本發(fā)明涉及一種基于二聚化的受體結(jié)合區(qū)亞單位的冠狀病毒疫苗，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：冠狀病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是有囊膜的正鏈rna病毒，在所有rna病毒中其基因組最大。動(dòng)物和人類都是冠狀病毒的宿主。冠狀病毒主要感染哺乳動(dòng)物和鳥類的呼吸道和消化道。其中有6種冠狀病毒感染人。其中對(duì)全球公共衛(wèi)生威脅最大的是2002-2003年在中國(guó)爆發(fā)的嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒(sars-cov)和2012年爆發(fā)并持續(xù)至今的中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)。冠狀病毒也引發(fā)許多嚴(yán)重的動(dòng)物疾病，尤其對(duì)農(nóng)業(yè)牲畜和寵物帶來嚴(yán)重威脅。比如，豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)可以引發(fā)豬的嚴(yán)重腹瀉，死亡率極高；其缺失病毒豬呼吸道冠狀病毒(prcv)可以引起豬嚴(yán)重的呼吸道疾??；貓腹膜炎病毒(fipv)可引起貓腹膜炎和腹水聚集，致死率很高；犬冠狀病毒(ccov)則可使犬發(fā)生不同程度的腸胃炎癥狀，傳播快，難控制；豬流行性腹瀉病毒(pedv)引起豬流行性腹瀉等腸道疾病，容易在豬群里傳播致死率很高。此外還有鼠、牛等冠狀病毒。這些冠狀病毒對(duì)人和動(dòng)物的健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此，開發(fā)一種安全、有效的針對(duì)冠狀病毒sars-cov和mers-cov的疫苗十分緊迫、有著重要的意義。表面刺突蛋白(s蛋白)是冠狀病毒的主要中和抗原。mers-cov、sars-covs蛋白的受體結(jié)合區(qū)(receptorbindingdomain,rbd)被認(rèn)為是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的最主要的抗原靶區(qū)域。rbd作為疫苗能夠?qū)C(jī)體刺激產(chǎn)生的中和抗體更加聚焦在針對(duì)病毒的受體結(jié)合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。mers-cov通過rbd與宿主細(xì)胞的受體(cd26，又名dpp4)結(jié)合而侵入細(xì)胞。此外，sars-cov通過其rbd與宿主細(xì)胞受體ace2結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞。目前已有報(bào)道的通過使用冠狀病毒rbd制備針對(duì)mers-cov和sars-cov的疫苗，使用的是單體的rbd蛋白或者融合單體rbd與fc區(qū)的蛋白。在mers-cov里面，之前報(bào)道的rbd單體僅能在小鼠體內(nèi)激起較低的假病毒中和抗體水平。這提示使用mers-cov的rbd單體作為疫苗的免疫原性有限。因此有必要對(duì)基于mers-covrbd的疫苗進(jìn)行改進(jìn)。之前又有報(bào)道通過在rbd的c末端融合igg的fc區(qū)域，表達(dá)制備rbd-fc用于針對(duì)mers-cov的疫苗。rbd-fc能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的假病毒中和活性。但蛋白融合表達(dá)fc作為疫苗其安全性還需要許多深入的研究評(píng)價(jià)，限制了其臨床使用的進(jìn)度。此外，之前sars-cov疫苗的研究也使用的是rbd單體，具有一定的中和免疫原性?？傊?，目前基于冠狀病毒s蛋白的rbd單體研制的疫苗，免疫原性有限。而基于rbd的融合蛋白(比如igg的fc段)則存在安全評(píng)價(jià)不足的缺陷。