本發(fā)明屬于腦血管病的藥物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種具有抗腦缺血作用的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦缺血是一種死亡率高、致殘率高的常見(jiàn)病、多發(fā)病。迄今為止，唯一有效的治療方法就是溶栓療法，但此療法不僅有效率低，而且必須得在腦缺血發(fā)生后的短時(shí)間內(nèi)給藥才有效。因此，進(jìn)一步研究腦缺血損傷的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)，研制抗腦缺血新藥意義重大。

n-甲基-d-天門冬氨酸(nmda)受體是一個(gè)重要的抗腦缺血靶點(diǎn)，研究人員已開(kāi)發(fā)了多種nmda受體拮抗劑，但由于療效不確切或不良反應(yīng)嚴(yán)重而被停用。近年來(lái)，研究人員將重點(diǎn)聚焦于nmda受體亞型的研究。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血時(shí)，含glun2a的nmda受體主要介導(dǎo)促存活作用，而含glun2b的nmda受體則主要介導(dǎo)促死亡作用。因此，選擇性地阻斷glun2b或激活glun2a都可對(duì)抗腦缺血損傷。目前，主要基于glun2b設(shè)計(jì)治療策略，共有3條途徑：選擇性glun2b拮抗劑、glun2b/psd-95解偶聯(lián)劑和glun2b/dapk1解偶聯(lián)劑。

雖然通過(guò)上述三種方法選擇性阻斷glun2b介導(dǎo)的促死亡信號(hào)都可對(duì)抗腦缺血損傷，但把著眼點(diǎn)放在比nmda受體更下游的促死亡信號(hào)分子上，可能會(huì)進(jìn)一步提高選擇性，減小由藥物引起的精神異常、運(yùn)動(dòng)功能惡化、幻覺(jué)等副作用。神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nnos）是nmda受體下游的促死亡信號(hào)分子，腦缺血后，由nmda受體所介導(dǎo)的nnos過(guò)度激活是神經(jīng)元損傷的重要原因，但通過(guò)直接抑制nnos活性來(lái)治療腦缺血會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能。2010年，《naturemedicine》上刊登了zhoul等的研究論文，他們根據(jù)psd-95與nnos結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系，設(shè)計(jì)合成了小分子化合物zl006，該化合物可通過(guò)抑制nnos與psd-95的結(jié)合來(lái)有效對(duì)抗腦缺血損傷。神經(jīng)元型一氧化氮合酶羧基末端pdz配體（capon）是體內(nèi)nnos的特異性配體，腦缺血時(shí)可通過(guò)特異性介導(dǎo)nnos-capon-p38mapk信號(hào)，引起神經(jīng)元興奮性毒性損傷，通過(guò)干擾capon的功能可有效治療缺血損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腦缺血作用的多肽及其應(yīng)用，其特征在于所述多肽具有的肽鏈片段序列為：ygrkkrrqrrrgdpv。

本發(fā)明提供的多肽可以高速高效地進(jìn)入細(xì)胞，可顯著抑制谷氨酸誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元興奮性毒性損傷，也可明顯降低mcao模型大鼠的神經(jīng)行為評(píng)分和相對(duì)腦梗死面積。由上述結(jié)果可知，無(wú)論是對(duì)體外神經(jīng)元，還是對(duì)腦缺血模型大鼠，該多肽均表現(xiàn)出良好的治療作用，可以用于治療缺血性腦血管病或腦梗塞。該多肽的作用機(jī)制可能為干擾capon的功能，拮抗nnos下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本發(fā)明提供的多肽具有較好的穿越血腦屏障作用，可以按常規(guī)藥劑學(xué)制備成粉針劑注射給藥。

本發(fā)明提供的多肽具有在制備治療缺血性腦血管疾病藥物中良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：yv-15對(duì)glu興奮性毒性損傷的影響（n=6）

注：*p＜0.05與glu組相比；yv-15為tat-gdpv；ya1-15為tat-gdpv?aa。

結(jié)論：0.5和2μmol/l的多肽產(chǎn)生顯著的抑制谷氨酸興奮性毒性損傷作用。

圖2：各組動(dòng)物的神經(jīng)評(píng)分情況（n=6）

注：*p＜0.05與溶劑組相比。

結(jié)論：多肽給藥組的神經(jīng)評(píng)分明顯比溶劑組低，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，該多肽可抑制腦缺血損傷造成的神經(jīng)行為障礙。

圖3：各組動(dòng)物的死亡情況（n=12）

結(jié)論：假手術(shù)組沒(méi)有死亡，溶劑組和給藥組的死亡數(shù)分別為5和4（每組共12只動(dòng)物），給藥組動(dòng)物死亡數(shù)低于溶劑組。

