本發(fā)明涉及一種多肽藥物的純化方法。
背景技術(shù)：
：一對或多對半胱氨酸殘基之間所形成的二硫鍵對維持多肽空間構(gòu)象以及某些生物學(xué)活性起著重要的作用?，F(xiàn)有的許多藥物都需要二硫鍵的存在才具有活性，例如如：奧曲肽、奈西立肽、愛啡肽、阿托西班和特利加壓素等等，因此二硫鍵的氧化方法一直是多肽行業(yè)研究的重點。目前多肽二硫鍵氧化的常規(guī)方法是先采用空氣、雙氧水、碘等氧化劑進行氧化，再利用反相液相色譜進行純化，得到最終產(chǎn)物。此方法雖然在15min-30min即可完成氧化，氧化速度較快，但停止氧化反應(yīng)后還需要經(jīng)過反相液相色譜純化，才能得到所需的產(chǎn)物。而不同的氧化方法，在進行下一步反相色譜純化前的處理過程也不相同。例如愛啡肽按照常規(guī)方法用雙氧水氧化后，溶液體積較大，需多重過濾后方可進行純化；奈西利肽先用氧氣氧化，再經(jīng)過旋蒸、過濾后，方可進行純化，等等。這些方法的步驟都過于繁瑣，需控制的參數(shù)也多，不利于對多肽質(zhì)量的控制。多肽的穩(wěn)定性本身較差，特別對于一些性質(zhì)極不穩(wěn)定的多肽而言，在終止氧化反應(yīng)后，進行后續(xù)步驟之前，強氧化劑就有可能已經(jīng)破壞了多肽本身的結(jié)構(gòu)，引起多肽變性。所以減少氧化操作步驟，縮短處理時間對提高氧化收率，控制產(chǎn)品質(zhì)量顯得尤為重要。本發(fā)明為解決這些問題，提供了一種在純化的同時完成多肽氧化的方法。不僅簡化了操作過程，縮短了整個工藝的處理時間，更加避免了多肽與強氧化劑長時間接觸引起的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所導(dǎo)致的收率降低。對于多肽的二硫鍵氧化主要有以下幾種方式，一是多肽固相或液相合成過程中進行氧化，經(jīng)過裂解后，得到的就是氧化產(chǎn)物，然后進行純化，如：cn102827249a；二是固相合成線性粗肽，裂解后將線性粗肽溶解后進行液相氧化，然后再進行純化如：cn103304655a、cn104710509a；或是將線性粗肽純化提高純度后再進行二硫鍵氧化，以提高氧化產(chǎn)物純度或反應(yīng)效率，但是每種二硫鍵氧化方法都有其優(yōu)缺點，固相氧化對某些短肽或某些只需成一對二硫鍵的多肽更為合適；液相氧化費時費力，但氧化后的純度相對較高，對于后續(xù)純化提供了便利。為了提高藥物的安全性，現(xiàn)有多肽藥物要求純度越高越好，大多要求純度大于99％，并需對單雜進行控制，要求單雜小于0.15％，固相氧化雜質(zhì)較多，不利于質(zhì)量控制；如果采用液相氧化后進行純化，雖然液相氧化完全，純度較高，但氧化處理工序 較繁瑣，費時費力。本發(fā)明提供了一種新液相二硫鍵氧化方法，區(qū)別于傳統(tǒng)氧化思路，可以彌補固相氧化收率、純度低，傳統(tǒng)液相氧化方法費時費力的缺點，操作簡便的同時大大提高氧化純度及收率，并且易于放大生產(chǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種新的液相氧化方法，將多肽藥物線性粗肽直接在制備色譜柱上實現(xiàn)二硫鍵氧化。主要是以含有氧化劑的溶液為a1相，以有機溶劑為b相，在色譜柱上梯度洗脫多肽藥物的同時，對多肽藥物線性肽進行氧化，收集到的樣品即為氧化后的多肽原料藥。本發(fā)明涉及一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法，將待純化氧化的粗肽在色譜柱上進行分離，同時進行氧化；其是將粗肽以包含氧化劑的流動相進行洗脫同時氧化；優(yōu)選地，包括以下步驟：將粗肽以流動相a相和b相進行沖洗，其中，a相為無機鹽水溶液，a相中還包含氧化二硫鍵的氧化劑；進一步地，a相中所述氧化劑選自雙氧水、dmso、碘以及金屬離子氧化劑(fe3+、cu2+、ag+)的一種或者幾種；優(yōu)選地，金屬離子氧化劑選自fe2o3。進一步地，a相中的氧化劑為雙氧水或dmso，且a相的ph為7.5-9.0。進一步地，a相中的氧化劑為碘，且其ph為2.5-9.0，優(yōu)選為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。進一步地，所述氧化劑摩爾數(shù)為粗肽摩爾數(shù)的2-10倍，優(yōu)選3、4、5、6、7、8、9倍。進一步地，a相中包含水和無機鹽，b相中包含有機溶劑，優(yōu)選地，b相中包含乙腈、甲醇、異丙醇、乙醇、四氫呋喃中的一種或多種，無機鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉中的一種或多種。進一步地，所述色譜柱固定相選自硅膠基質(zhì)、聚合物高分子、氧化鋯。進一步地，含二硫鍵多肽選自奧曲肽、愛啡肽、奈西立肽、阿托西班、特利加壓素、齊考諾肽、利那洛肽、去氨加壓素等。本發(fā)明所用洗脫程序和洗脫劑可以采用任何能夠?qū)⒍嚯倪M行分離的程序和洗脫劑。