一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素b的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，屬于微生物發(fā)酵制藥領(lǐng)域。采用的技術(shù)方案為：纖維堆囊菌菌株由搖瓶培養(yǎng)后逐級放大，發(fā)酵纖維堆囊菌，再經(jīng)大孔樹脂吸附、乙酸乙酯解析、甲醇復(fù)溶，得粗品；粗品經(jīng)柱層析、HPLC分析得到埃博霉素B的初步組分，再加入分子印跡聚合物特異性吸附埃博霉素B，最后經(jīng)甲醇洗脫、結(jié)晶，得到埃博霉素B。本發(fā)明通過逐級發(fā)酵生產(chǎn)纖維堆囊菌，同時(shí)在分離提取過程中采用具備特異性靶向吸附能力的分子印跡聚合物，不僅對埃博霉素B具有很強(qiáng)的吸附力，而且可以很容易地將埃博霉素B萃取出來，從而降低了分離提取埃博霉素藥物的生產(chǎn)成本，具有更廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵制藥領(lǐng)域，涉及一種埃博霉素B的提取方法，具體涉及一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]埃博霉素Gpothilone)是一類大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有多種生物活性，可以作為抗生素藥物，由德國國家生物技術(shù)中心(GBF)的G.H0fle等人于1993年首次報(bào)道。從粘細(xì)菌亞目的纖維堆囊菌菌株發(fā)酵液中可以分離埃博霉素，其主要組分為Epothilone A和B。
[0003]不久以后，Merck實(shí)驗(yàn)室在對7000種天然提取產(chǎn)物篩選紫杉醇類似物實(shí)驗(yàn)中，再次發(fā)現(xiàn)了埃博霉素。并且發(fā)現(xiàn)它具有與紫杉醇相同的作用機(jī)制，可以促進(jìn)GTP(三磷酸鳥苷)依賴性微管蛋白聚合形成微管，并且對微管有穩(wěn)定作用。微管是B—微管蛋白異二聚物的聚合物，需要解聚以形成有絲分裂紡錘體，而埃博霉素則是通過穩(wěn)定微管組裝過程抑制其解聚，抑制有絲分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，甚至誘導(dǎo)其死亡。證明了埃博霉素對腫瘤細(xì)胞有抑制作用的這個(gè)事實(shí)。
[0004]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，埃博霉素具有比紫杉醇優(yōu)越的抗腫瘤特性，主要體現(xiàn)在以下四個(gè)方面:①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，結(jié)構(gòu)簡單，有利于化學(xué)合成埃博霉素及結(jié)構(gòu)衍生化；②埃搏霉素沒有紫杉醇細(xì)胞內(nèi)毒素活性與紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表達(dá)型的多藥耐藥性細(xì)胞中也維持很大的細(xì)胞毒性；④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人類細(xì)胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性，而埃博霉素A往往比紫杉醇的活性更低。另外，埃博霉素對一株多藥耐藥性直腸癌系和紫杉醇抗性卵巢癌系仍然具有敏感性。
[0005]然而，有關(guān)纖維堆囊菌的發(fā)酵條件及活性物質(zhì)合成條件的研究報(bào)道很少，這一方面反映了纖維堆囊菌研究的困難；另一方面也是全球研究粘細(xì)菌生物活性物質(zhì)合成的實(shí)驗(yàn)室太少的緣故。研究粘細(xì)菌，尤其是纖維堆囊菌的生長和次級代謝的條件對于開發(fā)粘細(xì)菌資源具有重要的意義。
[0006] 目前通過發(fā)酵法制備埃博霉素B的方法成本高，培養(yǎng)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)中埃博霉素B產(chǎn)率低，生產(chǎn)波動(dòng)性大，最高只占22%，有的甚至只有痕跡量。并且對于從發(fā)酵液中分離提純埃博霉素B，目前一直采用哥特(Gerth)等人的方法。該方法包括樹脂吸附，硅膠柱梯度分離，分子篩層析和高效液相色譜分離四步，其存在著一定的缺陷，步驟過于繁瑣，使得操作的效率較低而過程費(fèi)用較高，產(chǎn)物的得率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，該方法操作簡單，環(huán)境友好，成本低，采用該方法制得的埃博霉素B收率高、純度高。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):[0009]一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0010]I)將纖維堆囊菌菌株搖瓶培養(yǎng)72_96h，將得到的搖瓶菌種液接種至一級種子罐中一級放大培養(yǎng)72-96h，將得到的一級菌種液接種至二級種子罐中二級放大培養(yǎng)72-96h，將得到的二級菌種液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中三級放大發(fā)酵培養(yǎng)12-96h后，得到發(fā)酵液；
