DNA33O和RGS-#ALK6_ 1，3號管加 pPDNA330-ALK6-2 和 RGS-#ALK6-2，4 號管加 pPDNA330 和 RGS-#ALK6-2;最后在每個 管中加入羅氏轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置后，將混合液分別加入培養(yǎng)皿，并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng)完成后在焚光顯微鏡下觀察目的基因的焚光表達情況。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述受體細胞選用人的Hela細胞或水牛的成纖維細胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述檢測引物選用人或水牛的ALK6-2基因的上、下游序列做為檢測引物，人ALK6-2基因檢測 引物命名為：hALK6，hALK6上游序列為5 ' -TTTACTTGGGAAACCATAACTA-3 '，下游序列為5 ' -TGGATTGTAACCATACACCTAC-3 '，擴增長度為517bp ;水牛的ALK6-2基因檢測引物命名為： bufALK6，bufALK6上游序列為5 ' -GCATTGGGTTAGAACAGGAT-3 '，下游序列為5 ' -CCTTTGTCCACTGCCCTA-3'，擴增長度為 196bp。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述任意一項應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征 在于，所述應(yīng)用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法可用于人或水牛的ALK6基因敲除。
【文檔編號】C12N15/65GK105925608SQ201610471338
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】朱鵬, 梁賢威, 龐春英, 鄧廷賢, 段安琴, 陸杏蓉
【申請人】廣西壯族自治區(qū)水牛研究所