專利名稱：具有腦定位活性的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有腦定位活性(brain-localizing activity)的多肽，包含這些多肽的分子，以及賦予腦定位活性的藥劑。
背景技術(shù)：
由于血腦屏障的存在，通過口服施用或者注射在腦中獲得藥物等地有效濃度要比在其他器官中更加困難。雖然可以通過大劑量施用以確保得到有效的藥物濃度，但是這將意味著將過量的藥物灌注到外周血中，這將產(chǎn)生副作用例如腎臟或肝臟損傷。因此，變得有必要開發(fā)一種選擇性地將藥物轉(zhuǎn)運到腦中的系統(tǒng)。在這方面正在進行大量的研究。這些研究和開發(fā)中的大多數(shù)都致力于通過利用腦血管內(nèi)皮細胞的特性對藥物本身進行化學修飾以增強腦定位——物質(zhì)的脂溶性越高，其越容易穿過血腦屏障。這種方法最多將藥物在腦中的定位提高數(shù)倍，總的來說在誤差范圍內(nèi)。在外周器官中，物質(zhì)滲透穿過血管內(nèi)皮細胞的細胞間隙，與此相反，在腦中，腦血管內(nèi)皮細胞的細胞間隙形成稱為緊密連接的特殊結(jié)構(gòu)，幾乎不允許血液成分穿過。因此，將物質(zhì)轉(zhuǎn)運到腦必須在對該物質(zhì)進行化學修飾使之可溶于脂肪且可以直接整合到細胞膜中后，通過滲透進行。更特別地，不同于外周器官，由于沒有替代路徑用于將物質(zhì)轉(zhuǎn)運到腦中，這種方法使物質(zhì)可以直接滲透到細胞中。但是，由于這種機制異于慣常，其效率低數(shù)千至數(shù)萬倍。因此，這種方法不能被認為是腦特異性藥物轉(zhuǎn)運。
隨著近來的科技進步，已經(jīng)開發(fā)出靶向在腦血管內(nèi)皮細胞上表達的膜表面蛋白的技術(shù)。特別地，利用被稱為轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白質(zhì)的功能將藥物摻入到腦中是有效的。如上所述，由于幾乎沒有任何物質(zhì)通過細胞間隙滲透到腦中，血液中的氨基酸和糖通過與血腦屏障上表達的轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合而被特異性地轉(zhuǎn)運到腦中。運鐵蛋白受體是將稱為運鐵蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到腦中的轉(zhuǎn)運蛋白分子。運鐵蛋白給腦活動所必需的金屬酶供應金屬離子。據(jù)報導，使用特化抗體靶向運鐵蛋白受體，會使藥物在腦中的定位提高數(shù)十倍到約上百倍(參見非專利文獻1)。
但是，運鐵蛋白受體不僅在腦血管內(nèi)皮細胞中表達，也在肝臟和腎臟中以更大的量表達。因此，當使用這種系統(tǒng)時，隨著被轉(zhuǎn)運到腦中的藥物的量的增加，該藥物也被導入肝臟和腎臟中。因此，這種方法也不能被稱為腦特異性腦轉(zhuǎn)運。此外，雖然已經(jīng)有關(guān)于利用多種轉(zhuǎn)運蛋白分子和反轉(zhuǎn)運蛋白(antiporter)分子如P-糖蛋白的系統(tǒng)的報導，這些系統(tǒng)都未被證明是有效的。
此外，最近開發(fā)出利用特殊的功能肽的方法。這些肽被稱作為PTD序列，并被鑒定為HIV tat基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細胞核所必需的肽序列。這些肽不僅穿過核膜，而且穿過所有種類的細胞膜(參見非專利文獻2)，因此當該肽被注射到血液中時能夠被分布到遍及整個機體的器官中。PTD肽能夠?qū)⑽镔|(zhì)轉(zhuǎn)運到腦中，因為它們能夠穿過腦血管內(nèi)皮細胞的細胞膜。但是，盡管PTD序列介導的通過細胞膜的轉(zhuǎn)移和通過細胞間隙的滲透在外周器官中都是有效的，但是通過細胞間隙的滲透在腦中不存在，使得腦中的物質(zhì)滲透性比在其他器官中低得多。因此，這種技術(shù)也不是腦特異性的。
與此同時，最近已經(jīng)報導了調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的器官特異性的分子?；谄鞴俚墓δ芎吞禺愋?，機體中的各個器官具有不同的營養(yǎng)需求和對血液供應的各種因子的不同需求程度。逐漸變得清楚的是，分布在器官中的血管內(nèi)皮細胞根據(jù)其所存在的部位具有略微不同的特性。此外，血管內(nèi)皮細胞作為與血液中存在的炎癥細胞和免疫細胞的直接接觸點，控制這些細胞在炎癥和病理條件下的入侵。然后，通過識別炎癥過程中出現(xiàn)的炎癥歸巢受體(inflammatory homing receptors)以及組織特異性血管內(nèi)皮細胞標記分子(稱為細胞郵遞區(qū)號，cellularzip codes)，侵入細胞在病灶處積聚。雖然它們的作用還不清楚，但是這些細胞標記正在引起人們的注意，這是由于這些分子的靶向至少使得可以將感興趣的分子靶向器官的血管內(nèi)皮細胞(非專利文獻3)。但是，雖然這種方法能夠?qū)⒏信d趣的分子靶向各個器官的血管內(nèi)皮細胞，但還是必須設(shè)計出用于將該分子導入器官的實質(zhì)中的系統(tǒng)。
非專利文獻1Ningya Shi and William M.Pardridge，Noninvasivegene targeting to the brain.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，Issue 13，7567-7572，June 20，2000.
非專利文獻2Steven R.Schwarze，Alan Ho，AdaminaVocero-Akbani，and Steven E.Dowdy，In Vivo Protein TransductionDelivery of a Biologically Active Protein into the Mouse.Science 1999September 3；2851569-1572.
非專利文獻3Renata Pasqualini，Erkki Ruoslahti，Organ targetingin vivo using phage display peptide libraries.Nature Vol.380，28，March1996.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在上述情形下完成的。本發(fā)明的一個目的是發(fā)現(xiàn)與腦定位活性相關(guān)的因子(基序序列)。本發(fā)明的另一個目的是提供具有腦定位活性的多肽，包含這些多肽的分子，以及賦予腦定位活性的藥劑。
本申請發(fā)明人進行了專門研究來解決上述的問題。細胞滲透到組織中的機制包括細胞通過細胞間隙的路徑(細胞旁路徑，paracellularpathways)和細胞穿過細胞的路徑(跨細胞路徑，transcellularpathways)。后一種路徑被認為在特定條件下出現(xiàn)。當研究進入腦而不破壞血腦屏障的特定類型的細胞(小膠質(zhì)細胞)的現(xiàn)象時，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這種細胞具有誘導跨細胞路徑的分子(Sawada，M.，Imai，F(xiàn).，Suzuki，H.，Hayakawa，M.，Kanno，T.，Nagatsu，T.FEBS Lett，43337-40，1998.Brain-specific gene expression by immortalizedmicroglial cell-mediated gene transfer in the mammalian brain)。
本申請發(fā)明人想到這種分子的活性位點的肽片段可以被用以確保腦特異性靶向和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，這到目前為止是不可能的。
誘導上述機制的配體分子被認為存在于小膠質(zhì)細胞中。因此，本申請發(fā)明人通過從小膠質(zhì)細胞分離mRNA，制備cDNA文庫，將該文庫插入到T7噬菌體中，并篩選表達腦定位活性的噬菌體，從而成功地分離并鑒定到了感興趣的分子。
此外，本申請發(fā)明人合成了編碼包含隨機氨基酸序列的多肽的DNA，將它們插入到噬菌體文庫中，并篩選具有腦定位活性的多肽。
結(jié)果，本申請發(fā)明人獲得了多種具有腦定位活性的多肽，并且成功地發(fā)現(xiàn)了被認為與腦定位活性相關(guān)的氨基酸基序序列及其序列特征。
此外，本申請發(fā)明人將包含上述基序序列的合成多肽施用給試驗動物，證實了這些多肽確實具有轉(zhuǎn)運到腦中的活性。本申請發(fā)明人還進行了專門研究來闡明本發(fā)明的多肽轉(zhuǎn)運到腦中的機制，并說明了這些多肽通過移行機制(transmigration mechanism)(跨細胞路徑)轉(zhuǎn)運到腦組織中。更特別地，本發(fā)明的多肽作為賦予移行誘導活性的分子也是非常有用的。
包含本發(fā)明的氨基酸基序序列的多肽或其特征性氨基酸可能具有腦定位活性。此外，本申請發(fā)明人證明已經(jīng)連接了這些多肽的分子具有腦定位活性，即使這些分子是大分子例如噬菌體顆粒。將包含本申請發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的基序序列的多肽連接到任意分子上以賦予這些分子腦定位活性。因此，包含所述基序序列的多肽可以成為賦予腦定位活性的藥劑。
如上所述，本申請發(fā)明人成功地解決了上述的問題，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明涉及具有腦定位活性的多肽，包含這些多肽的分子，以及賦予腦定位活性的藥劑。更特別地，本發(fā)明提供了一種具有腦定位活性的多肽(腦定位多肽)，其中該多肽的10％或更多是由堿性氨基酸殘基(K或R)組成；一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含一環(huán)狀肽區(qū)域，并且其中該環(huán)狀肽區(qū)域的10％或更多是由堿性氨基酸殘基(K或R)組成；一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含一環(huán)狀肽區(qū)域，并且在該環(huán)狀肽區(qū)域中有至少一個或多個堿性氨基酸殘基(K或R)；一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含一環(huán)狀肽區(qū)域，并且在該環(huán)狀肽區(qū)域中有至少一個或多個堿性氨基酸殘基(K或R)，而且該環(huán)狀肽區(qū)域中其余的氨基酸殘基的80％或更多選自如下組的氨基酸殘基
G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N；一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含氨基酸基序序列
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、N、P、V或L；X3表示任意氨基酸；X4表示G、S、T、C、N、L、Q或Y；[2]-[4]中任何一項的多肽，其中所述環(huán)狀肽區(qū)域包含[5]的氨基酸基序序列；[5]或[6]的多肽，其中所述氨基酸基序序列為
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、N、P或V；X3表示任意氨基酸；X4表示不帶電的極性氨基酸(G、S、T、C、N、Q或Y)；[5]或[6]的多肽，其中所述氨基酸基序序列為
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、P或L；X3表示任意氨基酸；X4表示S、T、C、L或Q；[1]-[8]中任何一項的多肽，其中所述多肽具有誘導移行的活性；[1]-[8]中任何一項的多肽，其中所述多肽具有與腦血管內(nèi)皮細胞結(jié)合的活性；下述(a)-(c)中任何一項的多肽
(a)包含SEQ ID NO1-12中的任何一種氨基酸序列的多肽，
(b)包含一個肽區(qū)域的多肽，該肽區(qū)域通過由(a)的多肽的兩末端上的半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵而被環(huán)化，和
(c)一種具有腦定位活性并包含一種在SEQ ID NO1-12中的任何一種氨基酸序列上具有一個或多個氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列的多肽；[1]-[11]中任何一項的多肽，其中所述多肽的長度為9個氨基酸或更少；編碼[1]-[12]中任何一項的多肽的多核苷酸；與[1]-[12]中任何一項的多肽相結(jié)合的抗體；賦予任意分子腦定位活性的藥劑，其中該藥劑包含[1]-[12]中任何一項的多肽；[15]的藥劑，其中所述任意分子是一種任意多肽；一種具有腦定位活性的分子，其中該分子包含[1]-[12]中任何一項的多肽；[17]的分子，其中所述分子為噬菌體顆粒或者噬菌體顆粒的外殼蛋白；[17]的分子，其中所述分子是與[1]-[12]中任何一項的多肽形成的融合蛋白；一種腦送達用載體，其中該載體包含[1]-[12]中任何一項的多肽；一種腦送達用載體，其中該載體包含一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中[1]-[12]中任何一項的多肽被結(jié)合到膠束、脂質(zhì)體或微囊上；一種用于腦疾病的治療劑，其中該治療劑包含一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中藥物附載在[20]或[21]的腦送達用載體上；一種用于制備具有腦定位活性的分子的方法，其中該方法包括將[1]-[12]中任何一項的多肽結(jié)合到任意分子上；一種用于制備具有腦定位活性的蛋白質(zhì)分子的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)制備包含一種可表達形式的DNA的表達載體，其中該DNA具有一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中編碼任意蛋白質(zhì)分子的DNA被連接到編碼[1]-[12]中任何一項的多肽的DNA上，