[0011]2)向發(fā)酵液中加入發(fā)酵液總體積1%~5%的大孔吸附樹脂，調(diào)節(jié)pH值至7.0~7.4后，繼續(xù)培養(yǎng)100-150h后，停止發(fā)酵；
[0012]3)收集步驟2)發(fā)酵結(jié)束后的液體中的大孔吸附樹脂，用大孔吸附樹脂3~5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，濃縮，得到含有埃博霉素B的粗提物；
[0013]4)將含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后，離心，將上清液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行分離，用HPLC進(jìn)行檢測，合并含有埃博霉素B的組分，得到埃博霉素B分離液；
[0014]5)向埃博霉素B分離液中加入該分離液總體積2%~5%的分子印跡聚合物,搖床處理18~30h后，用甲醇進(jìn)行洗脫，收集甲醇洗脫液；
[0015]6)將甲醇洗脫液濃縮后，得到濃縮液，將濃縮液低溫結(jié)晶處理，析出的白色結(jié)晶即
為埃博霉素B。
[0016]步驟I)所述的搖瓶、一級種子罐和二級種子罐中所用的培養(yǎng)基均為M26液體培養(yǎng)基，成分為:土豆淀粉7.5~8.0g/L,大豆蛋白胨1.5~2.0g/L,葡萄糖1.5~2.0g/L,酵母粉 1.5 ~2.0g/L, MgSO4.7Η201.0 ~1.2g/L, CaCl2L O ~1.2g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素lmL/L，pH值為7.2 ；
[0017]所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基成分為:土豆淀粉2.5~3.0g/L,鹿糖0.7~1.0g/L,葡萄糖 0.2 ~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7H202.3 ~2.5g/L, CaCl23.0 ~3.5g/L,EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0018]步驟I)所述的搖瓶中的培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180~220rpm ;所述的一級種子罐、二級種子罐及發(fā)酵罐中的培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150~200rpm，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.04~0.1 kg/cm2 ;步驟2)加入大孔吸附樹脂后，轉(zhuǎn)速調(diào)整至120~150rpm。
[0019]步驟2)所述的大孔吸附樹脂為XAD-16型大孔吸附樹脂。
[0020]步驟2)所述的大孔吸附樹脂在使用前經(jīng)過預(yù)處理，包括:先用3~5倍柱體積的甲醇浸泡大孔吸附樹脂，搖床震蕩12~24h后，去除甲醇，水洗至無醇味，再用甲醇浸泡12~24h后,水洗至無醇味,備用。
[0021]步驟3)所述的洗脫時(shí)間為18~32h，所述的濃縮是將乙酸乙酯洗脫液在40~45°C下，真空度為-0.09~-0.085MPa的條件下，真空濃縮至干。
[0022]步驟4)所述的葡聚糖凝膠柱層析選用Sephadex LH-20層析柱,流動(dòng)相選用甲醇，上樣量為柱體積的1%~2%，流動(dòng)相流速為8~12mL/min，展開距離為7.2~7.8cm/h。
[0023]步驟4)所述的離心是在15~25°C下，5000~1000Orpm,離心10~20min。
[0024]步驟5)所述的分子印跡聚合物是埃博霉素B分子印跡聚合物。
[0025]步驟6)所述的濃縮是將甲醇洗脫液在40~45°C下，真空度為-0.09~-0.085MPa的條件下，真空濃縮至甲醇洗脫液體積的1/10 ;所述的低溫結(jié)晶處理是將濃縮液在-20~-15°c下低溫處理至析出白色結(jié)晶。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0027]本發(fā)明一方面采用逐級放大的培養(yǎng)方式來發(fā)酵培養(yǎng)纖維堆囊菌，擴(kuò)大了菌株的生長，從而提高了埃博霉素B的產(chǎn)量，適用性強(qiáng)，適合于多種工業(yè)菌種，易于大規(guī)模生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中所產(chǎn)生的活性物質(zhì)中埃博霉素B產(chǎn)率低，生產(chǎn)波動(dòng)性大這一問題；另一方面，本發(fā)明用到一種具備特異性靶向吸附能力的聚合物——分子印跡聚合物，它不僅對埃博霉素B具有很強(qiáng)的吸附力，能夠簡化分離過程，而且可以很容易地將埃博霉素B萃取出來，直接進(jìn)行低溫結(jié)晶處理，即可得到產(chǎn)物，并且產(chǎn)物純度較高。同時(shí)分子印跡聚合物經(jīng)過干燥處理還可以重復(fù)使用，這樣就極大降低了分離提取埃博霉素藥物的生產(chǎn)成本，具有更廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明方法操作簡單、環(huán)境友好、適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0029]實(shí)施例1
