專利名稱：一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大團(tuán)囊蟲草菌(Cordyceps ophioglossoides)的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)工藝。
背景技術(shù)：
大團(tuán)囊蟲草是一種名貴中草藥，我國(guó)南方地區(qū)民間使用較為普遍，具有悠久的歷史。該蟲草子實(shí)體在治療婦科疾病方面藥用價(jià)值極高，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、閉經(jīng)等病，對(duì)產(chǎn)后出血、促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)原也具有顯著效果。由于野生資源的匱乏和生長(zhǎng)環(huán)境的惡化，現(xiàn)有該真菌的天然資源已不能滿足人們的需求，利用現(xiàn)代的生物技術(shù)來(lái)挽救這種名貴的中藥十分必要。
上個(gè)世紀(jì)中后期發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)已成功應(yīng)用于多種藥用真菌的大規(guī)模生產(chǎn)，其中以液體發(fā)酵技術(shù)最為成熟。本次將液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到大團(tuán)囊蟲草菌體的生產(chǎn)在國(guó)內(nèi)尚屬首例，研究結(jié)果表明該方案是可行的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)液體發(fā)酵過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)需求與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系，提供了一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，菌種是本實(shí)驗(yàn)室分離得到的大團(tuán)囊蟲草菌的純菌株(拉丁文學(xué)名為Cordycepsophioglossoides)，現(xiàn)保存于中國(guó)專利局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào)為CGMCC No.1146。
本發(fā)明提供的一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法的實(shí)施方案為以人工分離培養(yǎng)到的大團(tuán)囊蟲草純菌株為出發(fā)菌種，依次經(jīng)固體斜面培養(yǎng)，搖床種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)完成。
固體斜面培養(yǎng)的條件為，從保藏菌種接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度20～30℃，培養(yǎng)200～240小時(shí)。
每1000毫升斜面培養(yǎng)基的主要成份為馬鈴薯100～300克、蔗糖或葡萄糖10～30克、瓊脂15～25克，加水定容至1升，調(diào)pH值為4.8～6.5。
搖床種子培養(yǎng)的條件為，菌種固體斜面培養(yǎng)200～240小時(shí)后，挑取菌絲體接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在20～30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150～200rpm，培養(yǎng)60～72小時(shí)。
種子培養(yǎng)基與搖瓶的容積比為1∶3～1∶5。
每1000毫升種子培養(yǎng)基的主要成份為蔗糖20～60克、酵母粉或酵母膏10～50克、蛋白胨10～50克、MgSO4·7H2O 0.1～0.5克、KH2PO40.1～0.5克，pH自然。
發(fā)酵培養(yǎng)的方法是，液體種子搖床培養(yǎng)60～72小時(shí)后接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量5～15％(V/V)、保持罐溫20～30℃、罐壓0.4～0.8kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發(fā)酵時(shí)間85～110小時(shí)。
每1000毫升發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份為蔗糖50～100克、酵母粉或酵母膏10～60克，蛋白水解液20～100毫升(V/V)、MgSO4·7H2O 0.2～1克、KH2PO40.2～1克，培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4.8～6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)采用液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)。
本發(fā)明的放罐標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液變得粘稠，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開始衰老。
經(jīng)與其他培養(yǎng)工藝進(jìn)行比較、反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明效果顯著(1)本發(fā)明中種子培養(yǎng)基提供了菌體短期內(nèi)快速生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)60小時(shí)左右即可進(jìn)行深層發(fā)酵。
(2)本發(fā)明中液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)成分配比合理，能夠保證大團(tuán)囊蟲草菌的生長(zhǎng)需要，培養(yǎng)基材料豐富，整個(gè)分批發(fā)酵過(guò)程中只需一次配料、一次滅菌即可，具有省時(shí)、省工，又減少了由于中途加料造成污染雜菌的機(jī)會(huì)。
(3)采用本發(fā)明中的液體深層通氣發(fā)酵工藝進(jìn)行分批發(fā)酵，每升發(fā)酵液可得到20～30克的干菌體。
(4)本發(fā)明是國(guó)內(nèi)首次對(duì)大團(tuán)囊蟲草菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，對(duì)于該菌以后的實(shí)驗(yàn)研究和工業(yè)化生產(chǎn)均有很大的指導(dǎo)意義。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1種子培養(yǎng)基的制備稱取蔗糖40克、酵母粉(膏)20克、蛋白胨30克、MgSO4·7H2O 0.2克、KH2PO40.2克，將各組分混合溶解，加水定容至1000毫升，滅菌后即得。
實(shí)施例2蛋白水解液的制備方法一取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，于60℃烘箱中干燥6個(gè)小時(shí)，然后放于80℃烘箱中干燥17個(gè)小時(shí)，稱取干粉100克，加入生石灰6克，水640毫升，在0.15Mpa下加壓水解2個(gè)小時(shí)，過(guò)濾，取濾液即得。
方法二取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，于60℃烘箱中干燥6個(gè)小時(shí)，然后放于80℃烘箱中干燥17個(gè)小時(shí)，稱取干粉100克，加入6mol/l的鹽酸600毫升，在沸水浴中水解30分鐘，過(guò)濾后收集濾液。
實(shí)施例3液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)基的制備稱取蔗糖50克、酵母粉(膏)20克、按實(shí)施例2制備的蛋白水解液40毫升、MgSO4·7H2O 0.5克、KH2PO40.5克。將上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敵作消泡劑，用鹽酸調(diào)pH到5.6，滅菌后即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)施例4斜面培養(yǎng)基的制備稱取馬鈴薯200克、蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂20克，將各組分混合溶解，加水定容至1000毫升，用鹽酸調(diào)pH到5.6，滅菌后即為斜面培養(yǎng)基。實(shí)施例5液體深層培養(yǎng)方法一(1)取適量按實(shí)施例4配制的新鮮斜面培養(yǎng)基，挑取保藏菌種的菌絲體采用涂布或劃線的方法接種到斜面培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)200小時(shí)。
(2)選菌體繁茂的斜面培養(yǎng)菌種，從上挑取1立方厘米菌絲體或挖取1立方厘米菌苔接種于裝有按實(shí)施例1制備的液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度25℃，轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)70小時(shí)。