(b)將該表達載體導入細胞中，和
(c)收集該載體的表達產(chǎn)物；一種用于將任意分子轉(zhuǎn)運到非人動物的腦中的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)制備具有腦定位活性的分子，其中該分子包含一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中一種任意分子被結(jié)合到[1]-[12]中任何一項的多肽上，和
(b)將該分子施用到非人動物的機體中；一種篩選具有與[1]-[12]中任何一項的多肽結(jié)合的活性的分子的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)將[1]-[12]中任何一項的多肽與測試分子相接觸；
(b)檢測所述多肽與所述測試分子之間的結(jié)合活性，和
(c)選擇與所述多肽相結(jié)合的分子；一種篩選具有腦定位活性的多肽的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)制備在其噬菌體外殼蛋白上展示測試多肽的噬菌體顆粒，
(b)將所述噬菌體顆粒施用給非人動物，
(c)從所述非人動物的腦組織中收集噬菌體顆粒，和
(d)選擇在步驟(c)中收集的噬菌體顆粒上展示的測試多肽作為具有腦定位活性的多肽；[27]的方法，其中所述測試多肽包含[5]、[7]和[8]中任何一項的氨基酸基序序列；[27]的方法，其中所述噬菌體為M13噬菌體或T7噬菌體；和[27]的方法，其中所述方法還包括在步驟(a)后選擇與腦血管內(nèi)皮細胞相結(jié)合的噬菌體顆粒。
本發(fā)明提供了具有腦定位活性的多肽。一般地，將物質(zhì)從血液轉(zhuǎn)運到腦組織中受到一種稱為血腦屏障(BBB)的結(jié)構(gòu)的限制。這一結(jié)構(gòu)使得腦免遭有害物質(zhì)的損害。在本發(fā)明中，“腦定位活性”是指被施用給機體的分子如多肽(例如，通過靜脈內(nèi)施用)轉(zhuǎn)運到腦組織中的活性。本發(fā)明的多肽可以是具有腦定位活性的普通多肽(腦定位多肽)，但也可以是例如具有穿過血腦屏障或者能夠誘導移行(胞吞轉(zhuǎn)運作用)的多肽。本發(fā)明的多肽可以與其他物質(zhì)(分子)結(jié)合以將它們轉(zhuǎn)運到腦中。因此，本發(fā)明的多肽可以被稱作為“賦予腦定位活性的多肽”、“腦定位肽標記”或“腦定位活性賦予劑”。
此外，本申請發(fā)明人揭示了9個氨基酸的多肽能夠賦予其他物質(zhì)(分子)有效的腦定位活性。因此，至少可以說短至9個氨基酸的多肽能夠賦予其他分子有效的腦定位活性。對本發(fā)明的多肽的長度沒有特別限制，但例如為100個氨基酸或更少，優(yōu)選15個氨基酸或更少，更優(yōu)選為9個氨基酸或更少，最優(yōu)選4-9個氨基酸。
在下述實施例中通過試驗證明了包含如下序列之一的多肽具有腦定位活性。
表1
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽包含下述[序列1]的氨基酸基序序列，更優(yōu)選[序列2]的氨基酸基序序列或[序列3]的氨基酸基序序列。換句話說，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式提供了至少包含以下所示的[序列1]-[序列3]的氨基酸基序序列中的任何一種的多肽。
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中
X1表示S(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、N(天冬酰胺)、P(脯氨酸)、V(纈氨酸)或L(亮氨酸)；
X3表示任意的氨基酸；和
X4表示G(甘氨酸)、S(絲氨酸)、T(酪氨酸)、C(半胱氨酸)、N(天冬酰胺)、L(亮氨酸)、Q(谷氨酰胺)或Y(酪氨酸)。
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中
X1表示S(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、N(天冬酰胺)、P(脯氨酸)或V(纈氨酸)，且優(yōu)選為S或T；
X3表示任意的氨基酸；和
X4表示G(甘氨酸)、S(絲氨酸)、T(酪氨酸)、C(半胱氨酸)、N(天冬酰胺)、Q(谷氨酰胺)或Y(酪氨酸)，且更優(yōu)選為T、Q或C。在上述的(R或K)中，更優(yōu)選R。
這些氨基酸(G、S、T、C、N、Q和Y)通常被分類為不帶電的極性氨基酸。
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中
X1表示S(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、P(脯氨酸)或L(亮氨酸)；
X3表示任意的氨基酸；和
X4表示G(甘氨酸)、S(絲氨酸)、T(酪氨酸)、C(半胱氨酸)、L(亮氨酸)或Q(谷氨酰胺)。
在此，氨基酸用常規(guī)的單字母代碼描述(例如，R為精氨酸，K為賴氨酸)。此外，氨基酸序列按照傳統(tǒng)的描述方法以從N末端至C末端的順序書寫。
本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有一種結(jié)構(gòu)的多肽顯示出較高的腦定位活性，在該結(jié)構(gòu)中上述肽被環(huán)化(更特別地，通過肽末端的半胱氨酸之間形成的二硫鍵(S-S鍵)被環(huán)化)。
因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，上述基序序列可以在構(gòu)成這種環(huán)狀區(qū)域的多肽中被發(fā)現(xiàn)。構(gòu)成基序序列的氨基酸由四個鄰近的氨基酸殘基組成。這些鄰近的氨基酸通常相互形成肽鍵，當它們?yōu)榘腚装彼釙r可以形成二硫鍵。本發(fā)明的基序序列中的“四個鄰近的氨基酸殘基”不限于那些通過肽鍵相互結(jié)合的氨基酸，而且當這些鄰近的氨基酸為半胱氨酸時還可以形成二硫鍵。更特別地，上述[序列1]-[序列3]中的符號“-”通常是指肽鍵，當鄰近氨基酸為半胱氨酸時，“-”可以指二硫鍵(S-S鍵)。例如，即使沒有在直鏈多肽的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基序序列，本發(fā)明的基序可以通過由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成而變得相鄰的氨基酸形成。
此外，在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，只要一種多肽包含上述由4個氨基酸組成的基序序列，對該多肽的非基序氨基酸序列沒有特別的限制。
表1中所描述的具有腦定位活性的多肽具有如下特征。
在可能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多肽區(qū)域中(即除兩末端的半胱氨酸之外的氨基酸序列)，(1)所有多肽包含一個堿性氨基酸，K或R，和(2)其余的氨基酸殘基由10種氨基酸(G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N)中的任何一種組成。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式提供了具有腦定位活性的多肽；包含環(huán)狀區(qū)域的多肽，在該環(huán)狀區(qū)域中存在至少一個或多個堿性氨基酸殘基(K或R)，而其余的氨基酸殘基(通常為80％或更多，優(yōu)選85％或更多，更優(yōu)選90％或更多，還更優(yōu)選95％或更多，最優(yōu)選100％)選自氨基酸殘基組[G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N](這一特征在本說明書中可以被稱作為“特征1”)。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方式中，多肽具有上述述“特征1”，并且包含本發(fā)明的基序序列([序列1]-[序列3])。
此外，如上面“特征1”中所述，本發(fā)明的全部多肽被發(fā)現(xiàn)包含堿性氨基酸(K或R)。例如，在實施例中所使用的9個氨基酸的多肽中，發(fā)現(xiàn)了至少一個堿性氨基酸(在總氨基酸中的含量為1/9＝0.11(11％)或更高)。
因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了如下的肽
(a)一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含10％或更多的堿性氨基酸(K或R)；
(b)一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含環(huán)狀肽區(qū)域，并且在該環(huán)狀肽區(qū)域中具有10％或更多的堿性氨基酸殘基(K或R)；和
(c)一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含環(huán)狀肽區(qū)域，并且在該環(huán)狀肽區(qū)域中具有至少一個或多個堿性氨基酸(K或R)。
對本發(fā)明的多肽的長度的上限沒有特別的限制。通常，7個氨基酸或更長并包含4個氨基酸序列基序或者前述“特征1”的多肽被認為具有有效的腦定位活性。雖然對長度沒有上限，長度為50個氨基酸或以下，或優(yōu)選長度為35個氨基酸或以下的多肽通常被認為具有足夠的腦定位活性。此外，由于包含這些多肽的更長的多肽通常具有腦定位活性，本發(fā)明的多肽的長度不受限制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，對于待環(huán)化的多肽區(qū)域的長度沒有特別限制。在一個試驗中，本申請發(fā)明人使用了在其兩末端包含半胱氨酸殘基的9個氨基酸殘基的多肽作為待環(huán)化的肽的例子。更加特別地，例如，包含長度為10個氨基酸或以上的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多肽被認為具有腦定位活性，只要該多肽具有本發(fā)明的基序序列或“特征1”。因此，本發(fā)明的多肽中的環(huán)狀肽區(qū)域的長度不受限制，例如為100個氨基酸或更少，優(yōu)選50個氨基酸或更少，更優(yōu)選為4-30個氨基酸，再更優(yōu)選4-15個氨基酸，甚至更優(yōu)選4-9個氨基酸，最優(yōu)選4-7個氨基酸。
此外，在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽包含以下功能(活性)A和/或B
(A)移行(胞吞轉(zhuǎn)運作用)誘導活性
(B)腦血管內(nèi)皮細胞結(jié)合活性。
(A)中的術(shù)語“移行”是指一種現(xiàn)象，在該現(xiàn)象中某些分子通過穿過血管內(nèi)皮細胞而不是血管內(nèi)皮細胞的細胞間隙滲透入腦中。這被稱作為“跨內(nèi)皮細胞遷移”、“跨細胞路徑”或者“胞吞轉(zhuǎn)運作用”。通過這種機制穿過血管內(nèi)皮細胞的分子(細胞等)可能在其表面上具有信號分子，并通過這些細胞表面上的受體在血管內(nèi)皮細胞中誘導上述現(xiàn)象(圖1)。
可以認為本發(fā)明的多肽具有在血管內(nèi)皮細胞中誘導移行的活性。更特別地，本發(fā)明的多肽可以用作誘導移行的信號分子。
信號分子被認為在移行的早期結(jié)合到腦血管內(nèi)皮細胞上(例如細胞上的受體)。因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽的特征之一是具有與腦血管內(nèi)皮細胞結(jié)合的活性。
任意的測試分子是否具有(A)的移行誘導活性或其是否具有(B)的腦血管內(nèi)皮細胞結(jié)合活性，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行適當?shù)脑u估。舉例來說，可以通過將一種熒光標記的分子施用到血管中，然后在熒光顯微鏡下觀察腦血管內(nèi)皮細胞的冷凍橫截面進行評估。例如，如果觀察到附著了熒光標記的測試分子的血管內(nèi)皮細胞，則該測試分子被斷定為具有(B)的活性；如果在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)檢測到熒光標記的測試分子，則該測試分子被斷定為具有(A)的活性。
除了熒光標記方法外，還包括使用同位素標記或PET配體標記的方法，在用磁鐵礦或類似物質(zhì)結(jié)合后使用MRI的檢測方法，等等。除了上述體內(nèi)方法外，其他實施方式包括通過在血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物中誘導形成血腦屏障(BBB)，然后施用上述測試分子，來評估移行誘導活性的方法。如果所述分子被證實能夠滲透穿過BBB，則斷定其具有(A)活性；如果洗滌后，所述分子粘附在血管內(nèi)皮細胞上，則斷定其具有(B)活性。