圖4：各組動(dòng)物的相對(duì)梗死面積（n=6）

注：*p＜0.05與溶劑組相比。

結(jié)論：給藥組的相對(duì)梗死面積明顯小于溶劑組，并具有顯著差異。這表明，該多肽可有效對(duì)抗腦缺血導(dǎo)致的腦組織梗死。

圖5：融合多肽的作用機(jī)制圖

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1.多肽（ygrkkrrqrrrgdpv）的制備

1、多肽合成過(guò)程：多肽合成過(guò)程：首先用dcm浸泡樹(shù)脂(fmoc-val-wangresin)5-10分鐘，用dmf清洗5次，用20%的六氫吡啶脫保護(hù)10-20分鐘，用dmf清洗5次，然后加保護(hù)氨基酸原料、縮合劑等縮合30分鐘，用dmf清洗5次，再脫保護(hù)—清洗—縮合——清洗，最后脫保護(hù)，清洗，抽干，用tfa切割，切割液用乙醚沉淀，用乙醚清洗2-3次，抽干，這是整個(gè)多肽合成一個(gè)大概過(guò)程。

2、多肽合成是從c端開(kāi)始，也就是從右到左的合成，先是用常規(guī)的氨基酸原料合成這段序列ygrkkrrqrrrgdpv，所用的氨基酸原料分別為fmoc-pro-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh?？s合完這條序列，通過(guò)ms判斷是否正確。最后將我們粗品多肽通過(guò)hplc按照客戶要求進(jìn)行純化，凍干后就得到我們的精品多肽。最后將粗品多肽通過(guò)hplc進(jìn)行純化，凍干后就得到精品多肽（＞98%）。

實(shí)施例2.多肽對(duì)谷氨酸興奮性毒性作用的影響

體外培養(yǎng)至11天的胎鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞，用hbss洗板3次，給予50μm谷氨酸孵育20min，谷氨酸孵育的同時(shí)分別給予蒸餾水、yv-15或ya-15，多肽使用濃度為0.05、0.5和2μmol/l，孵育結(jié)束后，撤掉所有藥物，用hbss洗板3次，加入維持培養(yǎng)基，放入37℃、含5%co2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用mtt法檢測(cè)細(xì)胞的損傷情況。

實(shí)施例3.多肽對(duì)腦缺血后動(dòng)物神經(jīng)行為評(píng)分和死亡率的影響

1、大鼠mcao模型的建立及給藥：spraguedawley(sd)大鼠,雄性,體重(300±20)g。采用頸內(nèi)動(dòng)脈栓線法制備大腦中動(dòng)脈阻塞(mcao)腦缺血模型。大鼠用10%水合三氯乙醛(300mg·kg-1,i.p.)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,輕輕剝離迷走神經(jīng)，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈上的所有分支。頸外動(dòng)脈切口,插入外徑為0.28mm的尼龍釣魚線(頭端用硅有機(jī)樹(shù)脂處理使光滑)，轉(zhuǎn)過(guò)頸總動(dòng)脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，然后徐徐插入，至有輕微阻力為止(自分叉處約20mm)，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供。缺血1.5h后，輕輕拔出尼龍線,恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持體溫(37±0.5)℃。從右側(cè)大腦缺血時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，缺血后1.5h，按照3nmol/g的濃度尾靜脈注射給予yv-15，溶劑組按照同體積給予生理鹽水，假手術(shù)組不做處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別測(cè)定各組的神經(jīng)評(píng)分、死亡率和相對(duì)腦梗死面積。

2、大鼠mcao模型的檢測(cè)指標(biāo)，主要通過(guò)以下三個(gè)方面對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)：

1）統(tǒng)計(jì)各組大鼠死亡率

2）神經(jīng)功能缺失評(píng)分

采用5分制法在動(dòng)物建模成功7天后進(jìn)行評(píng)分

0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；

1分：不能伸展對(duì)側(cè)前爪；

2分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢；

3分：懸尾時(shí)向同側(cè)抬頭；

4分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;

分值越高，說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

3）相對(duì)腦梗死面積測(cè)定

動(dòng)物斷頭取腦，去嗅球、小腦和腦干，用生理鹽水沖洗大腦表面血污，吸干后于-20℃冷凍5～10min使變硬，沿冠狀面切成約2mm厚的腦片，置2%ttc染液中37℃溫育15min。正常組織呈鮮紅色，梗死組織呈灰白色。將顯色后的腦片置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定24h，細(xì)心將梗死區(qū)挖下，烘干至恒重，稱重。以梗死組織的重量占缺血側(cè)腦組織重量的百分比作為相對(duì)梗死面積。

上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>河北科技大學(xué)

<120>一種具有抗腦缺血作用的融合多肽及其應(yīng)用

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>融合蛋白

<400>1

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151015