本發(fā)明涉及多肽分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種帶魚抗氧化肽分離純化方法。

背景技術(shù)：

帶魚（largeheadhairtail），別稱刀魚、牙帶魚，屬于脊索動物門、鱸形目，體型呈帶狀。主要分布于西太平洋和印度洋，在中國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊并稱為中國的四大海產(chǎn)。

2014年度，舟山市帶魚捕獲量達(dá)到108104噸，占主要漁獲品種的比例達(dá)到11.52%。舟山帶魚多以新鮮或加工成各種魚制品出售，然而帶魚的開發(fā)利用依然處于粗加工階段，高附加值的利用程度較低。

帶魚的平均蛋白含量達(dá)到18.4%以上，這使得它成為豐富的蛋白質(zhì)原材料來源。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解等特殊處理，可以制備具備一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我國對帶魚蛋白的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但是還未能開發(fā)出高活性的蛋白，還未能更佳充分地開發(fā)利用帶魚資源。因此，對帶魚蛋白的深入研究，開發(fā)出具備高附加值的帶魚蛋白產(chǎn)品成為迫在眉睫的問題。

生物活性肽，是指蛋白質(zhì)中的20種左右天然氨基酸以不同的排列和組合的方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的各種肽類的總稱?；钚噪暮腿梭w代謝和生理調(diào)節(jié)等具有密切的關(guān)系，展現(xiàn)出提高免疫力、抑菌、抗病毒、清除自由基、降血壓以及血脂等功效，食用安全性極高。因此，活性肽成為目前食品、藥品等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一并取得了較好的發(fā)展態(tài)勢。

酶解法制備活性肽，條件溫和，無需添加劇烈的化學(xué)試劑，沒有有毒有害物質(zhì)的生成，多肽回收率較高。這些優(yōu)點(diǎn)，使得酶解法在蛋白質(zhì)深加工和活性成分提取領(lǐng)域被深入研究和廣泛應(yīng)用。在生物活性肽的研究中，多肽的純度和分子量的大小都會對其活性產(chǎn)生很大的影響。蛋白質(zhì)的氨基酸組成多樣、分子量大小差異顯著、蛋白分子空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，且不同的蛋白酶作用于肽鏈的位點(diǎn)不同，使得水解后獲得的酶解產(chǎn)物非常不均。所以需要將活性高的多肽分離純化，來提高活性肽的性能。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn102495169b的中國發(fā)明專利，公開了一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。該方法涉及枯草芽孢桿菌zj016氨肽酶和中性蛋白酶復(fù)配酶解一種成本低廉的末水條斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。該粗品利用sephadexg-10、deae-52和source3rpc等色譜手段分離純化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通過測定dpph消除能力，清除超氧自由基能力，清除羥自由基能力和還原力來綜合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。經(jīng)rp-hplc分析型色譜測定其純度，q-tof-ms分析鑒定其氨基酸組成，并對其抗氧化活性的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。該紫菜抗氧化活性肽的純度不夠，使得其抗氧化性能不是很理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能制得純度高，活性強(qiáng)，分子量小，穩(wěn)定度高，dpph自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力和超氧陰離子清除能力強(qiáng)的帶魚抗氧化肽分離純化方法。

本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：

帶魚抗氧化肽分離純化方法，具體步驟：

預(yù)處理：將帶魚去頭、去皮、去內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，剪成小塊，在去腥液中浸泡去腥，脫脂；

酶解：采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶雙步酶解，過濾得到帶魚抗氧化活性肽酶解液；

超濾：將步驟2得到的酶解液超濾，超濾膜規(guī)格為900~1200da，壓力為0.6~1.2pa，得到濾過液，冷凍干燥。抗氧化活性強(qiáng)的活性肽的分子量小，通過超濾，可將不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白質(zhì)除去，提高活性肽純度；