此外，本發(fā)明中的短語“腦血管內(nèi)皮細胞”可以指細胞如小鼠MBEC4，市售的人腦血管內(nèi)皮細胞BBEC，短暫培養(yǎng)的牛腦血管內(nèi)皮細胞，或者制備來用于誘導BBB樣功能的來源于外周血管的血管內(nèi)皮細胞和星細胞的共培養(yǎng)物。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用這些細胞來評價任意多肽(合成肽)或者包含這些肽的分子中的(A)或(B)活性。特別地，該活性可以通過以下實施例中描述的方法進行適當?shù)脑u價。
更特別地，本發(fā)明的多肽可以包括包含表1中描述的氨基酸序列的多肽。但是，這僅僅是某些實施例，本發(fā)明的多肽不限于此。本申請發(fā)明人證明了包含表1中的氨基酸序列的多肽或在其外殼蛋白上表達這些多肽之一的噬菌體分子確實具有在隨后的實施例中所證明的腦定位活性。
因此，本發(fā)明提供了下述(a)到(c)中的任何一種多肽
(a)包含SEQ ID NO1-12中的任何一種的氨基酸序列的多肽；
(b)包含一個肽區(qū)域的多肽，該肽區(qū)域通過由(a)的多肽的兩末端上的半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵被環(huán)化；和
(c)一種具有腦定位活性并包含一種在SEQ ID NO1-12中的任何一種氨基酸序列上具有一個或多個氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列的多肽。
在(c)的多肽中，氨基酸添加、缺失或取代優(yōu)選發(fā)生在非本發(fā)明的基序氨基酸殘基([序列1]-[序列3])中，和/或優(yōu)選在使得所述多肽具有本發(fā)明的“特征1”的情況下發(fā)生。此外，“幾個”通常是指在2-9的范圍內(nèi)的數(shù)目。
對于本發(fā)明的多肽在其中顯示腦定位活性的生物體沒有特別的限制，只要該生物體是具有血腦屏障的動物，但是通常為哺乳動物，優(yōu)選小鼠、大鼠、沙鼠、貓、牛、猴或人。
本發(fā)明的多肽可以是來源于天然蛋白質(zhì)的多肽、來源于重組蛋白的多肽、化學合成的多肽，等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合成包含任何氨基酸序列的多肽。例如，多肽例如那些包含上述基序序列和/或“特征1”的多肽的合成可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如使用市售的多肽合成儀的方法適當?shù)剡M行。
此外，本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。多核苷酸通常包括DNA和RNA。更具體地，編碼本發(fā)明的多核苷酸的DNA，以及作為這些DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明提供了插入了本發(fā)明的多核苷酸的載體，攜帶本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細胞，以及使用所述宿主細胞制備本發(fā)明的多肽的方法。
對本發(fā)明的載體沒有特別的限制，只要所插入的DNA被穩(wěn)定地維持。例如，當采用大腸桿菌作為宿主時，克隆載體優(yōu)選為pBluescript載體(Stratagene)等。表達載體特別適用于作為制備本發(fā)明的多肽的載體。對表達載體沒有特別的限制，只要它們能夠在試管、大腸桿菌、培養(yǎng)細胞或生物個體內(nèi)表達多肽。例如，優(yōu)選的載體為用于在試管中表達的pBEST載體(Promega)，用于大腸桿菌的pET載體(Invitrogen.)，用于培養(yǎng)細胞的pME18S-FL3載體(GenBank登錄號AB009864)，用于生物個體的pME18S載體(Mol.Cell Biol.8466-472(1988))。通過標準方法，例如利用限制性酶切位點的連接酶反應可以將本發(fā)明的DNA插入到載體中(Current protocols in MolecularBiology edit.Ausubel et al.(1987)PubliSh.John Wiley & Sons.Section11.4-11.11)。
對插入本發(fā)明的載體的宿主細胞沒有特別的限制，根據(jù)要達到的目的可以使用不同的宿主細胞。用于表達多肽的細胞包括細菌細胞(例如，鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、真菌細胞(例如，酵母和曲霉菌(Aspergillus))、昆蟲細胞(例如，果蠅(Drosophila)S2和秋粘蟲(Spodoptera)SF9)、動物細胞(例如，CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤細胞)和植物細胞?？梢圆捎靡阎椒?，例如磷酸鈣沉淀方法、電穿孔方法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel dt al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺方法(GIBCO-BRL)以及微注射方法將載體導入宿主細胞中。
為了將宿主細胞表達的多肽分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì)間隙或細胞外環(huán)境中，可以將合適的分泌信號組合到感興趣的多肽中。這些信號對于感興趣的多肽而言可以是內(nèi)在的或外源的。
當本發(fā)明的多肽被分泌到培養(yǎng)基中時，通過收獲培養(yǎng)基來收集這些多肽。當本發(fā)明的多肽在細胞中生成，通過將溶解細胞來收集這些多肽。
可以通過已知方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸性提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親合層析、羥磷灰石層析和凝集素層析，從重組細胞培養(yǎng)物中收集和純化本發(fā)明的多肽。
由于本發(fā)明的多肽具有腦定位活性，這些多肽所結(jié)合的分子也被期待具有腦定位活性。本申請發(fā)明人證明了當本發(fā)明的多肽被結(jié)合到通常不具有腦定位活性的噬菌體顆粒的外殼蛋白中時，該噬菌體確實獲得了腦定位活性。因此，本發(fā)明的多肽被認為通過與任意分子相結(jié)合而賦予了這些分子腦定位活性。即本發(fā)明的多肽有用在它們能夠賦予其他分子腦定位活性。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的藥劑，用于將腦定位活性賦予給任意分子。在一個優(yōu)選的實施方式中，提供了用于將任意分子轉(zhuǎn)運到腦中的肽標記，其中該標記包含上述氨基酸基序序列和/或包含上述“特征1”的多肽。
本發(fā)明的肽標記的例子包括由本發(fā)明的多肽和生物素之間形成的偶聯(lián)分子，這將在后面的實施例中進行描述。這種偶聯(lián)分子可以與任何抗生物素偶聯(lián)分子適當?shù)剡B接。更特別地，具有如圖8中所示結(jié)構(gòu)的腦定位肽偶聯(lián)分子，或者特別用于以下實施例中的偶聯(lián)分子被作為優(yōu)選的實施方式包含在本發(fā)明中。通過使用這些偶聯(lián)分子，可以將所需的偶聯(lián)了抗生物素的分子轉(zhuǎn)運到腦中。通過使用這些偶聯(lián)分子將任何分子轉(zhuǎn)運到腦中的方法也包含在本發(fā)明中。此外，本發(fā)明包括已經(jīng)被上述的本發(fā)明的藥劑賦予腦定位活性的分子。
對于被本發(fā)明的多肽(藥劑)賦予腦定位活性的分子沒有特別的限制，包括單一化合物，例如天然化合物、有機化合物、無機化合物、糖鏈、蛋白質(zhì)和肽；以及化合物文庫，基因文庫的表達產(chǎn)物、細胞、細胞提取物、細胞培養(yǎng)物上清液、微生物、微生物的產(chǎn)物、噬菌體、抗原、抗體、膠束(聚合體膠束等)、脂質(zhì)體、微囊、肽核酸(PNA)和藥物化合物。如果必要，本發(fā)明的多肽或者前述的分子可以被適當?shù)貥擞?。所述標記包括放射性標記、熒光標記和酶標記?br> 對于通過本發(fā)明的多肽而被賦予腦定位活性的分子的大小沒有特別的限制，但最大一般是使該分子從能夠物理穿過血腦屏障的大小。如實施例所證明的那樣，具有標準噬菌體大小的分子能夠憑借本發(fā)明的多肽的作用穿過血腦屏障。因此，這些分子(物質(zhì))的大小可能與噬菌體的大小相似。例如，如果將被賦予腦定位活性的分子由氨基酸構(gòu)成，它們可以包含約100,000個氨基酸。
根據(jù)分子的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用已知方法將上述分子與本發(fā)明的多肽適當?shù)亟Y(jié)合起來。
例如，可以通過使用市售的偶聯(lián)劑(N結(jié)合型、COOH結(jié)合型、氨基酸殘基修飾型、S-S聯(lián)接型，等)的方法、使用氯胺T的方法、導入異硫氰酸根基團的方法等，將所述分子和本發(fā)明的多肽連接起來。
此外，當所述分子是一種蛋白質(zhì)時，可以使用編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽的融合蛋白的DNA來制備連接了本發(fā)明的多肽的分子。
更特別地，可以通過包含如下步驟的方法來制備這種分子
(a)制備一種包含可表達形式的DNA的表達載體，其中該DNA具有一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中編碼任意蛋白質(zhì)分子的DNA被連接到編碼本發(fā)明的多肽的DNA上；
(b)將所述表達載體導入細胞中；和
(c)收集所述載體的表達產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了腦送達用載體，其中該載體包含具有腦定位活性的本發(fā)明的多肽。這些載體也可以被稱作為“附載物”或“轉(zhuǎn)運蛋白”。在本發(fā)明中，具有腦定位活性的多肽本身就是這種載體的例子。即，通過將本發(fā)明的多肽直接連接到待轉(zhuǎn)運到腦中的分子上，可以將該分子運送給腦。此外，本發(fā)明的載體的優(yōu)選的實施方式包括包含一種其中本發(fā)明的多肽被連接到膠束(聚合體膠束)、脂質(zhì)體或者微囊上的結(jié)構(gòu)的載體。
此外，通過使用本發(fā)明的載體，可以將所需的藥劑轉(zhuǎn)運到腦中。例如，通過使用載體來附載一種對腦疾病具有治療作用的化合物(藥物組合物)，該化合物可以被有效地運送給腦，并產(chǎn)生有效的治療作用。用于附載化合物(藥物組合物)的載體本身被期望是腦疾病的治療劑。因此，本發(fā)明提供了用于腦疾病的治療劑，其包含一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中一種藥物被附載在本發(fā)明的載體上用于運送給腦?！氨桓捷d”可以指藥物被直接結(jié)合到載體上的情形或藥物(藥物組合物)被包含在載體中的情形。
此外，本發(fā)明提供了用于制備本發(fā)明的具有腦定位活性的分子的方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，用于制備具有腦定位活性的分子的方法包括將本發(fā)明的多肽結(jié)合到任意分子上。當該分子為蛋白質(zhì)時，本發(fā)明提供包含上述步驟(a)到(c)的制備方法作為優(yōu)選的實施方式。
此外，優(yōu)選用于結(jié)合到待賦予腦定位活性的分子上的本發(fā)明的多肽位于這些分子的外表面。更具體地，本發(fā)明的多肽被期望能以使得所述多肽位于分子表面上的方式結(jié)合到該分子上。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽包括包含一種序列的多肽，在該序列中半胱氨酸殘基(C)位于上述基序的兩端。該多肽中的兩個半胱氨酸殘基的SH基團通常通過自身氧化作用而交聯(lián)(二硫鍵結(jié)合)。一旦這兩個半胱氨酸之間形成交聯(lián)，如上述的位于兩個半胱氨酸殘基之間的包含所述基序序列的多肽鏈將形成環(huán)狀的突出。也就是說，通過將上述半胱氨酸殘基導入本發(fā)明的多肽，所述多肽可以被有效地置于該分子的表面(外表面)。用于將本發(fā)明的多肽置于外表面的其他方法包括重組生產(chǎn)方法，該方法將本發(fā)明的多肽置于待導入所述多肽鏈的蛋白質(zhì)分子的外露的結(jié)構(gòu)域上；將交聯(lián)劑例如PEG與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、合成載體等結(jié)合，和將多肽鏈連接到PEG鏈的末端上的方法；以及將多肽鏈化學結(jié)合到載體表面上的方法。
待結(jié)合到本發(fā)明的多肽上的分子的例子包括所需的直接轉(zhuǎn)運到腦組織中用于腦疾病治療的化合物。本發(fā)明的多肽賦予了這些化合物腦定位活性。結(jié)果，當這些化合物被施用到體內(nèi)時，它們將被有效地轉(zhuǎn)運到腦組織中并發(fā)揮治療效果。
本發(fā)明包括上述具有腦定位活性以及對腦疾病具有潛在的治療作用的分子，以及包含這些分子的藥劑。
本發(fā)明的具有腦定位活性的多肽可作為治療腦神經(jīng)疾病的治療策略被應用于如下情形。
1)補充其量和活性已經(jīng)由于缺失或突變而下降的酶和生物活性蛋白質(zhì)的補充治療
通過注射攜帶缺乏的蛋白質(zhì)和酶的基因的細胞對各種由于遺傳缺失或突變導致腦中缺乏特定的酶或蛋白質(zhì)而引起的腦疾病實施這些治療。對于在帕金森病和阿爾茨海默氏病中特定神經(jīng)細胞的退行性丟失，可以使用促進神經(jīng)傳遞素合成的基因，神經(jīng)傳遞素會由于的的退行性丟失而變得缺乏；例如，與多巴胺生物合成有關(guān)的酶包括酪氨酸羥化酶和生物蝶呤合酶的基因可以被用于治療帕金森病。