(3)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的種子培養(yǎng)物，以8％(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有按實(shí)施例3制備的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，保持罐溫25℃、罐壓0.5kg/cm，攪拌速率150rpm，通氣量1∶0.6，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間100小時(shí)。待發(fā)酵液變的粘稠，鏡檢觀察菌絲體開始衰老時(shí)，停止發(fā)酵、放罐，分別收集菌絲體和發(fā)酵液，每升發(fā)酵液可獲得20g以上的干燥菌絲體。
實(shí)施例6液體深層培養(yǎng)方法二(1)取適量按實(shí)施例4配制的新鮮斜面培養(yǎng)基，挑取保藏菌種的菌絲體采用涂布或劃線的方法接種到斜面培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)240小時(shí)。
(2)選菌體繁茂的斜面培養(yǎng)菌種，從上挑取1立方厘米菌絲體或挖取1立方厘米菌苔接種于裝有按實(shí)施例1制備的液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速150rpm條件下培養(yǎng)60小時(shí)。
(3)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的種子培養(yǎng)物，以5％(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有按實(shí)施例3制備的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，保持罐溫30℃、罐壓0.4kg/cm，攪拌速率250rpm，通氣量1∶0.3，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間110小時(shí)。待發(fā)酵液變的粘稠，鏡檢觀察菌絲體開始衰老時(shí)，停止發(fā)酵、放罐，分別收集菌絲體和發(fā)酵液，每升發(fā)酵液可獲得20g以上的干燥菌絲體。
實(shí)施例7液體深層培養(yǎng)方法三(1)取適量按實(shí)施例4配制的新鮮斜面培養(yǎng)基，挑取保藏菌種的菌絲體采用涂布或劃線的方法接種到斜面培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)220小時(shí)。
(2)選菌體繁茂的斜面培養(yǎng)菌種，從上挑取1立方厘米菌絲體或挖取1立方厘米菌苔接種于裝有按實(shí)施例1制備的液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在溫度20℃，轉(zhuǎn)速180rpm條件下培養(yǎng)72小時(shí)。
(3)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的種子培養(yǎng)物，以15％(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有按實(shí)施例3制備的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，保持罐溫20℃、罐壓0.8kg/cm，攪拌速率100rpm，通氣量1∶1.2，發(fā)酵培養(yǎng)85小時(shí)左右。待發(fā)酵液變的粘稠，鏡檢觀察菌絲體開始衰老時(shí)，停止發(fā)酵、放罐，分別收集菌絲體和發(fā)酵液，每升發(fā)酵液可獲得20g以上的干燥菌絲體。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。
本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神和主要特征的具體形式來(lái)概述。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說(shuō)明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，以人工分離培養(yǎng)到的大團(tuán)囊蟲草純菌株為出發(fā)菌種，依次經(jīng)固體斜面培養(yǎng)，搖床種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)完成；所述大團(tuán)囊蟲草純菌株，拉丁文學(xué)名為Cordyceps ophioglossoides，保藏號(hào)是CGMCC No.1146。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，固體斜面培養(yǎng)的條件為，從保藏菌種接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度20～30℃，培養(yǎng)200～240小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，每1000毫升斜面培養(yǎng)基的主要成份為馬鈴薯100～300克、蔗糖或葡萄糖10～30克和瓊脂15～25克，培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4.8～6.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，搖床種子培養(yǎng)的條件為，菌種固體斜面培養(yǎng)200～240小時(shí)后，挑取菌絲體接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在20～30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150～200rpm，培養(yǎng)60～72小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，每1000毫升種子培養(yǎng)基的主要成份為蔗糖20～60克、酵母粉或酵母膏10～50克、蛋白胨10～50克、MgSO4·7H2O 0.1～0.5克和KH2PO40.1～0.5克。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的方法是，液體種子搖床培養(yǎng)60～72小時(shí)后接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量5～15％(V/V)、保持罐溫20～30℃、罐壓0.4～0.8kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發(fā)酵時(shí)間85～110小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，每1000毫升發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份為蔗糖50～100克、酵母粉或酵母膏10～60克，蛋白水解液20～100毫升、MgSO4·7H2O 0.2～1克和KH2PO40.2～1克，培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4.8～6.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)采用液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)大團(tuán)囊蟲草菌體的方法，以大規(guī)模液體深層發(fā)酵培養(yǎng)大團(tuán)囊蟲草菌體(Cordyceps ophioglossoides)為目標(biāo)。以人工分離培養(yǎng)到的大團(tuán)囊蟲草純菌株為出發(fā)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)、最后到發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵液中的菌絲體以干重計(jì)可達(dá)2～3％的。本發(fā)明中公開的液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基分別由蔗糖、酵母粉(膏)、蛋白胨、鎂鹽、鉀鹽和蔗糖、酵母粉(膏)、蛋白水解液、鎂鹽、鉀鹽組成。兩種培養(yǎng)基分別適合液體種子階段培養(yǎng)和深層液體通氣培養(yǎng)大團(tuán)囊蟲草菌，合理滿足了大團(tuán)囊蟲草菌不同發(fā)酵時(shí)期所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)和繁殖，提高了菌的活性。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1737110SQ20051005019
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月22日
發(fā)明者李永泉, 鄭靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)