qff陰離子交換層析：在qff中加入超純水，緩慢倒入抽濾瓶中，連接抽濾機(jī)，抽干其中的氣泡，在抽氣的過程中，置換蒸餾水，去掉殘存的乙醇。抽氣完畢后，將qff溶液沿著玻璃漏斗緩慢裝柱，待裝柱完畢靜置20~40min后，用5~6倍裝柱體積，ph為8.2~8.5，濃度為1.2~1.4mol/l的tris-hcl緩沖液進(jìn)行平衡。在步驟3干燥得到的粉末中加入緩沖液tris-hcl，過0.45um微濾膜，去除固體殘?jiān)炔蝗芙獾某煞?。隨后，用吸入法上樣。上樣完畢，分別用tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、0.1molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、0.5molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、1molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉，梯度洗脫1.8~2.2個體積，流速為2.5~3.5ml/min，每18~23s收集一管洗脫液，于220nm和280nm處檢測吸光值。。tris-hcl緩沖液ph為8.2~8.5，濃度為1.2~1.4mol/l。按峰合并試管內(nèi)溶液，得到6個峰的溶液，分別為qff-1、qff-2、qff-3、qff-4、qff-5和qff-6，冷凍干燥備用。在qff洗脫中增加了tris-hcl緩沖液和硼酸鈉，有效地提高了蛋白的掛柱率，避免了部分蛋白在未加nacl的時候就被洗脫下來，造成活性蛋白的浪費(fèi)，提高了活性蛋白的提取率；洗脫速度快，節(jié)約能源，降低人力和時間成本，有效保持活性肽的品質(zhì)；

凝膠色譜層析：用蒸餾水常溫浸泡凝膠20~26h，待凝膠充分溶脹，吸去上層懸浮的膠粒，倒入抽濾瓶中，抽真空，排除凝膠顆粒中的氣泡，增強(qiáng)對樣品的分離效果。先往層析柱中注入1/5~1/3柱體積的超純水，沿壁連續(xù)緩慢注入凝膠，吸耳球輕擊層析柱，使凝膠表面平滑且柱內(nèi)無氣泡。以1.6~2.3倍量柱體積的超純水平衡柱子。在qff-3冷凍干燥得到的粉末中加入蒸餾水，吸管貼壁緩慢進(jìn)樣，待樣品剛好完全流入柱內(nèi)，吸取蒸餾水，將燒杯及層析柱壁上的樣品沖洗干凈。流動相為超純水，流速為1.6~2.4ml/min，每1.6~2.3min收集一管。使用紫外分光光度計(jì)測定每管樣品在280nm處的紫外吸收值。按峰合并，得到2個峰的溶液，分別為qff-3-1和qff-3-2，冷凍干燥備用。凝膠色譜根據(jù)分子量大小不同，將多肽分子分離開來，從而達(dá)到純化分離的目的；

高效液相色譜層析：將qff-3-1冷凍干燥得到的粉末用乙腈和純水進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫，洗脫時間、洗脫液成份及其百分比和流速依次為：0~5min，乙腈5%，純水95%，流速0.5~0.7ml/min；5~10min，乙腈10%，純水90%，流速0.5~0.7ml/min；10~20min，乙腈60%，純水40%，流速0.7~0.9ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.7~0.9ml/min；30~40min，乙腈60%，純水40%，流速0.5~0.7ml/min；40~50min，乙腈20%，純水80%，流速0.7~0.9ml/min。收集洗脫液，旋蒸得到高純度帶魚抗氧化肽。帶魚抗氧化肽的氨基酸序列為：hshacasyycskfcgtascthylcrvlhpgklcvcvncsr。上述方法制得的抗氧化肽純度很高，dpph自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力和超氧陰離子清除能力很強(qiáng)，與最初的酶解液相比，抗氧化能力提高了很多。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用900~1200da的超濾膜進(jìn)行超濾，氧化活性強(qiáng)的活性肽的分子量小，通過超濾，可將不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白質(zhì)除去，提高活性肽純度；qff陰離子交換層析，在qff洗脫中增加了tris-hcl緩沖液和硼酸鈉，有效地提高了蛋白的掛柱率，避免了部分蛋白在未加nacl的時候就被洗脫下來，避免了活性蛋白的浪費(fèi)，提高了活性蛋白的提取率；洗脫速度快，節(jié)約能源，降低人力和時間成本，有效保持活性肽的品質(zhì)；凝膠色譜層析，采用超純水為流動相，根據(jù)分子量大小不同，將多肽分子分離開來，從而達(dá)到純化分離的目的；高效液相色譜層析，用乙腈和純水進(jìn)行梯度洗脫，高度純化抗氧化肽，與最初的酶解液相比，最后得到的活性肽的dpph自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力和超氧陰離子清除能力大大提高。

具體實(shí)施例

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

帶魚抗氧化肽分離純化方法，具體步驟：

1）預(yù)處理：將帶魚去頭、去皮、去內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，剪成小塊，在去腥液中浸泡去腥，脫脂；

2）酶解：采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶雙步酶解，過濾得到帶魚抗氧化活性肽酶解液；

3）超濾：將步驟2得到的酶解液超濾，超濾膜規(guī)格為900~1200da，壓力為0.6~1.2pa，得到濾過液，冷凍干燥?？寡趸钚詮?qiáng)的活性肽的分子量小，通過超濾，可將不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白質(zhì)除去，提高活性肽純度；