2)用于保護將會由于變性等而丟失的神經(jīng)細胞并用于增強其功能的保護治療
通過注射表達神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF、BDNF、GDNF和NT3(進來的發(fā)現(xiàn)表明BDNF和GNNF對于帕金森病尤其有效)的基因的細胞來實施這些治療，這些因子抑制了由各種原因包括變性疾病和腦缺血所引起的神經(jīng)細胞死亡，并促進神經(jīng)突的再生。此外，通過導入表達具有免疫抑制作用的TGF-β或IL-10的基因的細胞進行與免疫細胞有關(guān)的疾病如多發(fā)性硬化的治療。
3)用于消除腫瘤、血凝塊等的方法
通過表達具有抗腫瘤作用的因子或通過將攜帶抗腫瘤劑的細胞轉(zhuǎn)移到腦中來實施這些方法。為了消除血凝塊，可以表達纖維蛋白溶酶。
4)將有效藥物單獨導入腦中的方法
在作用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物中，一些具有高度的外周毒性，一些作用于外周神經(jīng)系統(tǒng)，而其他的不能容易地穿過血腦屏障；因此，需要特異于腦的藥物輸送系統(tǒng)。使用本發(fā)明的多肽可以將藥物特異地施用到腦中，而對外周器官的影響很少。
5)作為腦疾病預防系統(tǒng)的應用
小膠質(zhì)細胞是最早聚集在變性或炎癥部位以除去死亡細胞的細胞，并參與損傷修復。它們還具有抗腫瘤作用以及抗病毒作用，因而可被稱作為腦內(nèi)防御系統(tǒng)。因此，通過遺傳工程等增強這些特性，小膠質(zhì)細胞不僅可用于單一疾病的治療，而且還可用于通過增強腦內(nèi)防御系統(tǒng)自身以預防各種疾病。
本發(fā)明的藥劑可以只包含本發(fā)明的多肽，或者一種包含所述多肽并且具有腦定位活性的分子；或者可以用已知的藥物制備方法來配制。例如，通過與合適的常規(guī)使用的載體或媒介物例如滅菌水、生理鹽水、植物油(例如芝麻油和橄欖油)、著色劑、乳化劑(例如膽固醇)、懸浮劑(例如阿拉伯樹膠)、表面活性劑(例如聚氧乙烯硬化蓖麻油表面活性劑)、增解劑(例如磷酸鈉)、穩(wěn)定劑(例如糖、糖醇和白蛋白)或防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯)適當?shù)亟Y(jié)合，可以將所述藥劑配制到適于有效施用于體內(nèi)的藥用制劑中例如注射液(優(yōu)選)、經(jīng)鼻制劑、經(jīng)皮制劑或口服劑。例如，注射液制劑可以以凍干產(chǎn)品、用于注射的溶液等形式提供。
此外，可以通過例如動脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或皮下注射，以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行的鼻內(nèi)的、經(jīng)支氣管的、肌內(nèi)的或者口服的施用來進行體內(nèi)施用。在這些方法中，優(yōu)選動脈內(nèi)施用。
此外，本發(fā)明包含已經(jīng)被本發(fā)明的藥劑賦予腦定位活性的分子。例如，優(yōu)選在其外殼蛋白上表達本發(fā)明的多肽的噬菌體。
對噬菌體沒有特別的限制，但是優(yōu)選的例子包括T7噬菌體和M13噬菌體。當使用T7噬菌體時，本發(fā)明的多肽可以被展示在被稱為衣殼的外殼蛋白的外表面上。
本發(fā)明涉及與本發(fā)明的多肽結(jié)合(或優(yōu)選特異性地結(jié)合)的抗體。在本申請中，術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體以及包含其他免疫球蛋白表達文庫產(chǎn)物的Fab或Fab片段。
本發(fā)明的多肽或表達該多肽的細胞可以被用作用于制備與這一多肽結(jié)合的抗體的免疫原。所述抗體優(yōu)選對本發(fā)明的多肽具有特異免疫反應性。術(shù)語“特異免疫反應性”意指抗體對本發(fā)明的多肽的親合力實質(zhì)上高于對其他多肽的親和力。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體。例如，可以按照如下獲得多克隆抗體。本發(fā)明的多肽或其GST融合蛋白被用于免疫小動物例如兔，并收集其血清。通過使用硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱層析、DEAE離子交換層析、使用已經(jīng)偶聯(lián)了本發(fā)明的多肽的柱的親合層析等純化這些血清而制備抗體。對于單克隆抗體的制備，例如，本發(fā)明的多肽被用于免疫小動物例如小鼠，摘出它們的脾臟并進行勻漿以分離細胞，使用試劑例如聚乙二醇將這些細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合。從生成的融合細胞(雜交瘤)中選擇生產(chǎn)與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體的克隆。接著，將獲得的雜交瘤移植到小鼠的腹腔中，從這些小鼠收集腹水，使用硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱層析、DEAE離子交換層析、使用已經(jīng)偶聯(lián)了本發(fā)明的多肽的親和柱的親合層析等純化所獲得的腹水可以制備到單克隆抗體。
本發(fā)明的抗體可以被用于分離、鑒定和純化本發(fā)明的多肽或者表達這些多肽的細胞。如下所述，本發(fā)明的多肽可被適當?shù)赜糜诤Y選具有與本發(fā)明的多肽結(jié)合的活性的分子的方法中。
本發(fā)明提供了篩選具有與本發(fā)明的多肽結(jié)合的活性的分子的方法。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括如下步驟
(a)將本發(fā)明的多肽與測試分子接觸；
(b)檢測所述多肽與測試分子之間的結(jié)合活性；和
(c)選擇與所述多肽結(jié)合的分子。
例如，通過本發(fā)明的篩選方法可以獲得其配體為本發(fā)明的多肽的受體。這種受體有望參與腦血管內(nèi)皮細胞中的移行。對通過本發(fā)明的篩選方法所獲得的受體進行功能性分析將有助于移行機制的闡明。本發(fā)明的篩選方法在獲得與內(nèi)皮細胞附著相關(guān)的分子的方面是十分有用的。
通常，步驟(a)中提及的“接觸”是根據(jù)本發(fā)明的多肽的狀況適當?shù)剡M行。例如，如果本發(fā)明的多肽處于純化狀態(tài)，可以通過將測試分子(樣品)添加到純化制劑中進行接觸。如果本發(fā)明的多肽是在細胞或者細胞提取物中表達，可以通過將測試分子(樣品)分別添加到細胞培養(yǎng)物或者細胞提取物中進行接觸。如果所述測試分子是一種蛋白質(zhì)，可以通過例如將包含編碼所述蛋白質(zhì)的DNA的載體導入表達本發(fā)明的多肽的細胞中，或通過將所述載體添加到表達本發(fā)明的多肽的細胞提取物中進行接觸。
此外，用于該篩選方法的測試分子和本發(fā)明的多肽可以按照需要進行適當?shù)貥擞涍M行使用。標記的例子包括放射性標記、熒光標記和酶標記。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來測量結(jié)合活性，例如利用雙雜交系統(tǒng)的方法和利用免疫沉淀的方法。用于測量蛋白質(zhì)之間的相互作用(結(jié)合活性)的各種方法是已知的，對本發(fā)明的結(jié)合活性的測量不限于特定的方法。
例如，將本發(fā)明的多肽與含有其與本發(fā)明的多肽的結(jié)合活性待評價的測試分子的樣品例如細胞培養(yǎng)物懸浮液或細胞提取物相接觸，然后本發(fā)明的抗體可以被添加到所述分子與本發(fā)明的多肽的共免疫沉淀物中。測試分子與本發(fā)明的多肽之間的結(jié)合可以根據(jù)免疫沉淀產(chǎn)物的電泳遷移率是否與單獨使用本發(fā)明的多肽時獲得的電泳遷移率不同來測定。此外，通過利用本發(fā)明的多肽的結(jié)合的方法例如親合層析，可以收集在其中檢測結(jié)合的樣品中的測試分子。
此外，可以通過使用噬菌體載體從組織或細胞產(chǎn)生cDNA文庫，所述組織或細胞被預測為將表達可以與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的測試分子，例如蛋白質(zhì)；在瓊脂糖上表達該文庫；然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到濾膜上；將它們與經(jīng)標記的本發(fā)明的多肽反應并進行檢測表達與所述經(jīng)標記的多肽相結(jié)合的測試分子的空斑的“West蛋白質(zhì)印跡”來實施本發(fā)明的方法。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的技術(shù)包括將固定在固體等上面的本發(fā)明的多肽與合成化合物、天然產(chǎn)物庫、隨機噬菌體肽展示文庫等反應，然后篩選與這些多肽相結(jié)合的分子的方法；以及使用組合的化學技術(shù)，通過高通量篩選分離候選化合物的方法。
對所述的測試化合物沒有特別限制，例如，可以使用通過應用噬菌體展示方法生產(chǎn)的各種已知化合物和肽，或一組隨機肽。使用展示本發(fā)明的多肽的噬菌體和展示上述一組隨機肽的噬菌體的“雙噬菌體展示方法”(J.Castillo，B.Goodson and J.WinterT7 displayed peptidesas targets for selecting peptide specific scFvs from M13 scFv displaylibrariesJ.Immunol.Methods2571-2117-222001)也可適用于本發(fā)明的篩選方法中。
此外，微生物的培養(yǎng)上清、植物、來源于海洋生物的天然成分等可以作為篩選目標。其他例子包括活組織提取物、細胞提取液、基因文庫的表達產(chǎn)物，等等，但并不特別地限于此。
多肽通常是由雙鏈DNA的一條鏈所編碼的基因產(chǎn)物。被假定為具有由另一條鏈所編碼的氨基酸序列的肽被稱作為反義肽。1984年，Blalock等人提出反義肽與原始肽(有義肽)相互作用的假設(shè)，此后有過許多關(guān)于有義肽和反義肽之間相互作用的報道。因此，通過將來源于編碼本發(fā)明的多肽的DNA的互補鏈序列的反義肽作為測試分子用于本發(fā)明的篩選方法，可以有效地獲得與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的分子。
與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的分子作為腦定位活性的抑試劑、增強或修飾腦定位活性的誘導物、受體(誘導移行的分子)等是有用的。
本發(fā)明還涉及用于獲得具有腦定位活性的多肽的方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式提供了篩選具有腦定位活性的多肽的方法(用于獲得或分離的方法)，其中該方法包括如下步驟(a)到(d)
(a)制備在其噬菌體外殼蛋白上展示測試多肽的噬菌體顆粒；
(b)將所述噬菌體顆粒施用給非人動物；
(c)從所述非人動物的腦組織收集噬菌體顆粒；和
(d)選擇展示在步驟(c)中收集的噬菌體顆粒上的測試多肽作為具有腦定位活性的多肽。
對上述方法中的測試多肽的序列沒有特別的限制，可以使用包含任何氨基酸序列的多肽。通常，本發(fā)明的測試多肽是多種類型的多肽，包括隨機的氨基酸序列。此外，通過將包含上述氨基酸基序序列或所述基序序列的一部分的多肽或者具有上述的“特征1”的多肽作為測試多肽用于本發(fā)明的篩選方法，可以有效地實施本發(fā)明的方法。
對所述測試多肽的長度沒有特別的限制，只要是可展示在噬菌體外殼蛋白上的可接受長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)噬菌體的類型等來設(shè)定測試多肽的長度。
通過使用已知的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地制備包含任何氨基酸序列的多肽。例如，可以用市售的肽合成儀等來制備測試多肽。
在步驟(a)中用于在噬菌體外殼蛋白上展示任意多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知曉為“噬菌體展示方法”的技術(shù)。通常通過利用噬菌體的生活周期在噬菌體外殼蛋白上展示任意多肽來制備分子文庫。例如，化學合成隨機化的DNA，然后采用遺傳工程化技術(shù)將其插入噬菌體DNA中。通過將這些DNA插入宿主細胞例如大腸桿菌中，噬菌體分子被生物合成，由隨機化的DNA所編碼的多肽被展示在病毒外殼蛋白上。
更特別地，實施例中描述的方法(程序)是制備在其外殼蛋白上展示測試多肽的噬菌體顆粒的步驟的例子。
可以被用于本發(fā)明的篩選方法中的噬菌體是已知的噬菌體，例如M13、T7、f1和fd。噬菌體外殼蛋白的例子包括pIII、10A、10B和衣殼?？梢员徽故驹趐III蛋白質(zhì)上的文庫是市售的，且這些文庫可以被適當?shù)赜糜诒景l(fā)明的篩選方法中。
此外，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，通過在步驟(b)之前淘選在步驟(a)中制備的噬菌體顆粒可以選擇可與腦血管內(nèi)皮細胞相結(jié)合的噬菌體顆粒。這一程序使得可以有效地進行本發(fā)明的篩選。
