本發(fā)明涉及囊性纖維化患者的cftr基因突變形式及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

囊性纖維化(cysticfibrosis，cf)是一種常染色體隱性遺傳病，是由于囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，cftr)的基因突變導(dǎo)致大量黏液阻塞全身外分泌腺，可累及呼吸、消化、生殖等多系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽、咯大量黏痰、反復(fù)發(fā)作的肺部感染、脂肪瀉、生長發(fā)育遲緩及男性不育等。

囊性纖維化首要累及的器官是肺，而肺部病變也是囊性纖維化患者的最主要的致死因素(85％)。囊性纖維化造成氣道粘膜分泌物稠化，通過慢性阻塞、感染、炎癥，最終導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張和肺實(shí)質(zhì)破壞。胰腺也是囊性纖維化的重要受累器官，患者主要表現(xiàn)為胰腺外分泌功能障礙：營養(yǎng)障礙(脂肪、蛋白質(zhì)吸收障礙、脂肪瀉、生長遲滯)，胰腺功能不全所致低體重和肺功能及生存率呈負(fù)相關(guān)，是預(yù)后不良的重要因素?；颊咭嗫捎衅渌到y(tǒng)表現(xiàn)，如肝臟腫大、肝硬化、黃疸等。因此當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)表現(xiàn)時(shí)，更應(yīng)警惕囊性纖維化。

囊性纖維化在發(fā)達(dá)國家高加索人群中的流行病學(xué)研究較為完善，是高加索人群中最常見的遺傳性疾病之一，發(fā)病率約為1/1800至1/25000。亞洲囊性纖維化發(fā)病率的數(shù)據(jù)主要來自回顧性研究或病例研究，并不能十分準(zhǔn)確、客觀地描述囊性纖維化在亞洲人群準(zhǔn)確的發(fā)病率，其發(fā)病率很可能被低估。1975年-2015年報(bào)道的文獻(xiàn)中，共記載了36例囊性纖維化患者。近10年，中國大陸報(bào)道的囊性纖維化患者為13例。由于病例數(shù)較少，我國目前尚無該病發(fā)病情況的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

基因檢測作為一種安全、快速、易行的手段在囊性纖維化診斷中也有著重要作用。對于臨床表現(xiàn)不典型和/或汗液試驗(yàn)陰性(或臨界值)的患者可通過基因檢測進(jìn)行確診。囊性纖維化在我國的可能并非罕見，患者臨床表現(xiàn)不典型，但如提高對疾病的認(rèn)識，仍可通過臨床表現(xiàn)和相關(guān)輔助檢查發(fā)現(xiàn)高度懷疑的病例，進(jìn)而通過基因檢測快速地做出正確的判斷。我國cftr基因與歐美國家報(bào)道大為不同且具有很高的異質(zhì)性，因此關(guān)于cftr基因突變譜及與臨床表型關(guān)系還需要進(jìn)一步完善。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供囊性纖維化患者的cftr基因突變形式及其應(yīng)用。

本發(fā)明保護(hù)一種蛋白質(zhì)，為如下(a1)或(a2)：

(a1)將囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子第314位氨基酸殘基由甘氨酸(gly)突變?yōu)樯彼?trp)得到的蛋白質(zhì)；

(a2)將囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子第604位氨基酸殘基由蘇氨酸(thr)突變?yōu)楦彼?pro)得到的蛋白質(zhì)。

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子具體如序列表的序列1所示。

編碼所述蛋白質(zhì)的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述基因?yàn)槿缦?b1)或(b2)：

(b1)編碼區(qū)為將序列表的序列2所示的dna分子第940位核苷酸由g突變?yōu)閠得到的dna分子；

(b2)編碼區(qū)為將序列表的序列2所示的dna分子第1810位核苷酸由a突變?yōu)閏得到的dna分子。

本發(fā)明還保護(hù)用于檢測特異突變甲的物質(zhì)和/或用于檢測特異突變乙的物質(zhì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述特異突變甲為：人基因組中序列表的序列3所示dna分子中的第71位核苷酸由g突變?yōu)閠；所述特異突變乙為：人基因組中序列表的序列4所示dna分子中的第44位核苷酸由a突變?yōu)閏；