因此，開發(fā)一種免疫原性高、安全性更被認(rèn)可的sars-cov或mers-cov疫苗，是目前亟需解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明開發(fā)了一種基于冠狀病毒rbd設(shè)計(jì)疫苗的新方法，利用mers-cov、sars-cov自身的半胱氨酸殘基形成同源二聚體來制備疫苗，本發(fā)明的疫苗能顯著的提高宿主中和抗體的水平，制備方法簡(jiǎn)單、蛋白無標(biāo)簽且易于純化，能較快的應(yīng)用于臨床的使用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種免疫原性提高的冠狀病毒抗原，所述抗原是二聚化的mers-cov蛋白或者sars-cov蛋白的rbd。所述rbd的氨基酸序列如(1)或(2)所示：(1)如seqidno:1或者seqidno:2所示的氨基酸序列；(2)在(1)中的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)氨基酸或幾個(gè)氨基酸且具有相抗原性的由(1)衍生的多肽或其類似物，且其編碼的蛋白自身能夠形成二聚體。所述seqidno:1的序列，來源于mers-covemc/2012株的s蛋白(ncbi上的genbank:afs88936.1)的一部分，是mers-cov蛋白的rbd的e367-y606區(qū)域。所述seqidno:2的序列，來源于sars-covbj01株的s蛋白(spikeglycoproteins，ncbi為genbank:aap30030.1)的一部分，是sars-cov的rbd的r294-f515區(qū)域。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述二聚化的rbd的核苷酸序列如seqidno:3或者seqidno:4所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述冠狀病毒抗原的制備方法，是在seqidno:3或者seqidno:4所示核苷酸序列的3’端加上翻譯終止密碼子，進(jìn)行克隆表達(dá)，篩選正確的重組子，然后轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)后收集細(xì)胞上清，純化即得到冠狀病毒抗原。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述昆蟲細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞sf9或者昆蟲細(xì)胞系hi5。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述冠狀病毒抗原的純化方法，是將表達(dá)所述抗原的細(xì)胞上清液過濾除去細(xì)胞碎片，并通過hitrapqhp陰離子交換柱進(jìn)行目的蛋白的捕獲，隨即通過含有1mnacl的緩沖液洗脫進(jìn)行粗純，之后含有目的蛋白的組分上樣疏水柱hitrapphenylhp，然后進(jìn)行梯度洗脫，將得到的含有目標(biāo)蛋白的洗脫峰合并，再10k截留濃縮，然后使用superdex200hiload16/60柱子(ge)進(jìn)行分子篩層析進(jìn)行純化。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述梯度洗脫是用20mmtris-hcl，ph8.0。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述分子篩層析緩沖液為20mmtris，150mmnacl，ph8.0。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述目的蛋白是二聚化的mers-rbd蛋白或者sars-rbd蛋白；所述二聚化的mers-rbd蛋白在非還原條件下(不加dtt)的情況下大小約為60kd，在還原條件下(加入dtt)大小約為30kd；所述二聚化的sars-rbd蛋白在非還原條件下大小約55kd，還原條件下大小約28kd。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供編碼所述抗原的dna，表達(dá)所述抗原的載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或者重組菌、攜帶所述抗原的表達(dá)盒。本發(fā)明還提供所述抗原的應(yīng)用，是用于制備抗冠狀病毒的藥物。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是將氨基酸序列如seqidno:1的抗原與mf59或者鋁佐劑合用。