淘選方法是一種利用蛋白質(zhì)相互作用的選擇方法，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)噬菌體等的類型適當?shù)剡M行。例如，淘選方法可按如下被用于本發(fā)明的篩選方法中。首先，為了通過培養(yǎng)可以容易地與腦血管內(nèi)皮細胞相結(jié)合的噬菌體進行濃縮，通過吸收除去與對照細胞(小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞)反應并且與它們非特異性結(jié)合的噬菌體，并濃縮特異性附著到來源小鼠的腦的血管內(nèi)皮細胞(例如MBEC4)的噬菌體。更特別地，可以利用實施例中描述的程序進行淘選。
在步驟(b)中，被施用所述噬菌體顆粒的非人動物包括小鼠、大鼠、沙鼠、貓、牛和猴子。其他例子包括家畜和寵物。
在步驟(b)中施用的噬菌體不必是整個噬菌體顆粒，可以通過例如僅給非人動物施用展示測試多肽的外殼蛋白實施本發(fā)明的篩選方法。
通常通過動脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)腦施用、口服施用等施行對非人動物體內(nèi)的施用，優(yōu)選通過動脈內(nèi)注射。
在步驟(c)中，通?？梢园凑杖缦聫哪X組織中收集噬菌體顆粒。從非人動物中摘除腦，制備腦勻漿的連續(xù)稀釋液。接著，將經(jīng)稀釋的溶液鋪在瓊脂介質(zhì)上，形成噬菌體空斑并進行挑選，然后收集噬菌體顆粒。但是，這種方法僅是一個例子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)噬菌體的類型等從腦組織中適當?shù)厥占删w顆粒。
此外，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法測定步驟(d)中選擇的多肽的氨基酸序列。
本說明書中所引用的全部現(xiàn)有技術(shù)參考文獻通過引用被合并到本發(fā)明中。


圖1是跨內(nèi)皮細胞移行(trans-endothelial cell migration)的機制的示意圖。
圖2是表示利用T7選擇系統(tǒng)的噬菌體文庫的結(jié)構(gòu)圖和照片。該照片顯示了在瓊脂糖凝膠上分離的cDNA片段。在不存在插入物時，約120bp的片段被擴增。在此，確認了200bp到近1kb的插入物，其對應于70-300個氨基酸。
圖3是利用T7選擇系統(tǒng)的噬菌體文庫(隨機肽)的結(jié)構(gòu)圖。
圖4描述了T7選擇系統(tǒng)。
圖5描述了淘選方法。
圖6一組顯示包含SEQ ID NO23或24的序列的噬菌體的腦定位活性的照片。
圖7是顯示腦中的噬菌體滴度以及腦/血漿比的圖表。
圖8是本發(fā)明的腦定位肽偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖9是一組表明在小鼠腦中存在本發(fā)明的肽與膠體金的偶聯(lián)物的電子顯微照片。
左(上和下)對照組(抗生物素蛋白-膠體金)在神經(jīng)細胞中未觀察到膠體金標記。(上)海馬錐體細胞(CA1到CA2區(qū))；(下)小腦浦肯野細胞區(qū)。中(上和下)施用生物素偶聯(lián)的T2J002+抗生物素蛋白(Av)-金顆粒。右(上和下)施用生物素偶聯(lián)的T2J004+抗生物素蛋白(Av)-金顆粒。肽偶聯(lián)物使得膠體金能夠被轉(zhuǎn)運到腦實質(zhì)(cerebral parenchyma)中。
圖10一組表明在錐體細胞層CA1-CA2中存在本發(fā)明的肽和膠體金的偶聯(lián)物的電子顯微照片。
左對照組(僅施用抗生物素蛋白-膠體金)；在血管內(nèi)皮中未觀察到反應。中生物素+肽組(1)；施用生物素偶聯(lián)的T2J002+Av-金。生物素+肽組(2)顯示通過預先埋植方法進行的免疫反應的電子顯微鏡(EM)圖像，其中通過施用生物素偶聯(lián)的T2J002、制備超薄切片然后用Av-金檢測進行觀察。在對照組(左)的血管內(nèi)皮中未觀察到反應。在試驗組中，DAB的沉積表明在內(nèi)皮細胞中觀察到了免疫反應(箭頭)。在內(nèi)皮細胞以及血管外(腦實質(zhì))中都觀察到這種反應。
圖11是使用本發(fā)明的肽偶聯(lián)物用于評價對MBEC4的滲透性的實驗的示意圖。
圖12顯示了本發(fā)明的肽偶聯(lián)物(T2J004)的MBEC4滲透性。將抗生物素蛋白-FITC 0.4nmol/插入物以1∶4的比例連接到肽上并檢查MBEC4滲透性的時間依賴性變化。
圖13表示在血腦屏障模型中肽偶聯(lián)物對滲透性的提高以及未標記的肽的抑制活性。
與添加Av-FITC相比，將生物素偶聯(lián)的T2J004Y+Av-FITC添加到用MBEC4制備的血腦屏障模型中顯示出當測量較低層的熒光強度時滲透性約提高3倍。這種效果被發(fā)現(xiàn)受到環(huán)狀T2J004和線性T2J004的顯著抑制。
圖14是用于評價小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞的MBEC4滲透性的實驗的示意圖。
圖15是本發(fā)明的各種肽偶聯(lián)物的MBEC4滲透性的示意圖。
圖16是一組顯示用4F11抗M13噬菌體抗體檢測腦中的重組腦定位噬菌體的照片。
將腦定位噬菌體(上)和對照組噬菌體(下)施用到血管中30分鐘后摘出腦并用4F11抗M13噬菌體抗體染色。在施用了腦定位噬菌體的腦中檢出了噬菌體顆粒。
左顯示使用NIBA濾光片的特異性結(jié)合的熒光照片
中用WIG濾光片檢測非特異性結(jié)合
右使用Hoechst 23384的核染色(細胞的鑒定)
圖17是一組顯示用聚焦顯微鏡檢測小膠質(zhì)細胞的胞吞轉(zhuǎn)運作用的照片。
在使用MBEC4的血腦屏障模型中，添加小膠質(zhì)細胞4小時后檢出胞吞轉(zhuǎn)運作用。從照片中可以觀察到微桔黃色的小膠質(zhì)細胞穿過綠色的血管內(nèi)皮細胞的圖像。
圖18是一組顯示在將小膠質(zhì)細胞添加到血管內(nèi)皮細胞中1小時后的相差顯微鏡圖像(左)和熒光顯微鏡圖像(右)的照片。
圖19是一組顯示用甲苯胺藍染色后在光學顯微鏡下的觀察結(jié)果的照片。添加了小膠質(zhì)細胞(左)和巨噬細胞(右)的MBEC4血腦屏障模型的垂直切片用甲苯胺藍染色。
圖20是MBEC4的電子顯微照片。中間黑色的帶狀部分是一種緊密連接(可見于于血腦屏障中的特征性障礙結(jié)構(gòu))。
圖21是描述小膠質(zhì)細胞穿過血腦屏障模型的電子顯微鏡圖像。
圖22是顯示描述小膠質(zhì)細胞穿過血腦屏障模型的電子顯微鏡圖像。清晰地觀察到小膠質(zhì)細胞突出到形成血腦屏障的MBEC4細胞中。
圖23顯示了巨噬細胞系Raw264.7對MBEC4的粘附。巨噬細胞僅松散地粘附到形成血腦屏障的MBEC4上。未觀察到對細胞層的滲入。
圖24顯示了巨噬細胞系Raw264.7對MBEC4的粘附。巨噬細胞僅松散地粘附到形成血腦屏障的MBEC4上。未觀察到對細胞層的滲入。
實施本發(fā)明的最佳方式
以下，將使用實施例對本發(fā)明進行具體的說明，但并非對本發(fā)明的限制。PEG6000購自Wako，胰蛋白酶EDTA、Luria肉湯培養(yǎng)基(Luria broth base)和青霉素-鏈霉素購自GIBCO。此外，EDTA 2Na、瓊脂糖36G和T7選擇1-1克隆試劑盒分別購自Nacalai、Funakoshi和Novagen。
實施例1 細胞培養(yǎng)
(1)小鼠203神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞
在37℃、5％ CO2的條件下，將203神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)在添加了10％ FCS(GIBCO)、5μg/ml胰島素(SIGMA)和0.22％葡萄糖(Katayama)的MEM(SIGMA)中。將2×105個細胞/7ml平鋪在10cm平板(Falcon)上進行傳代培養(yǎng)，細胞每7天傳代一次。對于淘選，將203神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞以2×106個細胞/7ml平鋪在10cm平板上并在4天后用于淘選。
(2)小鼠血管內(nèi)皮END-D細胞
在37℃、5％ CO2的條件下，將END-D細胞細胞培養(yǎng)在添加了10％滅活FCS、100單位/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM(SIGMA)中。如下進行傳代培養(yǎng)。用PBS(-)洗滌細胞一次，接著添加5ml的0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA4Na，靜置3分鐘，然后用5ml培養(yǎng)基沖洗進行分離。然后，以1200rpm離心5分鐘沉淀所述細胞，除去上清液后用培養(yǎng)基洗滌沉淀一次。隨后，將細胞以3×105個細胞/7ml平鋪到10cm平板上，每3-4天傳代一次。將待用于淘選的END-D細胞以3×106個細胞/7ml平鋪到膠原包被的10cm平板上并在4天后用于淘選。將5μg/cm2膠原(Nitta Gelatin，cellmatrix typeI-C)傾倒到10cm平板中，靜置1小時，然后用PBS(-)洗滌兩次來制備膠原包被的平板。
(3)小鼠腦來源的血管內(nèi)皮細胞MBEC4
在37℃、5％ CO2的條件下，將MBEC4細胞培養(yǎng)在添加了10％FCS、5μg/ml肝素(SIGMA)和30μg/ml內(nèi)皮細胞生長添加劑(ECGS；Upstate Biotechnology)的DMEM中。將2×105個細胞/7ml平鋪到0.2％明膠(Katayama)包被的10cm平板上進行傳代培養(yǎng)，細胞每3-4天傳代一次。將待用于淘選的MBEC4細胞以2×106個細胞/7ml平鋪到膠原包被的10cm平板上，并在4天后用于淘選。
實施例2 M13噬菌體展示文庫
1.大腸桿菌ER2738的培養(yǎng)
37℃下，在含有20μg/ml四環(huán)素(Katayama)的LB培養(yǎng)基中，將包括在Ph.D.-C7CTM噬菌體展示肽文庫試劑盒(New EnglandBiolabs，E8120S)中的宿主大腸桿菌ER2738細胞振蕩培養(yǎng)過夜，然后將培養(yǎng)物在含有20μg/ml四環(huán)素的LB平板上劃線并用作ER2738的工作原種。每間隔兩周制備鮮新鮮的工作原種。
從劃線的工作原種中挑選單個菌落獲得用于噬菌體擴增和滴度量的ER2738，并于37℃下、在含有20μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)細胞過夜。
2.體外淘選
2-1.細胞固定
使用當天按如下所述固定10cm平板，在該平板上形成了用于淘選的一層203小膠質(zhì)細胞(用作對照)、END-D細胞或MBEC4細胞。通過除去培養(yǎng)基、用5ml PBS(-)洗滌一次、添加3ml 4％ PFA(Katayama)/PBS(-)、靜置10分鐘、然后用5ml PBS(-)洗滌3次對各種類型的細胞進行固定。接著，通過于4℃往所述細胞中添加5ml 2％ BSA(SIGMA)/PBS(-)并靜置1小時進行封閉。在加入噬菌體溶液之前，用3ml 0.1％ Tween 20/PBS(-)洗滌各種類型的細胞6次。
2-2.第一次淘選
在第一次淘選中，將1011pfu的M13-C7C噬菌體文庫(10μL)溶解在2ml PBS(-)中，全部加入到203小膠質(zhì)細胞中并在室溫下輕輕振蕩10分鐘以使之吸附。接著，將上清液添加到END-D細胞中并在室溫下輕輕振蕩10分鐘以使之吸附。接著，將上清液添加到MBEC4細胞中并在室溫下輕輕振蕩10分鐘以使之吸附。在10分鐘吸附處理后，用添加了2ml含有1mg/ml BSA的0.2M甘氨酸(Wako)-HCl(pH2.2)的5ml的0.1％ Tween 20/PBS(-)洗滌各類細胞10次并在室溫下輕輕振蕩進行洗提。收集洗提液后，立即用2ml 0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)漂洗細胞，與洗提液合并到一起，并加入1.6ml1M Tris-HCl(pH9.1)進行中和。Tris購自Boehringer。
在各個步驟從各類細胞獲得的各種噬菌體洗提液的滴度通過下面在“2-2-1.噬菌體滴定”中說明的方法來測定。
從MBEC4細胞洗提出的噬菌體溶液用下面在“2-2-2.噬菌體擴增和純化”中說明的方法進行擴增，并用于第二次淘選。
2-2-1.噬菌體滴定
按照如下測定噬菌體溶液的滴度。
將ER2738過夜培養(yǎng)物和3μL IPTG(Katayama)/X-gel(Nacalai)混合物250μL(50μg/ml IPTG；40μg/ml X-gel)添加到14-ml按蓋式試管(Falcon)中，再加入2.5ml溶解的Top瓊脂糖(于LB培養(yǎng)基中，6μg/ml瓊脂糖)并混合。立即將混合物平鋪在LB/IPTG/X-gel平板上以制備ER2378laund平板。在TBS中制備噬菌體溶液的一系列稀釋液用于滴定。將10μL各稀釋液吸印到ER2378laund平板上，干燥至溶液不再流動，并于37℃培養(yǎng)過夜。通過計數(shù)藍斑數(shù)目計算噬菌體溶液的滴度。
2-2-2.噬菌體擴增和純化