所述試劑盒的功能為如下(c1)、(c2)或(c3)：

(c1)評價(jià)待測者患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性；

(c2)評價(jià)待測者或待測夫妻的后代患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性；

(c3)診斷或輔助診斷待測者是否為囊性纖維化患者。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括用于檢測所述特異突變甲的物質(zhì)和/或用于檢測所述特異突變乙的物質(zhì)；所述試劑盒的功能為評價(jià)待測者患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性。所述試劑盒還包括記載如下判斷標(biāo)準(zhǔn)(d1)和/或(d2)和/或(d3)的載體：(d1)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變甲，待測者相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高；(d2)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變乙，待測者相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高；(d3)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變甲，另一條染色體攜帶所述特異突變乙，待測者相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括用于檢測所述特異突變甲的物質(zhì)和/或用于檢測所述特異突變乙的物質(zhì)；所述試劑盒的功能為評價(jià)待測者的后代或待測夫妻的后代患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性。所述試劑盒還包括記載如下判斷標(biāo)準(zhǔn)(e1)和/或(e2)和/或(e3)和/或(e4)的載體：(e1)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變甲，待測者的后代相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高；(e2)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變乙，待測者的后代相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高；(e3)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變甲，另一條染色體攜帶所述特異突變乙，待測者的后代相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高；(e4)如果所述待測夫妻中的一位攜帶所述特異突變甲、另一位攜帶所述特異突變乙，待測夫妻的后代相對正常人患囊性纖維化的風(fēng)險(xiǎn)性增高。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括用于檢測所述特異突變甲的物質(zhì)和/或用于檢測所述特異突變乙的物質(zhì)；所述試劑盒的功能為診斷或輔助診斷待測者是否為囊性纖維化患者。所述試劑盒還包括記載如下判斷標(biāo)準(zhǔn)(f1)和/或(f2)和/或(f3)的載體：(f1)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變甲，待測者為或候選為囊性纖維化患者；(f2)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變乙，待測者為或候選為囊性纖維化患者；(f3)如果待測者一條染色體攜帶所述特異突變甲，另一條染色體攜帶所述特異突變乙，待測者為或候選為囊性纖維化患者。

所述正常人為兩條染色體均攜帶序列表的序列1所示的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的編碼基因的人。

所述序列表的序列1所示的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的編碼基因具體如序列表的序列2所示。

所述序列表的序列1所示的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的編碼基因具體如genbankaccessionno.ng_016465.4所示(linearpri28-aug-2016)。

以上任一所述用于檢測所述特異突變甲的物質(zhì)具體可為引物對甲。引物對甲由兩條引物組成，一條引物為序列表的序列7所示的單鏈dna分子，另一條引物為序列表的序列8所示的單鏈dna分子。

以上用于檢測所述特異突變乙的物質(zhì)具體可為引物對乙。引物對乙由兩條引物組成，一條引物為序列表的序列9所示的單鏈dna分子，另一條引物為序列表的序列10所示的單鏈dna分子。

本發(fā)明對于囊性纖維化患者的診斷具有重大應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為胸部ct的照片。

圖2為患兒父親的相關(guān)測序結(jié)果。

圖3為患兒母親的相關(guān)測序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

基因組中，cftr基因的核苷酸序列見genbankaccessionno.ng_016465.4所示(linearpri28-aug-2016)。

cftr基因編碼的蛋白質(zhì)，如序列表的序列1所示。

cftr基因的cdna中的讀碼框如序列表的序列2所示。

基因組中，cftr基因包括27個(gè)外顯子，其中第8外顯子的核苷酸序列如序列表的序列3所示，第14外顯子的核苷酸序列如序列表的序列4所示?；蚪M中，cftr基因的第8外顯子及其周邊序列如序列表的序列5所示，cftr基因的第14外顯子及其周邊序列如序列表的序列6所示。

實(shí)施例、

一、患兒的相關(guān)信息

患兒基本情況：女，13歲，于2014年5月因“反復(fù)咳嗽、咯痰7年余”入院。

患兒病程：入院前7年患兒無明顯誘因出現(xiàn)不劇烈咳嗽，伴咯痰、發(fā)熱，無喘憋、發(fā)紺、呼吸困難，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷“右下肺炎”，予靜脈藥物治療，咳嗽、咯痰好轉(zhuǎn)；此后每間隔1-2月患兒即出現(xiàn)上述癥狀，夜間及晨起為著，痰液多為黃色粘痰，不易咯出，伴喘息，無青紫，反復(fù)于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院靜脈輸注抗生素治療，癥狀可緩解；入院前2年，患兒咳嗽較前明顯加重，痰量較前增多，為黃綠色粘痰，并出現(xiàn)活動(dòng)后氣促，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院胸片、胸部ct提示雙肺支氣管擴(kuò)張伴感染，予中藥口服治療癥狀稍有好轉(zhuǎn)；入院前10月，患兒咯少量新鮮血絲痰，抗感染治療后好轉(zhuǎn)；發(fā)病以來，患兒食欲可，大小便正常，既往體健，生長發(fā)育正常。