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是將氨基酸序列如seqidno:2的抗原與mf59或者鋁佐劑合用。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是用于制備試劑盒；所述試劑盒中含有所述抗原，或者編碼所述抗原的dna分子，或者表達(dá)所述抗原的重組載體/表達(dá)盒/轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系/重組菌。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種提高抗原免疫原性的方法，所述方法是表達(dá)二聚化的mers-cov蛋白或者sars-cov蛋白的rbd；所述二聚化的rbd的氨基酸序列如seqidno:1或者seqidno:2所示。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過桿狀病毒體在昆蟲細(xì)胞里表達(dá)mers-cov蛋白的rbd(e367-y606)區(qū)域，使得rbd可通過s蛋白自身603位的半胱氨酸殘基形成二聚體。而當(dāng)去掉這一半胱氨酸后，rbd則只形成單體(e379-e589)。進(jìn)而，分別使用純化的rbd蛋白二聚體和單體對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行免疫。本發(fā)明的二聚化的rbd克服了rbd單體免疫原性不足的缺點(diǎn)，大大提高了小鼠針對(duì)mers-cov的中和抗體產(chǎn)生。按照同樣的思路推廣到sars-cov，本發(fā)明表達(dá)sars-cov的rbd(r294-f515)，通過s蛋白自身512位的半胱氨酸殘基形成二聚體。純化后的sars-covrbd二聚體較之其單體(512位的半胱氨酸殘基突變成絲氨酸)免疫原性顯著的提高。附圖說明圖1：mersrbd蛋白純化分子篩和sds-page圖；m表示低分子量蛋白marker，dimer表示二聚體，monomer表示單體；圖2：sarsrbd蛋白純化分子篩和sds-page圖；m表示低分子量蛋白marker，dimer表示二聚體，monomer表示單體；圖3：小鼠免疫策略。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：表達(dá)mers和sars抗原的重組桿狀病毒制備將mers-covrbd核苷酸序列(如seqidno:3所示)和sars-covrbd(如seqidno:4所示)核苷酸序列3’端加上翻譯終止密碼子后克隆到包含gp67信號(hào)肽的pfastbac載體(pfastbac-sp)的ecori和xhoi酶切位點(diǎn)之間，使得蛋白編碼區(qū)在信號(hào)肽gp67序列的后面融合表達(dá)，用于目的蛋白的分泌。分別得到載體pfastbac-sp-mers-rbd以及pfastbac-sp-sars-rbd。而用于表達(dá)mers單體rbd的載體則由s蛋白序列(ncbi上genbank:afs88936.1)中氨基酸379位到589位蛋白的核酸片段插入pfastbac-sp的ecori和xhoi酶切位點(diǎn)，并在3’端帶上6個(gè)組氨酸而構(gòu)成。用于表達(dá)sars單體rbd的載體則由seqidno:2所示的氨基酸序列的第219位的半胱氨酸突變成絲氨酸而來(對(duì)于ncbi上genbank:aap30030.1的s蛋白的第512位)，并在3’端帶上6個(gè)組氨酸而構(gòu)成。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)，通過藍(lán)白斑篩選和pcr鑒定出陽性克隆。提取重組的桿狀病毒dna(bacmid)，通過測(cè)序鑒定正確的重組子。將bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，轉(zhuǎn)染3天后收取培養(yǎng)上清，得到第1代重組桿狀病毒。連續(xù)擴(kuò)毒3代，所獲第4代桿狀病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。根據(jù)滴定結(jié)果選取合適的病毒moi感染sf9或者昆蟲細(xì)胞系hi5做表達(dá)，48小時(shí)后離心收集細(xì)胞上清，進(jìn)行細(xì)胞純化。