將待擴增的噬菌體溶液添加到含有20μg/ml四環(huán)素和1/100體積的ER2738過夜培養(yǎng)物的LB培養(yǎng)基中，然后于37℃在帶有調(diào)節(jié)阻板的錐形燒瓶中振蕩培養(yǎng)4.5-5小時。接著，于4℃，以10,000rpm離心該培養(yǎng)物10分鐘，收集上清液。于4℃，以10,000rpm離心該上清液10分鐘以完全除去ER2738細胞。將1/6體積的30％ PEG/3MNaCl(SIGMA)添加到該上清液中，噬菌體在冰上沉淀過夜。于4℃以10,000rpm離心45分鐘后，通過傾析除去上清液，并于4℃下以10,000rpm再離心沉淀10分鐘以收集噬菌體沉淀。將噬菌體沉淀完全溶解在2ml TBS/0.02％ NaN3(SIGMA)中，4℃下以10,000rpm離心5分鐘，收集上清液。將CsCl(Wako)以0.467g/ml的濃度添加到上清液中，并于15℃以80,000rpm進行密度梯度離心18小時，然后收集代表純化的噬菌體的條帶。用TBS透析所收集的純化噬菌體以除去CsCl，加入0.02％ NaN3后儲存于4℃。
2-3.第二次淘選
在第二次淘選中，將1010pfu的M13-C7C噬菌體混合物溶液溶解在2ml PBS(-)中，并全部添加到203小膠質(zhì)細胞中。然后于室溫下輕輕振蕩10分鐘以使之被吸附。接著，將上清液添加到END-D細胞中，并于室溫下輕輕振蕩10分鐘以使之被吸附。隨后，將上清液添加到MBEC4細胞中，并于室溫下輕輕振蕩10分鐘以使之被吸附。在10分鐘吸附處理后，通過用5ml 0.3％ Tween 20/PBS(-)洗滌各種類型細胞10次，然后加入2ml含有1mg/ml BSA的0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)并在室溫下輕輕振蕩進行洗提。收集洗提液后，立即用2ml 0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)漂洗細胞，與洗提液合并到一起，并加入1.6ml 1M Tris-HCl(pH9.1)進行中和。
在各個步驟來自各類細胞的各種噬菌體洗提液的滴度通過上面在“2-2-1.噬菌體滴定”中說明的方法獲得。
從MBEC4細胞洗提出的噬菌體溶液用上面在“2-2-2.噬菌體擴增和純化”中說明的方法進行擴增，并用于體內(nèi)淘選。
3.體內(nèi)淘選
3-1.噬菌體注射
將8周齡的雄性C57BL小鼠用于體內(nèi)淘選。在乙醚麻醉的條件下，在單次應用中，將1011pfu/300μl PBS的純化噬菌體施用到小鼠的左側(cè)頸動脈中。1分鐘后，用包被有15mg/ml EDTA的結(jié)核菌素注射器(26G)從心臟抽血，并立即用400ml 0.2g/ml EDTA/PBS進行灌注。當灌注結(jié)束時，收集心臟灌注液。灌注后，摘出腦，從各個腦中取一部分作為樣品用于滴定和制備組織切片。左腦被用于滴定，右腦被用于切片制備。
3-2.組織樣品的制備
稱重用于滴定的組織，加入雙倍體積的勻漿溶液(20mM HEPES(SIGMA)/0.25M蔗糖/1mM EDTA，使用前立即添加10μg/ml抑酶肽(Wako)、5μg/ml亮抑酶肽(SIGMA)和1mM PMSF(Wako))后，在冰上進行勻漿。接著，添加與所添加的勻漿溶液等量的體積的100mM LiCl(Katayama)/PBS并進行混合。
于4℃，以15,000rpm離心血液10分鐘，收集血漿，并測定滴度。
勻漿、血漿和組織灌注液的噬菌體滴度通過上面在“2-2-1.噬菌體滴定”中所描述的方法來測定。
所有腦勻漿都通過在上面“2-2-2.噬菌體擴增和純化”中說明的方法進行擴增，并用于如下的體內(nèi)淘選。
4.噬菌體克隆和測序
4-1.克隆
對已經(jīng)進行兩輪體外淘選和一輪體內(nèi)淘選的腦勻漿，或?qū)υ谝呀?jīng)進行三輪體內(nèi)淘選的腦勻漿進行噬菌體克隆。
用TBS制備腦勻漿的系列稀釋液，按照上面在“2-2-1.噬菌體滴定”中描述的方法形成噬菌體空斑，挑選單個空斑，并各自放入1mlTBS中。重復該操作以克隆所述噬菌體。
4-2.測序
將1ml LB培養(yǎng)基、10μL ER2738過夜培養(yǎng)物和100μL噬菌體克隆溶液放置在14ml的按蓋式試管中，于37℃下振蕩培養(yǎng)4.5小時。
于4℃，以5,000rpm離心5分鐘沉淀ER2738細胞。將上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml的Eppendorf管中，并于4℃以10,000rpm離心1分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的Eppendorf管中。接著，加入400μL 30％PEG/3M NaCl，通過倒轉(zhuǎn)混合后，于4℃條件下靜置過夜。
于4℃，以13,000rpm離心30分鐘后，通過傾析除去上清液，于4℃以13,000rpm進一步離心殘留物30分鐘，通過抽吸完全除去剩余的上清液。
將100μL碘化物緩沖液(4M NaI(SIGMA)/1mM EDTA/10mMTris pH8.0)添加到沉淀的噬菌體中并懸浮以完全溶解所述噬菌體。接著，加入250μL乙醇并通過倒轉(zhuǎn)混合。在室溫下溫育10分鐘后，在室溫下以15,000rpm離心10分鐘，并除去上清液。用1ml 70％乙醇輕輕洗滌沉淀物，并在室溫下以15,000rpm離心5分鐘。通過傾析除去上清液，將沉淀在干燥器中干燥5分鐘。將沉淀溶解在30μLTE中并用作序列模板。在Gene Rapid SEQ 4×4(Amersham)中，使用附隨在Ph.D.-C7CTM中的-28gIII測序引物(5’-GTA TGG GAT AAACAA C-3’/SEQ ID NO13)以及Thermo Sequence Cy5.5 DyeTerminator試劑盒(Amersham)進行測序。
5.噬菌體克隆的評價
按照上面在“2-2-2.噬菌體擴增和純化”中描述的方法擴增和純化所獲得的噬菌體克隆。使用按照上面在“3.體內(nèi)淘選”中描述的方法所測定到的滴度，其中將噬菌體的劑量改變?yōu)?010pfu/300μL，對該純化的噬菌體克隆轉(zhuǎn)移到腦中的能力進行評價。M13-KE(NewEngland Biolabs，E8101S；克隆編號1148)被用作對照組噬菌體。
實施例3 T7噬菌體展示文庫
1.T7噬菌體展示文庫的構(gòu)建
設(shè)計并合成包含具有添加到兩末端的EcoRI和Hind III限制性酶切位點并具有81-bp(415-15GAATCCATGCAGAATTTC(XXK)15AAGCCTGCTACAGACCAT/SEQ ID NO14)或86-bp(415-C15CGATCCATGCAGAATTCCTGC(XXK)15TGCAAGCTTGCTACAGACCAT/SEQ ID NO15)的隨機序列的寡核苷酸，使得它們能夠插入到T7噬菌體10B基因序列中。將約1.3μg(50pmol)該寡核苷酸用作模板，并利用約1.9μg(300pmol)的5’和3’端引物進行PCR來制備包含隨機序列的插入物用于插入到T7噬菌體展示文庫中。用EcoRI和HindIII限制性酶消化所制備到的插入物、在瓊脂糖凝膠上分離、純化、插入到pQE-TriSystem載體的EcoRI和Hind III位點之間并用大腸桿菌進行擴增。然后確認該隨機序列。確認后，從大腸桿菌中純化出攜帶隨機序列的質(zhì)粒，并用EcoRI和HindIII進行消化。在瓊脂糖凝膠上分離目標片段、純化并插入到T7噬菌體10B基因序列中，該基因序列已經(jīng)類似地用EcoRI和HindIII消化(圖2和3)。按照附隨在T7選擇克隆試劑盒(Novagen)中的說明書進行向10B基因序列的插入和體外包裝為噬菌體。上述的引物序列如下所示
415-155′端引物GAATCCATGCAGAATTCC(SEQ ID NO16)
415-153′端引物
ATGGTCTGTAGCAAGCTT(SEQ ID NO17)
415-C15C 5′端引物
GATCCATGCAGAATTCCTGC(SEQ ID NO18)
415-C15C 3′端引物
ATGGTCTGTAGCAAGCTTGCA(SEQ ID NO19)
2.大腸桿菌BL21和BLT5403的培養(yǎng)
于37℃，在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)附帶在T7選擇415-1克隆試劑盒(Novagen，70015-3)中的宿主大腸桿菌BL21或BLT5403細胞過夜，在LB平板上劃線以制備BL21或BLT5403工作原種。每兩周制備新鮮的工作原種。通過從工作原種中挑選單個克隆，并于37℃將它們在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜獲得了用于噬菌體擴增和滴定的BL21和BLT5403細胞。
3.體外淘選
3-1.細胞固定
在使用當天如下固定3個已經(jīng)在其上形成一層待用于淘選的203小膠質(zhì)細胞(用作對照)的10cm平板和1個用MBEC4細胞制備的平板。通過除去培養(yǎng)基、用5ml PBS(-)洗滌一次、添加3ml的4％PFA/PBS(-)并將之靜置10分鐘對各種類型的細胞進行固定。接著，通過加入5ml的2％ BSA/PBS(-)并于4℃靜置30分鐘對細胞進行封閉。在加入噬菌體之前，立即通過抽吸除去封閉溶液。
3-2.淘選
T7選擇415-1克隆試劑盒(Novagen)被用于制備文庫，在該文庫中插入了插入物使得置于兩個半胱氨酸之間的15個殘基的隨機肽被展示，且該文庫被用作T7選擇415-c15c文庫(圖4)。在體外淘選中，將2×109pfu的T7選擇415-c15c文庫溶解于2ml PBS(-)中并平鋪于4cm平板上；收集全部溶液，然后平鋪在新的4cm平板上。接著，將所收集的全部溶液中的1.1ml轉(zhuǎn)移到一只新試管中，往其中添加1.1ml的2％脫脂乳/PBS(-)，并在室溫下輕輕混合10分鐘。于4℃、以10,000rpm離心該混合物10分鐘，將所獲得的上清液中的2ml添加到第一個203小膠質(zhì)細胞平板中，該平板已經(jīng)用上面在“3-1.細胞固定”中說明的方法進行固定和封閉，并且為了吸附，將該平板在室溫下輕輕振蕩20分鐘。接著，用上清液對第二個和第三個203小膠質(zhì)細胞平板進行類似處理。上清液還被添加到MBEC4細胞中，并在室溫下輕輕振蕩30分鐘以被吸附。通過抽吸除去上清液，用10mlPBS(-)洗滌3次。接著在2ml的0.01％ NP-40/PBS(-)中洗滌3次，并輕輕振蕩10分鐘。接著，通過用0.1％ NP-40/PBS(-)進行洗滌并在0.4ml的0.1％ SDS/SM緩沖液中輕輕振蕩10分鐘除去松散結(jié)合的噬菌體。用0.6ml SM緩沖液進行漂洗，然后在0.4ml的0.5％SDS/SM緩沖液中輕輕振蕩10分鐘進行洗提，并將洗提液與0.6ml的SM緩沖液漂洗溶液合并以制備低親合力的噬菌體洗提液。接著，通過在1％ SDS/SM緩沖液中輕輕振蕩10分鐘進行洗提，并將洗提液與0.6ml SM緩沖液漂洗溶液合并以制備高親合力的噬菌體洗提液。淘選程序概述于圖5中。
通過下面在“3-2-1.噬菌體滴定”中說明的方法測定各步驟的各噬菌體洗提液的滴度。在滴定中，根據(jù)稀釋100倍以上的噬菌體溶液來計算滴度。
此外，通過下面在“3-2-2.噬菌體擴增和純化”中說明的方法對從MBEC4細胞洗提出的噬菌體溶液進行擴增，并用于下一輪淘選。
在八輪的體外淘選后，克隆到了噬菌體。
3-2-1.噬菌體滴定
如下測量噬菌體溶液的滴度。
往14ml按蓋式試管中添加250μL的BL21或BLT5403的過夜培養(yǎng)物，加入2.5ml溶解的Top瓊脂糖(于LB肉湯中，6μg/ml瓊脂糖)并進行混合。立即將其平鋪在LB平板上以制備BL21 laund平板和BLT5403 laund平板。使SM緩沖液制備待測定滴度的噬菌體溶液的系列稀釋液，并將這些溶液以10μL的等分試樣吸印在BL21 laund平板和BLT5403 laund平板上，干燥至溶液不再流動，然后在37℃培養(yǎng)2-4小時。通過計算所形成的空斑數(shù)目來計算所述噬菌體溶液的滴度。具有被用作前述實施例2的“3.體內(nèi)淘選”中的內(nèi)標的被插入T7rRNAT7選擇1-1試劑盒(NEB，70010-3)中的rRNA的cDNA的一部分(5’-CAC CAA GCG TTG GAT TGT TCA CCC ACT AAT AGGGAA CGT GAG CTG GGT TTA GAC CGT CGT GAG ACA GGT TAGTTT TAC CCT ACT GAT GAT GTG TTG TTG CCA TGG TAA TCCTGC TCA GTA CGA GAG GAA CCG CAG GTT CAG ACA TTT GGTGTA TGT GCT TGG CTG AGG AGC CAA TGG GGC GAA GCT ACCATC TGT GGG ATT ATG ACT GAA CGC CTC TAA GTC AGA ATCCCG CCC AG-3’/SEQ ID NO20)的噬菌體不能在BL21中生長，僅當BLT5403被用作宿主時才形成空斑。
3-2-2.噬菌體擴增和純化
于37℃，將已經(jīng)加入了1/100體積的BL21過夜培養(yǎng)物的LB培養(yǎng)基在帶有調(diào)節(jié)阻板的錐形燒瓶中振蕩培養(yǎng)2-3小時，然后加入待擴增的噬菌體溶液并進一步振蕩培養(yǎng)1-3小時(溶解的大腸桿菌碎片的含量和混濁度降低被用作指示劑)。隨后，于4℃，以10,000rpm離心該培養(yǎng)物10分鐘，并收集上清液。
添加1/2體積的30％ PEG/3M NaCl后，將上清液靜置于冰上過夜，噬菌體被沉淀下來。接著，于4℃，以10,000rpm離心45分鐘，通過傾析除去上清液，于4℃以10,000rpm進一步離心10分鐘，然后收集噬菌體沉淀。將噬菌體沉淀完全溶解在2ml SM緩沖液中，于4℃以10,000rpm離心該溶液5分鐘。然后收集上清液，接著以0.5g/ml往上清液中添加CsCl，于15℃以80,000rpm進行密度梯度離心18小時，并收集代表純化的噬菌體的條帶。用SM緩沖液透析所收集的純化的噬菌體以除去CsCl，并在添加數(shù)滴氯仿后儲存于4℃。
4.克隆
用SM緩沖液制備來自第八輪體外淘選的噬菌體洗提液的系列稀釋液，根據(jù)“3-2-1.噬菌體滴定”的方法形成噬菌體空斑，然后挑選單個空斑，并將各個空斑置于1ml SM緩沖液中。重復該操作一次以克隆噬菌體。