[0030]一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0031]1、纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0032]搖瓶培養(yǎng):首先將纖維堆囊菌菌株ATCC25532接種到裝有M26液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在30°C，200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72h，得到搖瓶菌種液；
[0033]其中，所述的M26液體培養(yǎng)基的成分為:土豆淀粉7.5~8.0g/L，大豆蛋白胨
1.5 ~2.0g/L,葡萄糖 1.5 ~2.0g/L,酵母粉 1.5 ~2.0g/L, MgSO4.7Η201.0 ~1.2g/L，CaCl2L O ~1.2g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 lmL/L, pH 值為 7.2 ；
[0034]一級種子罐培養(yǎng):將得到的搖瓶菌種液接種到裝有上述M26液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.04~0.lkg/cm2，pH值為7.2的條件下，培養(yǎng)72h，得到一級菌種液；
[0035]二級種子罐培養(yǎng):將生長旺盛的一級菌種液接種到裝有上述M26液體培養(yǎng)基50L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，空氣流量比為1: 0.5，罐壓為0.04kg/cm2，pH值為7.2，培養(yǎng)72h，得到二級菌種液；
[0036]發(fā)酵罐培養(yǎng):最后將生長旺盛的二級菌種液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.04kg/cm2，得到發(fā)酵液；其中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基成分為:土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~
0.5g/L，豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η202.3 ~2.5g/L，CaCl23.0 ~3.5g/L，EDTA_Fe3+2mL/L,微量元素0.5~1.0mL/L, pH值為7.2 ；
[0037]2、埃博霉素B的粗提取
[0038]大孔樹脂預(yù)處理:首先，用3倍樹脂體積的甲醇浸泡，搖床震蕩12h后，取出倒掉甲醇溶液，用純水洗至無甲醇味；然后再用甲醇浸泡12h后，用純水洗至無甲醇味，以備用。
[0039]向步驟I)所述的發(fā)酵罐中，加入發(fā)酵液總體積約為1%的XAD-16型大孔吸附樹脂作為吸附劑，調(diào)整轉(zhuǎn)速至120rpm，調(diào)節(jié)pH值至7.2左右，再培養(yǎng)IOOh后，停止發(fā)酵；
[0040]收集培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液體中的大孔吸附樹脂，用上述大孔吸附樹脂3倍體積的乙酸乙酯洗脫2 4 h，收集乙醇乙酯洗脫液，將乙醇乙酯洗脫液在溫度為4 (TC，真空度-0.085MPa下，真空濃縮至干，得到含有埃博霉素B的粗提物。
[0041]3、分離提取埃博霉素B[0042]用甲醇溶解含埃博霉素B的粗提物，在15°C下，8000rpm的條件下，離心15min，取上清液。將上清液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析S^hadex LH-20進(jìn)行初步分離，條件為:葡聚糖凝膠LH-20，10X100cm，流動(dòng)相:甲醇。上樣量為柱體積的2%，流動(dòng)相流速為10mL/min，展開距離 7.5cm/h。
[0043]再利用HPLC進(jìn)行檢測，合并含有埃博霉素B的組分，得到埃博霉素B分離液；其中，HPLC分析的基本參數(shù):分析柱:反相C18(4.6mmX 250mm;填料粒徑5um);流動(dòng)相:甲醇/水=65:35 ;流速:lml/min ;進(jìn)樣體積:20uL ;檢測波長:249nm ;檢測時(shí)間:25min。
[0044]在埃博霉素B分離液中加入該分離液總體積約為2%的埃博霉素B分子印跡聚合物對埃博霉素B進(jìn)行吸附，搖床處理24h后，用甲醇進(jìn)行洗脫，收集甲醇洗脫液；
[0045]結(jié)晶:將上述甲醇洗脫液在40°C，真空度-0.085MPa的條件下真空濃縮至甲醇洗脫液體積的十分之一，得到濃縮液，將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器皿中，在-20°C下低溫結(jié)晶處理，在結(jié)晶器皿底部，析出大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0046]實(shí)施例2