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相a相，在a相中加入氧化劑，混合均勻；以色譜純甲醇為b相。以60-80ml/min的流速，檢測波230nm。b相洗脫梯度：b％：15％—35％，50-70min。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相a，并添加入氧化劑，混合均勻；色譜純甲醇作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。b相洗脫 梯度：b％：8％—20％，50-70min。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相a，并添加入氧化劑，混合均勻；乙腈作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。b相乙腈洗脫梯度：b％：18％—28％，50-70min。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相a，并添加入氧化劑，混合均勻；乙醇作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：220nm。b相乙醇洗脫梯度：b％：25％—45％，50-70min。本發(fā)明通過將氧化和純化合二為一，一步完成，省時省力，氧化的同時實現(xiàn)粗肽中的異構(gòu)體雜質(zhì)和其他難分離雜質(zhì)的有效分離，然后利用反相hplc方法轉(zhuǎn)成醋酸鹽或者其它成鹽形式，最終提高了產(chǎn)品的收率和純度。同時解決了固相氧化收率、純度低，液相氧化費時費力的缺點。本方法操作簡便，有利于實現(xiàn)規(guī)?；闹苽?，提供了一種液相氧化的新方法。本法明所述色譜柱為硅膠基質(zhì)、聚合物高分子、氧化鋯類型的反相色譜柱，包括c1、c4、c8、c18等類型色譜柱。均可用于該液相二硫鍵氧化方法的固定相。所有可以溶解二硫鍵氧化劑的溶液均可以作為本發(fā)明的洗脫流動a相，包括水、各種無機鹽等。b相可以為各種有機相，如乙腈、甲醇、異丙醇等等。本發(fā)明所述ph限定范圍，依據(jù)二硫鍵氧化方式不同而不同，對于雙氧水、空氣、dmso需在堿性環(huán)境中進行的氧化方式，ph限定范圍7.5-9.0；采用碘氧化時，ph限定范圍為2.5-9.0；金屬離子做二硫鍵氧化劑適合所有ph，優(yōu)選ph范圍為1.5-11.5.本發(fā)明所涉及的二硫鍵氧化劑較多，不限于dmso、雙氧水、碘以及金屬離子氧化劑的一種或者幾種，只要溶于洗脫流動相中的氧化劑均可作為本發(fā)明的氧化劑。本發(fā)明所述氧化劑濃度主要是根據(jù)待純化物質(zhì)摩爾數(shù)的2-10倍。附圖說明圖1為線性粗肽質(zhì)譜。圖2為精肽質(zhì)譜。圖3為實施例1分離純化后hplc譜圖。圖4為實施例2分離純化后hplc譜圖。圖5為實施例3分離純化后hplc譜圖。圖6為實施例4分離純化后hplc譜圖。圖7為實施例5分離純化后hplc譜圖。具體實施方式可使用的不同色譜柱規(guī)格包括：5cm×25cm(柱子直徑×長度)、10cm×25cm、15cm×25cm。實施例1：奧曲肽粗肽純化將奧曲肽線性粗肽2.0g溶解過濾，收集濾液備用。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為5cm×25cm。制備過程：將100mmol/l的磷酸二氫鉀溶液用氨水調(diào)ph至8.5作為流動相a相，在a相中加入10g雙氧水，混合均勻；以色譜純甲醇為b相。以60-80ml/min的流速，檢測波230nm。b相洗脫梯度：以b％：15％—35％，50-70min的梯度變化對樣品進行梯度洗脫。純化完成，同時完成氧化。將上步驟得到的氧化純化多肽形成穩(wěn)定的鹽類，冷凍干燥后即可得到純度大于99.0％的符合標準奧曲肽。凍干后得白色粉末狀固體精肽0.75g。純度99.28％，單個雜質(zhì)均小于0.15％。純化收率68％(以粗品中奧曲肽含量計算)，總收率37.5％，純化一批總共需要1.6h.實施例2：奧曲肽粗肽純化將奧曲肽粗肽15g溶解過濾，收集濾液備用。1色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為10cm×25cm。將100mmol/l的磷酸二氫鈉溶液用氨水調(diào)ph至8.0作為流動相a，，并添加150g雙氧水；色譜純甲醇作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。b相洗脫梯度：以b％：8％—20％，50-70min的梯度變化對樣品進行梯度洗脫。純化完成，同時完成氧化。將上步驟得到的氧化純化多肽形成穩(wěn)定的鹽類，冷凍干燥后即可得到純度大于99.0％的符合標準奧曲肽。凍干后得白色粉末狀固體精肽6.1g。純度99.30％，單個雜質(zhì)均小于0.15％。純化收率73.9％(以粗品中奧曲肽含量計算)，總收率40.6％，純化一批總共需要1.6h。