4）qff陰離子交換層析：在qff中加入超純水，緩慢倒入抽濾瓶中，連接抽濾機(jī)，抽干其中的氣泡，在抽氣的過程中，置換蒸餾水，去掉殘存的乙醇。抽氣完畢后，將qff溶液沿著玻璃漏斗緩慢裝柱，待裝柱完畢靜置20~40min后，用5~6倍裝柱體積，ph為8.2~8.5，濃度為1.2~1.4mol/l的tris-hcl緩沖液進(jìn)行平衡。在步驟3干燥得到的粉末中加入緩沖液tris-hcl，過0.45um微濾膜，去除固體殘?jiān)炔蝗芙獾某煞?。隨后，用吸入法上樣。上樣完畢，分別用tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、0.1molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、0.5molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、1molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉，梯度洗脫1.8~2.2個體積，流速為2.5~3.5ml/min，每18~23s收集一管洗脫液，于220nm和280nm處檢測吸光值。。tris-hcl緩沖液ph為8.2~8.5，濃度為1.2~1.4mol/l。按峰合并試管內(nèi)溶液，得到6個峰的溶液，分別為qff-1、qff-2、qff-3、qff-4、qff-5和qff-6，冷凍干燥備用。在qff洗脫中增加了tris-hcl緩沖液和硼酸鈉，有效地提高了蛋白的掛柱率，避免了部分蛋白在未加nacl的時候就被洗脫下來，避免了活性蛋白的浪費(fèi)，提高了活性蛋白的提取率；洗脫速度快，節(jié)約能源，降低人力和時間成本，有效保持活性肽的品質(zhì)；

5）凝膠色譜層析：用蒸餾水常溫浸泡凝膠20~26h，待凝膠充分溶脹，吸去上層懸浮的膠粒，倒入抽濾瓶中，抽真空，排除凝膠顆粒中的氣泡，增強(qiáng)對樣品的分離效果。先往層析柱中注入1/5~1/3柱體積的超純水，沿壁連續(xù)緩慢注入凝膠，吸耳球輕擊層析柱，使凝膠表面平滑且柱內(nèi)無氣泡。以1.6~2.3倍量柱體積的超純水平衡柱子。在qff-3冷凍干燥得到的粉末中加入蒸餾水，吸管貼壁緩慢進(jìn)樣，待樣品剛好完全流入柱內(nèi)，吸取蒸餾水，將燒杯及層析柱壁上的樣品沖洗干凈。流動相為超純水，流速為1.6~2.4ml/min，每1.6~2.3min收集一管。使用紫外分光光度計(jì)測定每管樣品在280nm處的紫外吸收值。按峰合并，得到2個峰的溶液，分別為qff-3-1和qff-3-2，冷凍干燥備用。凝膠色譜根據(jù)分子量大小不同，將多肽分子分離開來，從而達(dá)到純化分離的目的；

6）高效液相色譜層析：將qff-3-1冷凍干燥得到的粉末用乙腈和純水進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫，洗脫時間、洗脫液成份及其百分比和流速依次為：0~5min，乙腈5%，純水95%，流速0.5~0.7ml/min；5~10min，乙腈10%，純水90%，流速0.5~0.7ml/min；10~20min，乙腈60%，純水40%，流速0.7~0.9ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.7~0.9ml/min；30~40min，乙腈60%，純水40%，流速0.5~0.7ml/min；40~50min，乙腈20%，純水80%，流速0.7~0.9ml/min。收集洗脫液，旋蒸得到高純度帶魚抗氧化肽。上述方法制得的抗氧化肽純度很高，dpph自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力和超氧陰離子清除能力很強(qiáng)，與最初的酶解液相比，抗氧化能力提高了很多。

實(shí)施例2：

1）預(yù)處理：將帶魚去頭、去皮、去內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，剪成4cm長小塊，按料液比1:6加入去腥液，浸泡，浸泡時間為7h。去腥液成份及其最優(yōu)選重量份為：8份檸檬酸、17份紫蘇提取物、0.1份氯化鈉、0.5份碳酸氫鈉、0.001份烏索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份維生素e。搗碎，過40目篩，按體積比1:5加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為22h。過濾，濾渣中按體積比1:3加入去離子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，過濾，將濾渣放入電熱鼓風(fēng)干燥箱45℃烘干，得到去脂帶魚粉末。