5.測序
將該噬菌體克隆的一部分用MilliQ水稀釋100倍，于95℃加熱5分鐘，然后立即在冰上冷卻以制備PCR模板。加入1μL的該模板，加入5’-GCT CTG CGG TAG GTA CTG TT-3’(SEQ ID NO21)和5’-CGG TGC CCC AAA GAA TCG GT-3’(SEQ ID NO22)作為引物(各1μM)，如下所述以30μL的規(guī)模進行PCR。進行40個反應循環(huán)(94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，2分鐘)。隨后，用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，將沉淀溶解在10μL的TE中。接著，用CHROMASPIN+TE30柱(Clontech，K1321-2)純化PCR產(chǎn)物以制備序列模板。
用Thermo Sequence Cy5.5 Dye Terminator試劑盒(Amersham)制備序列模板，并在Gene Rapid SEQ 4×4上對序列進行測定。
如上面在“3-2-2.噬菌體擴增和純化”中所述的那樣純化噬菌體克隆，并用于體內(nèi)評價。
6.噬菌體克隆的評價
6-1.噬菌體注射
將8周齡的雄性C57BL小鼠用于體內(nèi)淘選。通過1小時UV照射對T7選擇415-c15c文庫(4×106pfu/200μL PBS)進行滅菌和純化，在乙醚麻醉進行封閉的條件下將其施用到小鼠的左側(cè)頸動脈中。5分鐘后，施用200μL含有純化的T7選擇415-c15c克隆和作為內(nèi)標的T7rRNA的噬菌體混合物溶液(各4×106pfu)。1分鐘后，用以15mg/ml EDTA包被的結(jié)核菌素注射器(26G)從心臟抽血，并立即用400ml的0.2g/ml EDTA-PBS進行灌注。當灌注結(jié)束時，收集心臟灌注液。灌注后，摘出腦，從各個腦中取一部分作為樣品用于滴定和制備組織切片。左腦用于滴定，右腦用于切片制備。
6-2.組織樣品制備
稱重用于滴定的組織，在加入雙倍體積的勻漿溶液(20mMHEPES/0.25M蔗糖/1mM EDTA，使用前立即添加10μg/ml抑酶肽，5μg/ml亮抑酶肽和1mM PMSF)后，在冰上進行勻漿。接著，添加與所添加的勻漿溶液等量的體積的100mM LiCl/PBS并進行混合。
于4℃，以15,000rpm離心血液10分鐘，收集血漿，并測定滴度。
通過上面在“3-2-1.噬菌體滴定”中描述的方法測定組織的各勻漿、血漿和灌注液的噬菌體滴度。
從組織樣品中分離對各個器官具有親合力的重組噬菌體。生長從腦回收的噬菌體并再次注射到小鼠的尾靜脈中，進行與上述類似的分析。結(jié)果，分離到數(shù)個陽性克隆。代表性的序列如下所示。
序列1MLGDPN-CVKQAVQSSVKHPDLSC-KLAAALE(SEQID NO23)
序列2MLGDPN-CPRGLPVTFRLMEKSKC-KLAAALE(SEQ IDNO24)
將包含這些序列的噬菌體克隆注入小鼠，發(fā)現(xiàn)它們定位于腦(圖6和7)。因此，上面描述的方法能夠分離特異性地滲入腦中的候選分子。
此外，通過一種類似方法，可以分離到特異性地靶向除腦以外的器官的分子。實際上，如圖7中所示，分離到了對除腦以外的器官具有親合力的噬菌體。
實施例4 腦定位肽偶聯(lián)物
本申請發(fā)明人制備了腦定位肽偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物是可以具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分子，該環(huán)狀結(jié)構(gòu)是由于在本發(fā)明的肽分子的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵產(chǎn)生的，該分子還可能具有附著于其上的生物素。更特別的例子是圖8中所示的結(jié)構(gòu)。該偶聯(lián)物具有對抗生物素蛋白化合物的親合力。
該偶聯(lián)物被結(jié)合到膠體金上，并被施用給小鼠，對小鼠進行評價本發(fā)明肽的腦定位活性的試驗(在透射電子顯微鏡下觀察腦組織切片)。用于制備透射電子顯微鏡樣品的操作被示于表2中。
表2
(i)加工整理(trimming)
(ii)用玻璃刀制備厚切片(2-3μm厚)
(iii)用鉆石刀制備超薄切片(50-100nm厚)
(iv)電子染色2％的乙酸雙氧鈾，然后用1％檸檬酸鉛(各3分鐘)
(v)透射電子顯微鏡觀察(80kV的加速電壓)
在本試驗中，T2J002(SEQ ID NO2)和T2J004(SEQ ID NO4)被用作本發(fā)明的肽。小鼠腦組織(細胞)的電子顯微鏡照片示于圖9和10中。箭頭表示結(jié)合金顆粒的本發(fā)明的肽分子的位置。結(jié)果表明本發(fā)明的肽偶聯(lián)物成功地將膠體金轉(zhuǎn)運到腦實質(zhì)中。更特別地，本發(fā)明的肽被證實為具有腦定位活性。
實施例5 T2J004Y-生物素滲透試驗
使用如下試劑鏈霉抗生物素蛋白、FITC偶聯(lián)物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004-生物素加上用于MBEC4試驗的DMEM(SIGMA)10％ FBS(GIBCO lot.1077859)和用于END-D試驗的DMEM+10％FBS(GIBCO lot.1077859于65℃滅活30分鐘)。上述“T2J004Y-生物素”包含SEQ ID NO4中所示的多肽。
首先，將MBEC4(1.26×104/插入物)和END-D(2×104/插入物)種植在細胞培養(yǎng)物插入物(FALCON[35]3096；3.0μm孔徑)中，并于37℃、在5％ CO2的條件下培養(yǎng)4天。
將鏈霉抗生物素蛋白、FITC偶聯(lián)物(25μL/插入物)和T2J004Y-生物素(1.6nmol/插入物)混合，在室溫下培養(yǎng)30分鐘。隨后，用各培養(yǎng)基替換插入物中的培養(yǎng)基將體積調(diào)整為250μL，往各孔(用于細胞培養(yǎng)插入物的FALCON 24-孔平板)中添加750μL培養(yǎng)基。在3、6和24小時后，從各個孔中采樣100μL，用Fluoroskan Ascent(ThermoLabsystems)測定熒光強度。本試驗概述于圖11中。
結(jié)果，當與單獨的FITC的滲透性相比時，F(xiàn)ITC-偶聯(lián)的T2J004Y-生物素的滲透性在MBEC4和END-D分別高8倍和4倍。此外，肽進入MBEC4的滲透性比在END-D中的滲透性高兩倍，并且滲透量隨時間增加。
實施例6 所添加的T2J004Y-生物素的量與在MBEC4中的滲透量之間的關(guān)系
抗生物素蛋白和生物素以1∶4的比例結(jié)合。改變將與鏈霉抗生物素蛋白-FITC反應的T2J004Y-生物素的比例，并檢測在MBEC4中的滲透量。
使用如下試劑鏈霉抗生物素蛋白、FITC偶聯(lián)物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004Y-生物素、DMEM+10％FBS。
首先，種植MBEC4(1.26×104/插入物)，并于37℃、在5％CO2的條件下培養(yǎng)4天。將與1.6nmol/插入物、0.4nmol/插入物和0.2nmol/插入物的T2J004Y-生物素混合的鏈霉抗生物素蛋白-FITC偶聯(lián)物(25μL/插入物)添加到細胞中，并于室溫下培養(yǎng)30分鐘。用培養(yǎng)基替換插入物中的培養(yǎng)基，將混合溶液的體積調(diào)整為250μL。往各孔中添加750μL的培養(yǎng)基，并于3小時和6小時后用Fluoroskan Acsent測量熒光強度。
肽滲透量與所添加的肽的量相關(guān)。但是，與添加0.4nmol/插入物的肽相比，添加1.6nmol/插入物的肽(高四倍的量)僅導致肽滲透的量增加約兩倍。因此，肽的1.6nmol/插入物似乎足以在6小時內(nèi)滲透穿過MBEC4層，該MBEC4層具有0.3cm2的有效插入物培養(yǎng)表面積(圖12)。
實施例7 肽對T2J004Y-生物素滲透的抑制
檢測T2J004Y-生物素-FITC滲透是否被非生物素化的肽預處理抑制。
使用如下試劑鏈霉抗生物素蛋白、FITC偶聯(lián)物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004Y-生物素、用于MBEC4試驗的DMEM+10％FBS、CT2J004Y和LT2J004Y。(“CT2J004Y”是指具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分子，“LT2J004Y”是指具有線性結(jié)構(gòu)的分子。所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)通過該分子中的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成)。
首先，將各種未被生物素化的肽(10nmol/插入物)與培養(yǎng)基(200μL/插入物)混合，以替換用于在前述條件下培養(yǎng)4天的插入物培養(yǎng)基。30分鐘后，用培養(yǎng)基將以上述相同方式將被混合的肽-FITC混合物調(diào)整為50μL，并添加到插入物中。6小時后，充分攪拌24孔中內(nèi)容物，并使用Fluoroskan Ascent測量熒光強度。
結(jié)果，CT2J004Y和LT2J004Y都單獨抑制了T2J004Y-生物素-FITC的滲透約25％(圖13)。
實施例8 通過預處理噬菌體抑制小膠質(zhì)細胞滲透
使用如下試劑用于一般細胞膜標記的PKH57綠色熒光細胞連接試劑盒(SIGMA)、DMEM+10％ FBS。
首先，將MBEC4細胞(1.26×104/插入物)接種到插入物中，并于37℃、在5％ CO2的條件下培養(yǎng)4天，然后往其中加入5μL對照和5μL呈遞腦定位肽的噬菌體(1013pfu/ml)，之后進行1小時的預處理。用PKH26對小膠質(zhì)細胞膜進行染色后，將2×105個細胞/插入物加入到DMEM+10％ FBS中以制備250μL樣品。將750μL培養(yǎng)基加入孔中，24小時后，計數(shù)孔底部和培養(yǎng)物中的小膠質(zhì)細胞的數(shù)目。圖14是該試驗的概括。
結(jié)果，與對照組噬菌體相比，呈遞腦定位肽的噬菌體似乎稍微抑制小膠質(zhì)細胞滲透穿過MBEC4。未觀察到明顯的差別，這可能是因為與MBEC4上的受體數(shù)目相比，噬菌體和用作配體的小膠質(zhì)細胞的數(shù)目較少。
實施例9 T2J004Y-生物素和其他肽的滲透性的比較
使用如下試劑鏈霉抗生物素蛋白、FITC偶聯(lián)物(Vector；1.0mg/ml)、T2J004Y-生物素、T2J002Y-生物素、T2J003Y-生物素、用于MBEC4的DMEM+10％ FBS。
首先，將MBEC4細胞(1.26×104/插入物)接種到插入物中，并于37℃、在5％ CO2的條件下培養(yǎng)4天。將鏈霉抗生物素蛋白、FITC偶聯(lián)物(25μL/插入物)和T2J004Y-生物素、T2J002Y-生物素和T2J003Y-生物素(各1.6nmol/插入物)分別混合，并于室溫下培養(yǎng)30分鐘。隨后，用各種培養(yǎng)基替換插入物中的培養(yǎng)基，將混合物調(diào)整為250μL，然后將750μL培養(yǎng)基加入各個孔中(用于細胞培養(yǎng)插入物的FALCON 24-孔板)。3、6和24小時后，從孔中采樣100μL，用Fluoroskan Ascent測量熒光強度。
將T2J004Y-生物素的MBEC4滲透性視為100來表示T2J002Y-生物素和T2J003Y-生物素的滲透比率的結(jié)果。T2J002Y-生物素的滲透性僅為T2J004Y-生物素的滲透性的20-40％，但T2J003Y-生物素的滲透性高出約1.4倍(圖15)。
實施例10 表達本發(fā)明的肽的噬菌體的腦定位活性
血管內(nèi)施用表達本發(fā)明的肽的噬菌體和對照組噬菌體，并檢測腦定位活性。
結(jié)果，在腦中檢測到表達本發(fā)明的肽的噬菌體顆粒(圖16)。
實施例11 小膠質(zhì)細胞的胞吞轉(zhuǎn)運活性
在使用了MBEC4的血腦屏障模型中觀察小膠質(zhì)細胞的胞吞轉(zhuǎn)運作用。
加入小膠質(zhì)細胞后4小時檢測胞吞轉(zhuǎn)運作用(圖17)。
此外，用電子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細胞穿過血腦屏障模型時的胞吞轉(zhuǎn)運活性。
結(jié)果，清楚地觀察到了滲透到形成血腦屏障的MBEC4細胞中的小膠質(zhì)細胞突起的圖像(圖21和22)。
此外，作為對照試驗，使用巨噬細胞進行了類似的試驗。巨噬細胞僅松散地粘附到形成血腦屏障的MBEC4細胞上，而未滲透到細胞層中(圖23和24)。
工業(yè)實用性
本申請發(fā)明人首次揭示了與腦定位活性相關(guān)的氨基酸基序序列，并且發(fā)現(xiàn)了包含該基序序列的多肽具有腦定位活性。本發(fā)明的多肽與腦血管內(nèi)皮細胞特異性地相結(jié)合，并誘導了一種跨細胞路徑使得能夠?qū)⑽镔|(zhì)轉(zhuǎn)運到腦實質(zhì)中。
序列表
<110>株式會社組織定向
<120>具有腦定位活性的多肽及其用途
<130>TTJ-A0301P
<150>JP 2003-289890
<151>2003-08-08
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
