本發(fā)明涉及活性肽制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種帶魚抗氧化活性肽酶解液的制備方法。

背景技術(shù)：

帶魚（largeheadhairtail），別稱刀魚、牙帶魚，屬于脊索動物門、鱸形目，體型呈帶狀。主要分布于西太平洋和印度洋，在中國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊并稱為中國的四大海產(chǎn)。

2014年度，舟山市帶魚捕獲量達到108104噸，占主要漁獲品種的比例達到11.52%。舟山帶魚多以新鮮或加工成各種魚制品出售，然而帶魚的開發(fā)利用依然處于粗加工階段，高附加值的利用程度較低。

帶魚的平均蛋白含量達到18.4%以上，這使得它成為豐富的蛋白質(zhì)原材料來源。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解等特殊處理，可以制備具備一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我國對帶魚蛋白的研究雖然取得了一些進展，但是還未能開發(fā)出高活性的蛋白，還未能更佳充分地開發(fā)利用帶魚資源。因此，對帶魚蛋白的深入研究，開發(fā)出具備高附加值的帶魚蛋白產(chǎn)品成為迫在眉睫的問題。

生物活性肽，是指蛋白質(zhì)中的20種左右天然氨基酸以不同的排列和組合的方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的各種肽類的總稱?；钚噪暮腿梭w代謝和生理調(diào)節(jié)等具有密切的關(guān)系，展現(xiàn)出提高免疫力、抑菌、抗病毒、清除自由基、降血壓以及血脂等功效，食用安全性極高。因此，活性肽成為目前食品、藥品等領(lǐng)域研究的熱點之一并取得了較好的發(fā)展態(tài)勢。

目前，制備抗氧化肽的主要方法有天然提取法、化學(xué)合成法、生物發(fā)酵法、酶解法等方法。提取法是指從微生物、動植物中用特殊方法提取的某些天然存在的抗氧化肽。但是天然存在的抗氧化肽含量極小，提取的成本高、難度大無法滿足大量生產(chǎn)的需要?；瘜W(xué)合成法要使用大量的溶劑、試劑，不僅增加了成本，而且有毒的試劑會污染樣品，帶來毒副作用，無法實現(xiàn)清潔環(huán)保的需求。發(fā)酵法具有自己獨特的優(yōu)勢，不僅能將微生物產(chǎn)酶和酶水解兩步合一，省去酶的分離和提純步驟，而且還能減少生產(chǎn)環(huán)節(jié)，降低成本，因此越來越獲得青睞。同其他制備方法比較，在酶解過程溫和，無需添加劇烈的化學(xué)試劑，沒有有毒有害物質(zhì)的生成，多肽回收率較高。這些優(yōu)點，使得他們在蛋白質(zhì)深加工和活性成分提取領(lǐng)域被深入研究和廣泛應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn102533913b的中國發(fā)明專利，公開了一種采用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白制備抗氧化活性肽的方法，包括以下步驟：1）交聯(lián)法共固定化雙酶；2）魚鱗預(yù)處理；3）共固定化酶定向水解魚鱗蛋白；4）脫色脫腥；5）魚鱗多肽超濾分離；6）真空濃縮；7）冷凍干燥。該方法所制備的抗氧化活性肽可作為天然抗氧化劑用于食品抗氧化保鮮中，且無毒副作用，安全性高；所用方法酶解效率高，酶可以多次利用，酶解產(chǎn)物易于純化；為淡水魚廢棄物的有效利用提供了一條新途徑；產(chǎn)品可用于藥品、食品和化妝品。共固定化酶制備繁瑣，且共固定化酶與底物的接觸面積變小，催化速率變慢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能得到對dpph自由基和羥自由基清除能力強，油脂率很低，無腥味的帶魚抗氧化活性肽酶解液，操作簡單、耗時短的制備方法。

本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：

帶魚抗氧化活性肽酶解液的制備方法，具體步驟：

預(yù)處理：將帶魚去頭、去皮、去內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，剪成小塊；

去腥：在步驟1處理好的帶魚中按料液比1:4~8加入去腥液，浸泡，浸泡時間為4~8h。去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素e。帶魚身上的腥味物質(zhì)特征成分是三甲胺，上述去腥液既能與三甲胺反應(yīng)形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；

脫脂：將去腥后的帶魚搗碎，過30~60目篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，過濾，42~48℃環(huán)境下烘干，得到去脂帶魚粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導(dǎo)致酶解液的色澤、氣味的變化；其次，脂肪與蛋白乳化造成水解后的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利制備的重要條件。采用上述方法脫脂，脫脂率高達92%以上；