[0047]一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0048]1、纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0049]搖瓶培養(yǎng):首先將纖維堆囊菌菌株ATCC25569接種到裝有M26液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在30°C，180rpm搖床上振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)84h，得到搖瓶菌種液；
[0050]其中，所述的M26液體培養(yǎng)基的成分與實(shí)施例1相同；
[0051]一級種子罐培養(yǎng):將得到的搖瓶菌種液接種到裝有上述M26液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.05kg/cm2，pH值為7.2的條件下，培養(yǎng)84h，得到一級菌種液；
[0052]二級種子罐培養(yǎng):將生長旺盛的一級菌種液接種到裝有上述M26液體培養(yǎng)基50L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，空氣流量比為1: 0.5，罐壓為0.05kg/cm2,pH值為
7.2，培養(yǎng)84h，得到二級菌種液；
[0053]發(fā)酵罐培養(yǎng):最后將生長旺盛的二級菌種液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，空氣流量比為1: 0.5，罐壓為0.05kg/cm2,繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)32h，得到發(fā)酵液；其中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基成分與實(shí)施例1相同；中的發(fā)酵培養(yǎng)纖維堆囊菌方法相同。
[0054]2.埃博霉素B的粗提取
[0055]大孔樹脂預(yù)處理:首先，用4倍樹脂體積的甲醇浸泡，搖床震蕩24h后，取出倒掉甲醇溶液，用純水洗至無甲醇味；然后再用甲醇浸泡24h后，用純水洗至無甲醇味，以備用。
[0056]在500L發(fā)酵罐中培養(yǎng)了 32h之后，通過在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液總體積約為4%的XAD-16型大孔吸附樹脂作為吸附劑，調(diào)整轉(zhuǎn)速至150rpm，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再培養(yǎng)了 120h后，停止發(fā)酵；
[0057]收集培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液體中的大孔吸附樹脂，用上述大孔吸附樹脂4倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫32h，收集乙醇乙酯洗脫液，將乙醇乙酯洗脫液在溫度為45°C，真空度-0.085MPa下，真空濃縮至干， 得到含有埃博霉素B的粗提物。
[0058]3.分離提取埃博霉素B
[0059]用甲醇溶解含有埃博霉素B的粗提物，在20°C下，1000Orpm,離心lOmin，取上清液。將上清液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析S印hadexLH-20進(jìn)行初步分離，條件為:葡聚糖凝膠LH-20,10 X IOOcm0流動(dòng)相:甲醇。上樣量為柱體積的2%，流動(dòng)相流速為8mL/min，展開距離7.2cm/h。
[0060]再利用HPLC進(jìn)行檢測，合并含有埃博霉素B的組分，得到埃博霉素B分離液；其中，HPLC分析的基本參數(shù):分析柱:反相C18(4.6mmX 250mm;填料粒徑5um);流動(dòng)相:甲醇/水=65:35 ;流速:lml/min ;進(jìn)樣體積:20uL ;檢測波長:249nm ;檢測時(shí)間:25min。
[0061]在埃博霉素B分離液中加入該分離液總體積約為4%的埃博霉素B分子印跡聚合物對埃博霉素B進(jìn)行吸附，搖床處理18h后，用甲醇進(jìn)行洗脫，收集甲醇洗脫液。
[0062]結(jié)晶:將上述甲醇洗脫液在溫度45°C、真空度-0.085MPa的條件下真空濃縮至甲醇洗脫液體積的十分之一，得到濃縮液，將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器皿中，在-200C低溫結(jié)晶處理，在結(jié)晶皿底部，析出大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0063]實(shí)施例3
[0064]一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，包括以下步驟:
