專利名稱：一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于纖維堆囊菌發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法。
背景技術(shù)：
埃博霉素B (Epothilone B, EP0-906)是由纖維堆囊菌產(chǎn)生的一種已進(jìn)入臨床抗腫瘤治療研究的藥物。目前埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量很低，主要由兩個原因。第一是埃博霉素對其生產(chǎn)菌株有毒性抑制作用，這在很大程度上限制了埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。雖然可以利用大孔吸附樹脂XAD-16來解決這方面的困難，但樹脂對發(fā)酵液中其他物質(zhì)的非特異性吸附也為埃博霉素產(chǎn)量的提高帶來新的困難。第二，纖維堆囊菌復(fù)雜的細(xì)胞行為。它們往往在固體培養(yǎng)基上能良好的生長、代謝并產(chǎn)生埃博霉素，但在液體培養(yǎng)基中生長時代謝行為往往會發(fā)生改變；如細(xì)胞·成團(tuán)生長，并且內(nèi)外細(xì)胞的狀態(tài)不一致；細(xì)胞存在自溶性現(xiàn)象；代謝狀態(tài)不穩(wěn)定等。因此開發(fā)一種能夠作為埃博霉素生產(chǎn)菌株的固體化材料，并將其用于發(fā)酵液中將極大地增加埃博霉素的產(chǎn)量。多孔陶瓷作為一種新型陶瓷材料，一直倍受生物、環(huán)保領(lǐng)域科研人員的青睞，這是因為它作為生物催化劑的載體具有氣孔率高、化學(xué)穩(wěn)定性好、比表面積大、體積密度小以及耐高溫、耐腐蝕等特點，另外多孔陶瓷還具備無毒害作用、穩(wěn)定性優(yōu)異、傳質(zhì)性能好、機(jī)械強度高、生物親合性好、操作簡單、價廉易得等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，為纖維堆囊菌生產(chǎn)埃博霉素B提供生長代謝的固體附著面，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產(chǎn)成本。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，包括以下步驟I)將纖維堆囊菌接種于M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的菌體接種于M26液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；2)將經(jīng)M26液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，加入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液；3)按IOOmL發(fā)酵液接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質(zhì)量50 400倍經(jīng)發(fā)酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在25 35°C，180 220rpm 搖床培養(yǎng) 72 96h。所述在溫度28 30°C，轉(zhuǎn)速180 200r/min下?lián)u床培養(yǎng)72 96h。所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。所述在M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C下，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 96h ；
所述在M26液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)72 96h。步驟2)所述的高速攪拌時間為10 20min。步驟2)和步驟3)所述的離心過程是在4°C下,8000rpm,離心lOmin。所述的多孔陶瓷的孔徑在5 10 μ m,比表面積為40 50m2/g,能夠吸附固定粘細(xì)菌。所述的多孔陶瓷抗折強度為15 20MPa，吸水率達(dá)到50%。所述的多孔陶瓷的處理為多孔陶瓷塊經(jīng)150°C高溫滅菌10 30min，自然冷卻后，加入發(fā)酵液完全覆蓋多孔陶瓷塊并高出10 50mm，常溫下?lián)u晃O. 5 lh，靜置I 2h后傾去發(fā)酵液，100 105°C
干燥后待用。所述的多孔陶瓷塊在發(fā)酵時懸浮在發(fā)酵液中。所述的IOOmL發(fā)酵液中多孔陶瓷塊的加入量為I 2g。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，在埃博霉素B發(fā)酵生產(chǎn)時，通過添加硅藻土基多孔陶瓷對生產(chǎn)菌株纖維堆囊菌提供附著物，幫助其在培養(yǎng)液中固定，這樣可以為在液體環(huán)境中生長的粘細(xì)菌細(xì)胞提供一個固體附著面，從一定程度上滿足粘細(xì)菌生長代謝產(chǎn)生埃博霉素的 固體培養(yǎng)微環(huán)境，克服游離發(fā)酵培養(yǎng)時成團(tuán)成片生長所帶來的傳質(zhì)不均勻、代謝不穩(wěn)定等難題。進(jìn)一步，本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，埃博霉素生產(chǎn)菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于緩解埃博霉素對其生產(chǎn)菌株的反饋抑制作用，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產(chǎn)成本，本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，從所要固定的微生物菌體粘細(xì)菌聚集擴(kuò)展的生長特點出發(fā)，所采用的硅藻土基多孔陶瓷的孔徑在5 10 μ m，抗折強度為15 20MPa，比表面積為40 50m2/g，吸水率達(dá)到50%，能夠良好的吸附固定粘細(xì)菌，吸附量達(dá)到了 10 15mg/g，并且在吸附固定粘細(xì)菌過程中磨損較少。本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，簡單易行，可以進(jìn)行工業(yè)化操作，為埃博霉素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了現(xiàn)實性基礎(chǔ)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生產(chǎn)菌株的方法，從所要固定的微生物菌體粘細(xì)菌聚集擴(kuò)展的生長特點出發(fā)，選擇合適的硅藻土基多孔陶瓷，孔徑在5 10 μ m，抗折強度為15 20MPa，比表面積為40 50m2/g，吸水率達(dá)到50%。進(jìn)一步，給出以下制備方法I)稱取過60目篩的生娃藻土 40g,煅燒娃藻土 35g,粘土 15g,混合后加入20g水，在球磨機(jī)中球磨30min，將得到的漿液倒入搪瓷盤中，于105°C下干燥過夜。2)將干燥后的料漿研磨后過40目篩，再加入過80目篩的木屑lg，石蠟Ig進(jìn)行混合后過40目篩3次,使其混合均勻；緩慢噴灑2g水后過3次40目篩，進(jìn)行整粒，裝入密封袋密封靜置3h。3)將經(jīng)整粒的混合粉料用粉末壓片機(jī)在5MPa下壓制尺寸為Φ 10X 20mm樣品；4)將成型后的樣品在300 C干媒3h后，放入電阻爐中1000 C保溫30min使造孔劑(木屑和石蠟)揮發(fā)，得到硅藻土基多孔陶瓷。