酶解：在帶魚粉末中加入蒸餾水，調(diào)節(jié)ph為6.8~7.5，加入1.2~1.6%木瓜蛋白酶，加熱，酶解溫度為46~53℃，酶解時間為4.6~5.3h。調(diào)節(jié)ph為8.2~8.9，加入2.8~3.3%堿性蛋白酶，加熱，酶解溫度為42~46℃，酶解時間為4.0~4.6h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，得到帶魚抗氧化活性肽酶解液。帶魚抗氧化活性肽序列為scasrcksrcrarrckgycskfcgtasctcickcfrc。多肽的抗氧化能力和肽的氨基酸序列和長度有關(guān)，這意味著不同蛋白酶水解得到的肽抗氧化性能不同。單一的蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶切位點少，得到的多肽量少，多種蛋白酶同時酶解蛋白質(zhì)得到的多肽量大，但容易破壞多肽活性，使之失去抗氧化性能。采用雙酶酶解帶魚蛋白得到的多肽，對dpph自由基和羥自由基清除能力強，抗氧化能力強；得到的多肽的分子量小，易被人體吸收，適合應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：帶魚身上的腥味物質(zhì)特征成分是三甲胺，本發(fā)明的去腥液既能與三甲胺反應(yīng)形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；采用乙酸乙酯脫脂，脫脂率高；采用雙酶酶解帶魚蛋白得到的多肽，對dpph自由基和羥自由基清除能力強，抗氧化能力強；得到的多肽的分子量小，易被人體吸收，適合應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域；本發(fā)明方法操作簡單，成本低廉，增加了帶魚的附加值，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實施例

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：

實施例1：

帶魚抗氧化活性肽酶解液的制備方法，具體步驟：

1）預(yù)處理：將帶魚去頭、去皮、去內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，剪成小塊；

2）去腥：在步驟1處理好的帶魚中按料液比1:4~8加入去腥液，浸泡，浸泡時間為4~8h。去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素e。帶魚身上的腥味物質(zhì)特征成分是三甲胺，上述去腥液既能與三甲胺反應(yīng)形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；

3）脫脂：將去腥后的帶魚搗碎，過30~60目篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，過濾，42~48℃環(huán)境下烘干，得到去脂帶魚粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導(dǎo)致酶解液的色澤、氣味的變化；其次，脂肪與蛋白乳化造成水解后的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利制備的重要條件。采用上述方法脫脂，脫脂率高達92%以上；

4）酶解：在帶魚粉末中加入蒸餾水，調(diào)節(jié)ph為6.8~7.5，加入1.2~1.6%木瓜蛋白酶，加熱，酶解溫度為46~53℃，酶解時間為4.6~5.3h。調(diào)節(jié)ph為8.2~8.9，加入2.8~3.3%堿性蛋白酶，加熱，酶解溫度為42~46℃，酶解時間為4.0~4.6h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，得到帶魚抗氧化活性肽酶解液。多肽的抗氧化能力和肽的氨基酸序列和長度有關(guān)，這意味著不同蛋白酶水解得到的肽抗氧化性能不同。單一的蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶切位點少，得到的多肽量少，多種蛋白酶同時酶解蛋白質(zhì)得到的多肽量大，但容易破壞多肽活性，使之失去抗氧化性能。采用雙酶酶解帶魚蛋白得到的多肽，對dpph自由基和羥自由基清除能力強，抗氧化能力強；得到的多肽的分子量小，易被人體吸收，適合應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域。

實施例2：

帶魚抗氧化活性肽酶解液的制備方法，最優(yōu)選步驟：

1）預(yù)處理：將帶魚去頭、去皮、去內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，剪成4cm長小塊；

2）去腥：在步驟1處理好的帶魚中按料液比1:6加入去腥液，浸泡，浸泡時間為7h。去腥液成份及其最優(yōu)選重量份為：8份檸檬酸、17份紫蘇提取物、0.1份氯化鈉、0.5份碳酸氫鈉、0.001份烏索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份維生素e。帶魚身上的腥味物質(zhì)特征成分是三甲胺，上述去腥液既能與三甲胺反應(yīng)形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；

3）脫脂：將去腥后的帶魚搗碎，過40目篩，按體積比1:5加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為22h。過濾，濾渣中按體積比1:3加入去離子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，過濾，將濾渣放入電熱鼓風(fēng)干燥箱45℃烘干，得到去脂帶魚粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導(dǎo)致酶解液的色澤、氣味的變化；其次，脂肪與蛋白乳化造成水解后的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利制備的重要條件。采用上述方法脫脂，脫脂率高達92%以上；

4）酶解：在帶魚粉末中加入蒸餾水，調(diào)節(jié)ph為7.0，加入1.5%木瓜蛋白酶，加熱，酶解溫度為50℃，酶解時間為5.0h。調(diào)節(jié)ph為8.5，加入3%堿性蛋白酶，加熱，酶解溫度為45℃，酶解時間為4.5h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，得到帶魚抗氧化活性肽酶解液。多肽的抗氧化能力和肽的氨基酸序列和長度有關(guān)，這意味著不同蛋白酶水解得到的肽抗氧化性能不同。單一的蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶切位點少，得到的多肽量少，多種蛋白酶同時酶解蛋白質(zhì)得到的多肽量大，但容易破壞多肽活性，使之失去抗氧化性能。采用雙酶酶解帶魚蛋白得到的多肽，對dpph自由基和羥自由基清除能力強，抗氧化能力強；得到的多肽的分子量小，易被人體吸收，適合應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了詳細說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江海洋大學(xué)

<120>帶魚抗氧化活性肽酶解液的制備方法

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<213>人工合成

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