[0065]1、纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0066]搖瓶培養(yǎng):首先將纖維堆囊菌菌株ATCC25532接種到裝有M26液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在30°C，220rpm搖床上振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)96h，得到搖瓶菌種液；
[0067]其中，所述的M26液體培養(yǎng)基的成分與實(shí)施例1相同；
[0068]一級種子罐培 養(yǎng):將得到的搖瓶菌種液接種到裝有上述M26液體培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.1 kg/cm2, pH值為7.2的條件下，培養(yǎng)96h，得到一級菌種液；
[0069]二級種子罐培養(yǎng):將生長旺盛的一級菌種液接種到裝有上述M26液體培養(yǎng)基50L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.1 kg/cm2, pH值為7.2，培養(yǎng)96h，得到二級菌種液；
[0070]發(fā)酵罐培養(yǎng):最后將生長旺盛的二級菌種液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)96h，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.lkg/cm2，得到發(fā)酵液；其中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基成分與實(shí)施例1相同；中的發(fā)酵培養(yǎng)纖維堆囊菌方法相同。
[0071]2.埃博霉素B的粗提取
[0072]大孔樹脂預(yù)處理:首先，用5倍樹脂體積的甲醇浸泡，搖床震蕩20h后，取出倒掉甲醇溶液，用純水洗至無甲醇味；然后再用甲醇浸泡20h后，用純水洗至無甲醇味，以備用。
[0073]在500L發(fā)酵罐中培養(yǎng)了 96h之后，通過在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液總體積約為5%的XAD-16型大孔吸附樹脂作為吸附劑，調(diào)整轉(zhuǎn)速至140rpm，調(diào)節(jié)pH值至7.4，再培養(yǎng)150h后，停止發(fā)酵；
[0074]收集培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液體中的大孔吸附樹脂，用上述大孔吸附樹脂5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫18h，收集乙醇乙酯洗脫液，將乙醇乙酯洗脫液在溫度為45°C，真空度-0.09MPa下，真空濃縮至干，得到含有埃博霉素B的粗提物。
[0075]3.分離提取埃博霉素B
[0076]用甲醇溶解含有埃博霉素B的粗提物，在25°C下，5000rpm，離心20min，取上清液。將上清液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析LH-20進(jìn)行初步分離，條件為:葡聚糖凝膠LH-20，10 X IOOcm0流動(dòng)相:甲醇。上樣量為柱體積的1%，流動(dòng)相流速為12mL/min，展開距離7.8cm/h0[0077]再利用HPLC進(jìn)行檢測，合并含有埃博霉素B的組分，得到埃博霉素B分離液；其中，HPLC分析的基本參數(shù):分析柱:反相C18(4.6mmX 250mm;填料粒徑5um);流動(dòng)相:甲醇/水=65:35 ;流速:lml/min ;進(jìn)樣體積:20uL ;檢測波長:249nm ;檢測時(shí)間:25min。
[0078]在埃博霉素B分離液中加入該分離液總體積約為5%的埃博霉素B分子印跡聚合物對埃博霉素B進(jìn)行吸附，搖床處理30h后，用甲醇進(jìn)行洗脫，收集甲醇洗脫液。
[0079]結(jié)晶:將上述甲醇洗脫液在溫度45°C、真空度-0.09MPa的條件下真空濃縮至甲醇洗脫液體積的十分之一，得到濃縮液，將濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器皿中，在_15°C低溫結(jié)晶處理，在結(jié)晶皿底部，析出大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素B。
[0080]綜上所述，本發(fā)明通過逐級發(fā)酵生產(chǎn)纖維堆囊菌，提高了產(chǎn)量。同時(shí)在分離提取過程中用到一種特異性靶向吸附能力的聚合物:分子印跡聚合物。它不僅對埃博霉素B具有很強(qiáng)的吸附力，而且可以很容易地將埃博霉素B萃取出來，直接進(jìn)行結(jié)晶，即可得到產(chǎn)物，印跡聚合物經(jīng)過干燥處理還可以重復(fù)使用，這樣就極大降低了分離提取埃博霉素藥物的生產(chǎn)成本。