基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟1.多孔陶瓷的前處理將尺寸為Φ20 X IOmm的硅藻土基多孔陶瓷塊于150°C高溫滅菌30min，自然冷卻。將維堆囊菌發(fā)酵用發(fā)酵液加到多孔陶瓷樣品中，完全覆蓋樣品后高出約50_，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷干燥待用。2.菌懸液制備將一環(huán)新鮮的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)接種于M26固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 96h ;將培養(yǎng)后的菌體接入IOOmL的M26液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)72 96h ;培養(yǎng)結(jié)束后倒棄一部分液體，將剩余的液體轉(zhuǎn)移至含有攪拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力攪拌器上高速攪拌10 20min，使菌團(tuán)打散打勻為止，離心收集打勻的菌體，重懸于30 50mL的無菌水中，形成菌懸液。用無菌水將菌懸液稀釋10 20倍后，離心收集沉淀，沉淀烘干后稱干重，可得菌懸液稀釋后的濃度，再換算成原來菌懸液的濃度，單位為mg/mL。在進(jìn)行下一步發(fā)酵培養(yǎng)時可以按照一定的接種量來量取菌懸液，防止接種量過大而引起的傳質(zhì)不良或溶氧不足等現(xiàn)象的發(fā)生。3.發(fā)酵培養(yǎng)按IOOmL接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質(zhì)量50 400倍預(yù)處理過的多孔陶瓷，在25 35°C，180 220rpm搖床培養(yǎng)72 96h。以上所用到的菌種、培養(yǎng)基具體為所述的菌種為纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)即可,具體的可選用纖維堆囊菌ATCC25532。M26固體培養(yǎng)基成分為瓊脂20g/L，土豆淀粉8. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L，葡萄糖2. 0g/L，酵母粉 2. 0g/L, MgSO4 · 7Η201· 0g/L, CaCl2L 0g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 ImL/L，調(diào)節(jié)pH為7. 2 ；M26液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉8. 0g/L,大豆蛋白胨2. 0g/L,葡萄糖2. 0g/L,酵母粉 2. 0g/L, MgSO4 · 7Η201· 0g/L, CaCl2L 0g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 lmL/L，調(diào)節(jié) pH 為7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)時發(fā)酵液成分為酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉 2g/L、MgSO4 · 7H205g/L、FeSO4 · 7Η200· lg/L、CaCl25g/L、MnCl2O. lg/L 和葡萄糖 IOg/L，調(diào)節(jié)pH為7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，按照埃博霉素B常規(guī)提取純化方法分離得到。而在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，測定多孔陶瓷吸附固定粘細(xì)菌量，由于多孔陶瓷在吸附固定粘細(xì)菌過程中受到發(fā)酵液長時間的沖刷，會使其邊緣受到一定的磨損，所以要用灼燒干重法；即稱取一定量的固定化載體95°C干燥至恒重，質(zhì)量為Hi0,再在電阻爐中500°C灼燒Ih,自然冷卻后稱重Iii1,貝U菌體干重為mQ — 檢測結(jié)果表明對粘細(xì)菌的吸附固定量能夠達(dá)到 20mg/g。綜上所述，本方法通過向埃博霉素B的生產(chǎn)菌株纖維堆囊菌培養(yǎng)液中，加入經(jīng)處理過的多孔陶瓷，為在液體環(huán)境中生長的纖維堆囊菌提供一個固體附著面，滿足粘細(xì)菌生長代謝產(chǎn)生埃博霉素的固體培養(yǎng)微環(huán)境，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產(chǎn)成本。多孔陶瓷載體與菌體的結(jié)合量受溫度、轉(zhuǎn)速、載體量等因素的影響，升高一定的溫度可以提高菌體向多孔陶瓷表面積空隙內(nèi)擴(kuò)散遷移的速率，若溫度太高，又容易解吸；較高的轉(zhuǎn)速可以達(dá)到較好的傳質(zhì)效果，有利于菌體的生長于固定，但也不能超過菌體的最高培養(yǎng)轉(zhuǎn)速；多孔陶瓷載體的載體量同樣也會影響載體與菌體的結(jié)合，當(dāng)載體量過多時，隨著菌體的生長，總菌體量過大，妨礙了培養(yǎng)基的傳質(zhì)擴(kuò)散，導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧不足，難以維持菌體的呼吸生長需要。本發(fā)明所提供的方法選擇的條件適宜(IOOmL發(fā)酵液中接種5 10mg，多孔陶瓷載體量I 2g，溫度28 30°C，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min，時間72 96h)，操作步驟簡單易行，可以放大至工業(yè)化生產(chǎn)，為埃博霉素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了實驗基礎(chǔ)。下面給出具體的發(fā)酵實施例。實施例1
一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ10 ·ι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)將一環(huán)新鮮的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)接種于M26固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ；將培養(yǎng)后的菌體接入IOOml的M26液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)72h ；培養(yǎng)結(jié)束后倒棄一部分液體，將剩余的液體轉(zhuǎn)移至含有攪拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力攪拌器上高速攪拌lOmin，使菌團(tuán)打散打勻為止，離心收集打勻的菌體，將其懸浮在3OmL的無菌水中；用無菌水把ImL的菌懸液稀釋至10mL，放入提前稱重好的刻度離心管(質(zhì)量為amg)中，4°C 8000rpm離心IOmin后，棄去上清液，在105°C的恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱重(質(zhì)量為b mg),則菌體的干重為(b — a) mg ;換算至菌懸液的濃度為(b — a) mg/mL。3)取IOmL稀釋過的菌懸液，接入含有IOOmL發(fā)酵液和2g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)96h。