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<223>an artificially synthesized sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(22)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(28)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(31)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(34)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)..(37)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(39)..(40)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(43)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(46)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(49)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(52)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(55)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(58)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(60)..(61)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(64)
<223>″n″＝a，t，g，or c.
<400>15
gatccatgca gaattcctgc nnknnknnkn nknnknnknn knnknnknnk nnknnknnkn 60
nknnktgcaa gcttgctaca gaccat 86
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized primer sequence
<400>16
gaatccatgc agaattcc 18
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized primer sequence
<400>17
atggtctgta gcaagctt 18
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized primer sequence
<400>18
gatccatgca gaattcctgc 20
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized primer sequence
<400>19
atggtctgta gcaagCttgc a 21
<210>20
<211>236
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>20
caccaagcgt tggattgttc acccactaat agggaacgtg agctgggttt agaccgtcgt 60
gagacaggtt agttttaccc tactgatgat gtgttgttgc catggtaatc ctgctcagta120
cgagaggaac cgcaggttca gacatttggt gtatgtgctt ggctgaggag ccaatggggc180
gaagctacca tctgtgggat tatgactgaa cgcctctaag tcagaatccc gcccag236
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized primer sequence
<400>21
gctctgcggt aggtactgtt 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized primer sequence
<400>22
cggtgcccca aagaatcggt 20
<210>23
<211>30
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized sequence
<400>23
Met Leu Gly Asp Pro Asn Cys Val Lys Gln Ala Val Gln Ser Ser Val
1 5 10 15
Lys His Pro Asp Leu Ser Cys Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu
20 25 30
<210>24
<211>30
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>an artificially synthesized sequence
<400>24
Met Leu Gly Asp Pro Asn Cys Pro Arg Gly Leu Pro Val Thr Thr Arg
1 510 15
Leu Met Glu Lys Ser Lys Cys Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu
20 25 30
權(quán)利要求
1.一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽的10％或更多由堿性氨基酸殘基(K或R)組成。
2.一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含一個環(huán)狀肽區(qū)域，且其中該環(huán)狀肽區(qū)域的10％或更多由堿性氨基酸殘基(K或R)組成。
3.一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含一個環(huán)狀肽區(qū)域，且在該環(huán)狀肽區(qū)域包含至少一個或多個堿性氨基酸殘基(K或R)。
4.一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含一個環(huán)狀肽區(qū)域，且在該環(huán)狀肽區(qū)域包含至少一個或多個堿性氨基酸殘基(K或R)，其中該環(huán)狀區(qū)域中的其余的氨基酸殘基的80％或更多選自如下一組氨基酸殘基G、A、V、L、S、T、P、Q、H和N。
5.一種具有腦定位活性的多肽，其中該多肽包含氨基酸基序序列
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、N、P、V或L；X3表示任意氨基酸；X4表示G、S、T、C、N、L、Q或Y。
6.權(quán)利要求2-4中任何一項的多肽，其中所述環(huán)狀肽區(qū)域包含權(quán)利要求5的氨基酸基序序列。
7.權(quán)利要求5或6的多肽，其中所述氨基酸基序序列為
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、N、P或V；X3表示任意氨基酸；X4表示不帶電的極性氨基酸(G、S、T、C、N、Q和Y)。
8.權(quán)利要求5或6的多肽，其中所述氨基酸基序序列為
X1-(R或K)-X3-X4或
X4-X3-(R或K)-X1，
其中X1表示S、T、P或L；X3表示任意氨基酸；X4表示S、T、C、L或Q。
9.權(quán)利要求1-8中任何一項的多肽，其中所述多肽具有移行誘導活性。
10.權(quán)利要求1-8中任何一項的多肽，其中所述多肽具有與腦血管內(nèi)皮細胞相結(jié)合的活性。
11.下述(a)-(c)中任何一項的多肽
(a)包含SEQ ID NO1-12中的任何一種氨基酸序列的多肽；
(b)包含一個肽區(qū)域的多肽，該肽區(qū)域通過由(a)的多肽的兩末端上的半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵而被環(huán)化；和
(c)一種具有腦定位活性并包含一種在SEQ ID NO1-12中的任何一種氨基酸序列上具有一個或多個氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列的多肽。
12.權(quán)利要求1-11中任何一項的多肽，其中所述多肽的長度為9個氨基酸或更少。
13.編碼權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽的多核苷酸。
14.與權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽相結(jié)合的抗體。
15.賦予任意分子腦定位活性的藥劑，其中該藥劑包含權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽。
16.權(quán)利要求15的藥劑，其中所述任意分子為任意多肽。
17.一種具有腦定位活性的分子，其中該分子包含權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽。
18.權(quán)利要求17的分子，其中所述分子是噬菌體顆?；蚴删w顆粒的外殼蛋白。
19.權(quán)利要求17的分子，其中所述分子是與權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽形成的融合蛋白。
20.一種腦送達用載體，其中該載體包含權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽。
21.一種腦送達用載體，其中該載體包括一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽被結(jié)合到膠束、脂質(zhì)體或微囊上。
22.一種用于腦疾病的治療劑，其中該治療劑包括一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中藥物附載在權(quán)利要求20或21的腦送達用載體上。
23.一種用于制備具有腦定位活性的分子的方法，其中該方法包括將權(quán)利要求1-12的任何一項的多肽結(jié)合到任意分子上。
24.一種用于制備具有腦定位活性的蛋白質(zhì)分子的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)制備包含一種可表達形式的DNA的表達載體，其中該DNA具有一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中編碼任意蛋白質(zhì)分子的DNA被連接到編碼權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽的DNA上；
(b)將該表達載體導入細胞中；和
(c)收集該載體的表達產(chǎn)物。
25.一種用于將任意分子轉(zhuǎn)運到非人動物的腦中的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)制備具有腦定位活性的分子，其中該分子包含一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中一種任意分子被結(jié)合到權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽上；和
(b)將該分子施用到非人動物的機體中。
26.一種篩選具有與權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽結(jié)合的活性的分子的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)將權(quán)利要求1-12中任何一項的多肽與測試分子相接觸；
(b)檢測所述多肽與所述測試分子之間的結(jié)合活性；和
(c)選擇與所述多肽相結(jié)合的分子。
27.一種篩選具有腦定位活性的多肽的方法，其中該方法包括以下步驟
(a)制備在其噬菌體外殼蛋白上展示測試多肽的噬菌體顆粒；
(b)將所述噬菌體顆粒施用給非人動物；
(c)從所述非人動物的腦組織中收集噬菌體顆粒；和
(d)選擇在步驟(c)中收集的噬菌體顆粒上展示的測試多肽作為具有腦定位活性的多肽。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述測試多肽包含權(quán)利要求5、7和8中任何一項的氨基酸基序序列。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述噬菌體是M13噬菌體或T7噬菌體。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述方法還包括在步驟(a)后選擇與腦血管內(nèi)皮細胞相結(jié)合的噬菌體顆粒。
全文摘要
本發(fā)明合成了編碼包含隨機氨基酸序列的多肽的DNA，并將其整合到噬菌體文庫中。所生產(chǎn)的噬菌體文庫被用于篩選具有腦定位活性的多肽。結(jié)果，獲得了多種具有腦定位活性的多肽。這些多肽包含共同序列，且本發(fā)明成功地鑒定了與腦定位活性相關(guān)的氨基酸基序序列。
文檔編號C07K16/44GK1863815SQ20048002946
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者澤田誠 申請人:株式會社組織定向