實(shí)施例2：mers-rbd和sars-rbd的純化將表達(dá)mers-rbd和sars-rbd的細(xì)胞上清通過0.22μm的濾膜過濾，除去細(xì)胞碎片。并通過hitrapqhp陰離子交換柱進(jìn)行目的蛋白的捕獲，隨即通過含有1mnacl的緩沖液洗脫進(jìn)行粗純。經(jīng)過sds-page鑒定后收集合并含有目的蛋白的組分。作為a液上樣疏水柱hitrapphenylhp進(jìn)行結(jié)合。配制低鹽洗脫液b液(20mmtris-hclph8.0)進(jìn)行梯度洗脫。將洗脫下來的rbd進(jìn)行sds凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白。通過疏水層析粗純得到含目的蛋白的洗脫峰合并，通過10k截留濃縮管(millipore)進(jìn)行濃縮至5ml，再通過superdex200hiload16/60柱子(ge)進(jìn)行分子篩層析進(jìn)行進(jìn)一步的目的蛋白純化。分子篩層析緩沖液為20mmtris，150mmnacl，ph8.0。取mers-rbd蛋白在洗脫體積78ml附近的洗脫峰進(jìn)行sds-page分析。目的蛋白在非還原條件下(不加dtt)的情況下大小約為60kd；而在還原條件下(加入dtt)，大小約為30kd，證明該峰主要是二聚體。取洗脫體積90ml附近的洗脫峰進(jìn)行sds-page分析，目的蛋白在非還原條件下(不加dtt)的情況下大小約為30kd，證明該峰主要是rbd單體。同樣的sars-rbd蛋白在洗脫體積82ml附近的洗脫峰主要是二聚體(非還原條件下大小約55kd，還原條件下大小約28kd)，而在洗脫體積92ml附近的洗脫峰主要是rbd單體(非還原條件下大小約28kd)。典型的mers-rbd和sars-rbd蛋白分子篩圖譜和sds-page分析圖分別如圖1，2所示。收集合并rbd二聚體的洗脫峰，重新通過superdex200hiload16/60柱子(ge)進(jìn)行進(jìn)一步純化，獲得純度大于99％的二聚體rbd蛋白。目的蛋白濃縮后，分裝成小份，用液氮迅速冷凍后于-80℃保存。帶his標(biāo)簽的mers-rbd和sars-rbd通過鎳柱進(jìn)行粗純。將過濾后的細(xì)胞上清液與histrap_hp于4℃結(jié)合過夜。之后，首先使用緩沖液(20mmtris,150mmnacl,ph8.0)進(jìn)行洗滌，去除流穿的雜蛋白。其后，通過含咪唑緩沖液(20mmtris,150mmnacl,ph8.0,300mmimidazole)進(jìn)行目的蛋白洗脫。使用10k截留濃縮管(millipore)進(jìn)行濃縮至體積5ml，再通過superdex200hiload16/60柱子(ge)進(jìn)行分子篩層析進(jìn)行進(jìn)一步的目的蛋白純化。分子篩層析緩沖液為20mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0的溶液。mers-rbd在洗脫體積90ml附近的洗脫峰為rbd單體，大小約為28kd。沒有二聚體峰。sars-rbd在洗脫體積92ml附近的洗脫峰為rbd單體，大小約為28kd。沒有二聚體峰。收集合并目的蛋白，通過濃縮管(milipore)濃縮后，分裝成小份，用液氮迅速冷凍后于-80℃保存。實(shí)施例3：小鼠免疫實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例2得到的mers和sars抗原按照表1的方法于生理鹽水中稀釋，并與佐劑進(jìn)行分組乳化。然后對(duì)4-6周齡的balb/c小鼠進(jìn)行分組免疫。免疫策略如圖3，即通過大腿肌肉注射的方式，每只小鼠分別在第0天，第21天，第42天接受3次疫苗免疫，每次100ul的接種體積。第54天(即3免后的第12天)，對(duì)小鼠進(jìn)行尾部取血。小鼠血清在靜置一段時(shí)間待血清析出后，通過3000rpm離心10分鐘獲得，并于-20℃冰箱保存，用于假病毒中和檢測(cè)。表1：動(dòng)物免疫分組情況抗原或?qū)φ湛乖孔魟﹦?dòng)物數(shù)量pbs-mf594pbs-鋁佐劑4rbd二聚體3μg,10μgmf593μg,10μg各4只rbd單體3μg,10μgmf593μg,10μg各4只rbd二聚體10μg*，30μg鋁佐劑10μg，30μg各4只rbd單體10μg*，30μg鋁佐劑10μg，30μg各4只*用于sars-rbd的免疫不含10μg抗原組。