患兒父母及家族情況：父母非近親結(jié)婚,家族中無類似病人。

2014年5月入院查體結(jié)果：體溫37℃，體重29kg，身高147cm，呼吸27次/min，脈搏106次/min，血壓90/60mmhg，體格發(fā)育稍落后，營養(yǎng)差，卡疤(+)，雙肺呼吸音粗，雙下肺可聞及中量濕羅音，未聞及喘鳴銀，杵狀指(趾)陽性，余查體無明顯異常。

2014年5月輔助檢查結(jié)果：血?dú)夥治?、血常?guī)、血電解質(zhì)、肝腎功能、大便常規(guī)、體液、細(xì)胞免疫功能正常；多次痰培養(yǎng)及支氣管灌洗液培養(yǎng)均為銅綠假單胞菌；胸部ct(圖1)提示雙肺廣泛支氣管柱狀及囊柱狀擴(kuò)張、支氣管增厚；鼻竇ct提示雙側(cè)副鼻竇炎；腹部b超可見胰腺回聲不均勻，考慮慢性胰腺炎；支氣管鏡檢查顯示氣管、支氣管內(nèi)膜炎癥，廣泛粘稠分泌物阻塞，部分亞支擴(kuò)張；肺功能提示混合性通氣功能障礙。

2014年5月治療過程：入院后先后予拉氧頭孢、頭孢哌酮舒巴坦靜點(diǎn)抗感染治療，行2次電子支氣管鏡灌洗治療，咳嗽、咯痰癥狀好轉(zhuǎn)，治療13天好轉(zhuǎn)出院。

二、患兒的cftr基因測序

1、提取患兒的基因組dna。

2、取步驟1得到的基因組dna，進(jìn)行二代測序，患兒的cftr基因發(fā)生了復(fù)雜雜合突變，一條染色體中的cftr基因發(fā)生了940g>t突變(相應(yīng)氨基酸突變?yōu)間ly314trp)、其它位置均未發(fā)生突變，另一條染色體中的cftr基因發(fā)生了1810a>c突變(相應(yīng)氨基酸突變位點(diǎn)為thr604pro)、其它位置均未發(fā)生突變。

940g>t突變即基因組中cftr基因的第8外顯子的第71位核苷酸由g突變?yōu)榱藅。

1810a>c突變即基因組中cftr基因的第14外顯子的第44位核苷酸由a突變?yōu)榱薱。

綜合步驟一的病癥和步驟二的測序結(jié)果，該患兒確診為囊性纖維化患者。

三、患兒父母的cftr基因測序

1、分別提取患兒的父親和母親的基因組dna。

2、以步驟1得到的基因組dna為模板，分別采用引物對甲(f1和r1組成)和引物對乙(f2和r2組成)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將后分別將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

f1(序列表的序列7)：5’-ccatgctcagatcttccattcc-3’；

r1(序列表的序列8)：5’-cgcacatttttgcaaagttca-3’。

f2(序列表的序列9)：5’-tgctatcagaattcacaaggtaccaa-3’；

r2(序列表的序列10)：5’-acgctgatgcgaggcagtat-3’。

患兒父親的相關(guān)測序結(jié)果見圖2。圖2中，a和b分別為不同染色體上的相關(guān)突變區(qū)域的測序結(jié)果。

患兒母親的相關(guān)測序結(jié)果見圖3。圖3中，a和b分別為不同染色體上的相關(guān)突變區(qū)域的測序結(jié)果。

結(jié)果表明：患兒父親的一條染色體上的cftr基因發(fā)生了940g>t突變，另一條染色體上的cftr基因未發(fā)生突變；患兒母親的一條染色體上的cftr基因發(fā)生了1810a>c突變，另一條染色體上的cftr基因未發(fā)生突變；患兒獲得了父親cftr基因發(fā)生了940g>t突變的染色體和母親cftr基因發(fā)生了1810a>c突變的染色體，因此發(fā)生了囊性纖維化。

sequencelisting

<110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院

<120>囊性纖維化患者的cftr基因突變形式及其應(yīng)用

<130>gncyx170282

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>prt

<213>人

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