專利名稱：一種誘導(dǎo)纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地，涉及一種誘導(dǎo)纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法。
背景技術(shù)：
埃博霉素Gpothilone)是一類大環(huán)內(nèi)酯類化合物，從粘細菌亞目的纖維堆囊菌菌株發(fā)酵液中可以分離埃博霉素，其主要組分為Epothilone A和B。它與紫杉醇具有相同的抑制腫瘤細胞生長的作用機制，并且對多重耐藥腫瘤細胞和耐紫杉醇的腫瘤細胞均表現(xiàn)強大的抗癌活性。除具有活性方面的優(yōu)勢之外，埃博霉素具有較紫杉醇簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)和良好的水溶性，而且可以發(fā)酵法生產(chǎn)。埃博霉素分子結(jié)構(gòu)如下:
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法，其特征在于，包括如下步驟:酵菌種的制備:將纖維堆囊菌菌種培養(yǎng)至纖維堆囊菌生物量為0.8 1.2 XlO9CfVmL時，作為發(fā)酵菌種備用；酵培養(yǎng):將SI中的發(fā)酵菌種加入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中纖維堆囊菌生物量大于等于lO'fu/mL時進行停止發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵培養(yǎng)物；導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):在S2中的發(fā)酵培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)組合物進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，得誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)物； 離誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)物中的埃博霉素； 其中，S3中所述的誘導(dǎo)組合物包含如下重量百分比的組分: 5 15%甘油、I 10%色氨酸、Γ10%半胱氨酸、I 5%酪氨酸、Γ10% 2，3 二氫吡喃和Γιο%酵母提取物； S3中所述的誘導(dǎo)組合物的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)物的廣10 (體積)％; S3中所述的誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)條件為:控制溫度32 35°C，PH7.2 .5，在攪拌、通氣、光照條件下培養(yǎng)12 36h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述的誘導(dǎo)組合物包含 如下重量百分比的組分: 8^12%甘油、4 8%色氨酸、3 7%半胱氨酸、f 3%酪氨酸、3 7% 2，3 二氫吡喃和2飛％酵母提取物； 所述的誘導(dǎo)組合物的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)物的3 7 (體積)％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)組合物包含如下 重量百分比的組分: 10%甘油、5%色氨酸、5%半胱氨酸、2%酪氨酸、5%2，3 二氫吡喃、4%酵母提取物； 所述的誘導(dǎo)組合物的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)物的5 (體積)％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述的發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)方法為:將SI中制備得到的發(fā)酵菌種按5 10 (體積)％的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度在25 30°C、PH 6.8^7.0，攪拌，通氣，培養(yǎng)至發(fā)酵液中纖維堆囊菌生物量大于等于10lclcfu/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下重量百分比的組分: Γ5%紙漿液、Γ2%馬鈴薯淀粉、Γ2%蛋白胨、Γ2%玉米漿、Γ2%葡萄糖、0.Γ0.2%磷酸氫二鉀、0.Γο.2%CaCl2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，SI中所述的發(fā)酵菌種的制備，制備方法為:將纖維堆囊菌菌種在25 3(TC溫度范圍內(nèi)，置于固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，4(T50h后，挑選生長均勻、呈橙色的菌落苔，轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中，在25 3(TC溫度范圍內(nèi)、振蕩培養(yǎng)至纖維堆囊菌生物量為0.8 1.2X 109cfu/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的固體培養(yǎng)基包含15 30mg/L卡那霉素B以及如下重量百分比的組分: Γ5%紙漿液、Γ2%馬鈴薯淀粉、Γ2%蛋白胨、Γ2%玉米漿、0.Γ0.2%磷酸氫二鉀、瓊脂粉 1.5 2.0%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液體培養(yǎng)基包含如下重量百分比的組分: 1~5%紙漿液、1~2%馬鈴薯淀粉、1~2%蛋白胨、1~2%玉米漿、0.1~0.2%磷酸氫二鉀。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S4中所述的分離誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)物中的埃博霉素，分離方法如下:誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)物中添加大孔吸附樹脂組合物進行吸附埃博霉素，繼續(xù)培養(yǎng)8 16h ；養(yǎng)結(jié)束后用水清洗大孔吸附樹脂，上柱，先用1~5倍柱體積的10~30(質(zhì)量)％的乙醇清洗雜質(zhì)，再用80~100 (質(zhì)量)%的乙醇洗脫，濃縮干燥的埃博霉素結(jié)晶粗品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9 所述的方法，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂為MD-301大孔吸附樹脂、D4020大孔吸附樹脂和XD-5大孔吸附樹脂中的一種或其混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物微生物發(fā)酵領(lǐng)域，公開了一種誘導(dǎo)纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法。該方法包含如下制備步驟S1.將纖維堆囊菌菌種培養(yǎng)至纖維堆囊菌生物量為0.8~1.2×109cfu/mL時，作為發(fā)酵菌種備用；S2.將S1中的發(fā)酵菌種加入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中纖維堆囊菌生物量大于等于1010cfu/mL時進行停止發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵培養(yǎng)物；S3.在S2中的發(fā)酵培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)組合物進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，得誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)物；S4.分離誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)物中的埃博霉素。本發(fā)明采用的多因素誘導(dǎo)纖維堆囊菌高效表達埃博霉素，埃博霉素的單位表達量明顯提高。
文檔編號C12R1/01GK103088084SQ201310035548
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者杜少平, 夏楓耿, 石笛, 戴南藝, 黃魁英, 趙培靜, 秦鵬, 藍碧鋒, 張競立, 陳勉華 申請人:廣州市微生物研究所