實(shí)施例4：假病毒中和試驗(yàn)i)假病毒的制備：通過轉(zhuǎn)染試劑pei將質(zhì)粒pcaggs-merss(是指表達(dá)merss的哺乳動(dòng)物載體pcaggs，其中sars假病毒制備使用pcaggs-sarss)與hivpnl4-3.luc.re(invitrogen)共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，pbs洗滌細(xì)胞2次，換為無血清dmem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48小時(shí)后收取上清，離心去除細(xì)胞碎片。假病毒通過上清超速離心機(jī)30000rpm離心3小時(shí)進(jìn)行沉淀，后用小體積無血清dmem溶解獲得濃縮的mers和sars假病毒。分裝保存于-80℃條件。ii)假病毒tcid50測(cè)定將上一步收取的病毒液按5倍比稀釋，加入到96孔板中的人肝癌huh7細(xì)胞中。感染4小時(shí)后，棄掉病毒液，pbs洗滌細(xì)胞2尺，換為含10％血清的dmem完全培養(yǎng)基。48小時(shí)候，棄掉培養(yǎng)基，pbs洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液。-80℃凍融一次后，每孔取20μl利用glomax96microplateluminometer(promega)檢測(cè)熒光素酶活性值。通過reed-muech法計(jì)算tcid50。iii)中和試驗(yàn)將純化的抗體2倍倍比稀釋，與100tcid50假病毒混合，37℃共孵育30分鐘。將混合液加入到已鋪滿huh7細(xì)胞的96孔板中。37℃孵育4小時(shí)后，棄掉病毒液，pbs洗滌細(xì)胞2次，換為含10％血清的完全培養(yǎng)基dmem。48小時(shí)后，棄掉培養(yǎng)液，pbs洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，檢測(cè)熒光素酶活性值。iv)結(jié)果分析陽性標(biāo)準(zhǔn)：熒光素酶活性值<(陽性對(duì)照-陰性對(duì)照)/2的血清，即為有中和活性的陽性血清。血清稀釋度最高的陽性孔的稀釋倍數(shù)計(jì)為nt50(抑制50％病毒的血清中和滴度)。將二聚體和單體rbd免疫后動(dòng)物的血清的假病毒中和抗體水平進(jìn)行比較，利用t檢驗(yàn)對(duì)組間進(jìn)行差異顯著性分析。最后通過雙尾概率p值判斷顯著性水平。在顯著性水平為0.05的情況下，雙尾概率水平小于0.05時(shí)表示兩組樣本的均值存在顯著差異；當(dāng)概率p值大于0.05時(shí)可以認(rèn)為兩組樣本的方差無顯著差異，即通過了levene方差齊檢驗(yàn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對(duì)于mers疫苗而言，無論與mf59還是鋁佐劑合用，rbd二聚體免疫都能激發(fā)小鼠產(chǎn)生很高效價(jià)的中和抗體，其中最高效價(jià)可達(dá)3000以上，組內(nèi)差異小。而rbd單體僅有3μg劑量與mf59合用時(shí)產(chǎn)生效價(jià)260的中和抗體，遠(yuǎn)小于平行對(duì)照的二聚體組所激發(fā)的中和抗體效價(jià)，且差異顯著。而rbd單體的其他幾個(gè)劑量組分與佐劑合用都不產(chǎn)生可檢測(cè)到的中和抗體(小于20)，與平行的二聚體組比較差異顯著(表2)。這提示mersrbd二聚體作為疫苗的免疫原性顯著的大于rbd單體。同樣的對(duì)于sars疫苗而言，所有使用二聚體的免疫組都產(chǎn)生了很高的中和抗體水平，都在1900到3900之間，組內(nèi)差異小。盡管rbd單體能激發(fā)小鼠產(chǎn)生一定水平的中和抗體，但仍然顯著的小于平行的rbd二聚體(表2)。這提示sarsrbd二聚體作為疫苗能夠顯著的提高sars-rbd疫苗的免疫原性。表2mers-cov和sars-covrbd疫苗激發(fā)小鼠中和抗體水平的檢測(cè)*表示二聚體免疫組與平行的單體免疫組的中和抗體水平通過t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著p<0.05雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12