[0081]本發(fā)明所提供的方法操作步驟簡單易行，可以放大至工業(yè)化生產(chǎn)，為埃博霉素B的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基 礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將纖維堆囊菌菌株搖瓶培養(yǎng)72-96h，將得到的搖瓶菌種液接種至一級種子罐中一級放大培養(yǎng)72-96h，將得到的一級菌種液接種至二級種子罐中二級放大培養(yǎng)72-96h，將得到的二級菌種液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中三級放大發(fā)酵培養(yǎng)12-96h后,得到發(fā)酵液； 2)向發(fā)酵液中加入發(fā)酵液總體積1%~5%的大孔吸附樹脂，調(diào)節(jié)pH值至7.0~7.4后，繼續(xù)培養(yǎng)100-150h后，停止發(fā)酵； 3)收集步驟2)發(fā)酵結(jié)束后的液體中的大孔吸附樹脂，用大孔吸附樹脂3~5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，濃縮，得到含有埃博霉素B的粗提物； 4)將含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后，離心，將上清液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行分離，用HPLC進(jìn)行檢測，合并含有埃博霉素B的組分，得到埃博霉素B分離液； 5)向埃博霉素B分離液中加入該分離液總體積2%~5%的分子印跡聚合物，搖床處理18~30h后，用甲醇進(jìn)行洗脫，收集甲醇洗脫液； 6)將甲醇洗脫液濃縮后，得到濃縮液，將濃縮液低溫結(jié)晶處理，析出的白色結(jié)晶即為埃博霉素B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟I)所述的搖瓶、一級種子罐和二級種子罐中所用的培養(yǎng)基均為M26液體培養(yǎng)基，成分為:土豆淀粉7.5~8.0g/L,大豆蛋白胨1.5~2.0g/L,葡萄糖1.5~2.0g/L,酵母粉 1.5 ~2.0g/L, MgSO4.7Η201.0 ~1.2g/L, CaCl2L O ~1.2g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素lmL/L，pH值為7.2 ； 所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基成分為:土豆淀粉2.5~3.0g/L,鹿糖0.7~1.0g/L,葡萄糖 0.2 ~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η202.3 ~2.5g/L, CaCl23.0 ~3.5g/L,EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟I)所述的搖瓶中的培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180~220rpm ;所述的一級種子罐、二級種子罐及發(fā)酵罐中的培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150~200rpm，空氣流量比為1:0.5,罐壓為0.04~0.1 kg/cm2 ;步驟2)加入大孔吸附樹脂后，轉(zhuǎn)速調(diào)整至120~150rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟2)所述的大孔吸附樹脂為XAD-16型大孔吸附樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟2)所述的大孔吸附樹脂在使用前經(jīng)過預(yù)處理，包括:先用3~5倍柱體積的甲醇浸泡大孔吸附樹脂，搖床震蕩12~24h后，去除甲醇，水洗至無醇味，再用甲醇浸泡12~24h后,水洗至無醇味,備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟3)所述的洗脫時(shí)間為18~32h，所述的濃縮是將乙酸乙酯洗脫液在40~45°C下，真空度為-0.09~-0.085MPa的條件下，真空濃縮至干。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟4)所述的葡聚糖凝膠柱層析選用Sephadex LH-20層析柱，流動(dòng)相選用甲醇，上樣量為柱體積的1%~2%，流動(dòng)相流速為8~12mL/min，展開距離為7.2~7.8cm/h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟4)所述的離心是在15~25°C下，5000~1000Orpm,離心10~20min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟5)所述的分子印跡聚合物是埃博霉素B分子印跡聚合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟6)所述的 濃縮是將甲醇洗脫液在40~45 °C下，真空度為-0.09~-0.085MPa的條件下，真空濃縮至甲醇洗脫液體積的1/10 ;所述的低溫結(jié)晶處理是將濃縮液在-20~_15°C下低溫處理至析出白色結(jié)晶。
【文檔編號】C07D493/04GK103667387SQ201310637264
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】龔國利, 趙婷峰, 李慧 申請人:陜西科技大學(xué)