實施例3：奧曲肽粗肽純化將奧曲肽粗肽25g溶解過濾，收集濾液備用。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為15cm×25cm。將100mmol/l的磷酸二氫鈉溶液用氨水調(diào)ph至7.5，并添加150g雙氧水作為a相；色譜純甲醇作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。b相洗脫梯度：以b％：8％—20％，50-70min的梯度變化對樣品進行梯度洗脫。純化完成，同時完成氧化。將上步驟得到的氧化純化多肽形成穩(wěn)定的鹽類，冷凍干燥后即可得到純度大于99.0％的符合標準奧曲肽。凍干后得白色粉末狀固體精肽8.9g。純度99.30％，單個雜質(zhì)均小于0.15％。純化收率64％(以粗品中奧曲肽含量計算)，總收率35.6％，純化一批總共需要 1.6h。實施例4：愛啡肽純化將愛啡肽粗肽250g溶解，然后將溶液過0.45μm濾膜，耗時約1小時，收集濾液備用。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為15cm×25cm。將50mmol/l的磷酸二氫鈉溶液用氨水調(diào)ph至8.0，并添加140g雙氧水，作為a相；色譜純乙腈作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。b相乙腈洗脫梯度：以b％：18％—28％，50-70min的梯度變化對樣品進行梯度洗脫。純化完成，同時完成氧化將上步驟得到的氧化純化多肽形成穩(wěn)定的鹽類，冷凍干燥后即可得到純度大于99.0％的符合標準愛啡肽。凍干后得白色粉末狀固體精肽85g。純度99.40％，單個雜質(zhì)均小于0.15％。純化收率58％(以粗品中愛啡肽含量計算)，總收率34％。耗時如下：過濾時間1小時純化時間30小時總時間31小時實施例5：齊考諾肽純化將齊考諾肽線性粗肽15g溶解過濾，收集濾液備用。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為10cm×25cm。將61.5克氫氧化鈉，溶于10l水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ph7.0，并添加三氧化二鐵8g，作為流動相a；色譜純乙醇作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：220nm。b相乙醇洗脫梯度：b％：25％—45％，50-70min的梯度變化對樣品進行梯度洗脫。純化完成，同時完成氧化。將上步驟得到的氧化純化多肽形成穩(wěn)定的鹽類，冷凍干燥后即可得到純度大于99.0％的符合標準醋酸齊考諾肽。凍干后得白色粉末狀固體精肽3.2g。純度99.32％，單個雜質(zhì)均小于0.15％。純化收率61％(以粗品中齊考諾肽線性肽含量計算)，總收率32％。對比例1：愛啡肽放大粗肽純化將愛啡肽粗肽250g溶解過濾，進行液相氧化，溶解濃度1mg/ml，1小時后氧化完成，然后過濾，因氧化后雜質(zhì)變化，溶液極其難過濾，需經(jīng)過兩步過濾，一步粗過濾，一步精細過濾，粗過濾去掉大部分不溶物后再過濾0.45μm濾膜，耗時約10小時，然后進行反相純化。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規(guī)格為15cm×25cm。將50mmol/l的磷酸二氫鈉溶液用氨水調(diào)ph至8.0，作為a相色譜純乙腈作為b相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。以b％：18％—28％，50-70min 的梯度變化對樣品進行梯度洗脫。將上步驟得到的氧化純化多肽形成穩(wěn)定的鹽類，冷凍干燥后即可得到純度大于99.0％的符合標準的愛啡肽。凍干后得白色粉末狀固體精肽58g。純度99.31％，單個雜質(zhì)均小于0.15％。純化收率40％(以粗品中愛啡肽含量計算)，總收率23％。耗時如下：過濾時間10小時純化時間30小時氧化時間1小時總共耗時41小時純化一批250g愛啡肽粗肽耗時41h，氧化完成后氧化后的粗肽需放置20h，在這個過程中產(chǎn)品穩(wěn)定性難以把控。本發(fā)明的氧化純化方法能夠?qū)⑹章蕪闹暗?3％提高至34％，提高了50％同時產(chǎn)能增加(41-31)/31＝32％，同時加上收率提高50％，可見方法的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中的方法因為氧化后放置時間過長，氧化產(chǎn)物有所變化，難以去除，進而影響純化效果，如遇不穩(wěn)定的產(chǎn)品，質(zhì)量更將難以保證，本發(fā)明的方法創(chuàng)造性地將氧化步驟在色譜柱中進行，而氧化劑加入的方法又保證了氧化后粗肽質(zhì)量一樣，本發(fā)明的方法能夠?qū)a(chǎn)能提高30％，收率同時提高50％。當(dāng)前第1頁12