2）酶解：在帶魚粉末中加入蒸餾水，調(diào)節(jié)ph為7.0，加入1.5%木瓜蛋白酶，加熱，酶解溫度為50℃，酶解時間為5.0h。調(diào)節(jié)ph為8.5，加入3%堿性蛋白酶，加熱，酶解溫度為45℃，酶解時間為4.5h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，得到帶魚抗氧化活性肽酶解液。

3）超濾：將步驟2得到的酶解液超濾，超濾膜規(guī)格為1000da，壓力為0.8pa，得到濾過液，冷凍干燥。抗氧化活性強(qiáng)的活性肽的分子量小，通過超濾，可將不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白質(zhì)除去，提高活性肽純度；

4）qff陰離子交換層析：在qff中加入超純水，緩慢倒入抽濾瓶中，連接抽濾機(jī)，抽干其中的氣泡，在抽氣的過程中，置換蒸餾水，去掉殘存的乙醇。抽氣完畢后，將qff溶液沿著玻璃漏斗緩慢裝柱，待裝柱完畢靜置40min后，用6倍裝柱體積，ph為8.4，濃度為1.3mol/l的tris-hcl緩沖液進(jìn)行平衡。在步驟3干燥得到的粉末中加入緩沖液tris-hcl，過0.45um微濾膜，去除固體殘?jiān)炔蝗芙獾某煞?。隨后，用吸入法上樣。上樣完畢，分別用tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、0.1molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、0.5molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉、1molnacl+tris-hcl+0.001mol硼酸鈉，梯度洗脫2個體積，流速為3ml/min，每20s收集一管洗脫液，于220nm和280nm處檢測吸光值。。tris-hcl緩沖液ph為8.4，濃度為1.3mol/l。按峰合并試管內(nèi)溶液，得到6個峰的溶液，分別為qff-1、qff-2、qff-3、qff-4、qff-5和qff-6，冷凍干燥備用。在qff洗脫中增加了tris-hcl緩沖液和硼酸鈉，有效地提高了蛋白的掛柱率，避免了部分蛋白在未加nacl的時候就被洗脫下來，避免了活性蛋白的浪費(fèi)，提高了活性蛋白的提取率；洗脫速度快，節(jié)約能源，降低人力和時間成本，有效保持活性肽的品質(zhì)；

5）凝膠色譜層析：稱量sephadexg-1550g，用蒸餾水常溫浸泡24h，待凝膠充分溶脹，吸去上層懸浮的膠粒，倒入抽濾瓶中，抽真空，排除凝膠顆粒中的氣泡，增強(qiáng)對樣品的分離效果。選擇直徑2.6cm，柱長為90cm的層析柱，洗凈組件，垂直安裝于鐵架臺上。灌膠前，先注入1/4柱體積的超純水，沿壁連續(xù)緩慢注入凝膠，吸耳球輕擊層析柱，使凝膠表面平滑且柱內(nèi)無氣泡。以2倍量柱體積的超純水平衡柱子。稱取qff-3冷凍干燥得到的粉末50mg，充分溶于2ml蒸餾水中，吸管貼壁緩慢進(jìn)樣，待樣品剛好完全流入柱內(nèi)，吸取蒸餾水，將燒杯及層析柱壁上的樣品沖洗干凈。流動相為超純水，流速為2ml/min，每2min收集一管。使用紫外分光光度計(jì)測定每管樣品在280nm處的紫外吸收值。按峰合并，得到2個峰的溶液，分別為qff-3-1和qff-3-2，冷凍干燥備用。凝膠色譜根據(jù)分子量大小不同，將多肽分子分離開來，從而達(dá)到純化分離的目的；

6）高效液相色譜層析：將qff-3-1冷凍干燥得到的粉末溶于蒸餾水，過0.45μm針筒式濾膜。使用高效液相色譜儀（agilent1260）；色譜柱（thermo-c18（4.6×250，5μm）；進(jìn)樣量20μl，用乙腈和純水進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫，洗脫時間、洗脫液成份及其百分比和流速依次為：0~5min，乙腈5%，純水95%，流速0.6ml/min；5~10min，乙腈10%，純水90%，流速0.6ml/min；10~20min，乙腈60%，純水40%，流速0.8ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.8ml/min；30~40min，乙腈60%，純水40%，流速0.6ml/min；40~50min，乙腈20%，純水80%，流速0.8ml/min。收集洗脫液，旋蒸得到高純度帶魚抗氧化肽。上述方法制得的抗氧化肽純度很高，dpph自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原能力和超氧陰離子清除能力很強(qiáng)，與最初的酶解液相比，抗氧化能力提高了很多。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江海洋大學(xué)

<120>帶魚抗氧化肽分離純化方法

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<213>人工合成

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