實施例2一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ IOmm的娃藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min,自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法一定濃度的制備菌懸液。3)取5ml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和Ig多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，28°C 180rpm搖床培養(yǎng)96h。實施例3一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ10·ι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法制備一定濃度的菌懸液。3)取IOml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和1. 5g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 220rpm搖床培養(yǎng)96h。實施例4一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ1 0πιπι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法制備一定濃度的菌懸液。3)取8ml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和2g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 220rpm搖床培養(yǎng)72h。用500mL的培養(yǎng)瓶要比平時所用的250mL或300mL的培養(yǎng)瓶的傳質(zhì)效果好，由于所用的菌體纖維堆囊菌是嚴(yán)格好氧的，因此必須保證良好的溶氧環(huán)境。實施例5一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ10πιπι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法制備一定濃度的菌懸液。3)取8ml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和1. 5g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)72h。
權(quán)利要求
1.一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將纖維堆囊菌接種于M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的菌體接種于M26液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)； 2)將經(jīng)M26液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，力口入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液； 3)按IOOmL發(fā)酵液接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質(zhì)量50 400倍經(jīng)發(fā)酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在溫度25 35°C，180 250r/min 搖床培養(yǎng) 72 96h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述在溫度28 30°C，轉(zhuǎn)速180 200r/min下?lián)u床培養(yǎng)72 96h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述在M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C下，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 96h ； 所述在M26液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)72 96h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，步驟2)所述的高速攪拌時間為10 20min ； 步驟2)和步驟3)所述的離心過程是在4°C下,8000rpm,離心lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷為硅藻土基多孔陶，其孔徑在5 10 ym，比表面積為40 50m2/g，能夠吸附固定粘細(xì)菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷為硅藻土基多孔陶，其抗折強度為15 20MPa，吸水率達(dá)到50%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷的處理為 多孔陶瓷塊經(jīng)150°C高溫滅菌10 30min，自然冷卻后，加入發(fā)酵液完全覆蓋多孔陶瓷塊并高出10 50mm,常溫下?lián)u晃0. 5 Ih,靜置I 2h后傾去發(fā)酵液，100 105°C干燥后待用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷塊在發(fā)酵時懸浮在發(fā)酵液中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述的IOOmL發(fā)酵液中多孔陶瓷塊的加入量為I 2g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，屬于微生物發(fā)酵制藥領(lǐng)域。本方法將制備得到的多孔陶瓷用發(fā)酵液進(jìn)行處理后干燥待用；將纖維堆囊菌分別經(jīng)M26固體、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，得到菌懸液；將菌懸液稀釋后接種于發(fā)酵液中，再向其中加入經(jīng)處理過的多孔陶瓷，振蕩培養(yǎng)。本發(fā)明提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生產(chǎn)菌株的方法，在埃博霉素B發(fā)酵生產(chǎn)時，通過對其生產(chǎn)菌株纖維堆囊菌進(jìn)行固定，這樣可以為在液體環(huán)境中生長的粘細(xì)菌細(xì)胞提供一個固體附著面，本方法能夠提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產(chǎn)成本，操作步驟簡單易行，可以放大至工業(yè)化生產(chǎn)，為埃博霉素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了實驗基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/01GK103045675SQ20121056362
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月22日
發(fā)明者龔國利, 劉麗麗, 王娜 申請人:陜西科技大學(xué)