專利名稱：編碼p185的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有p15neu-編碼序列的質(zhì)粒載體及其在抗腫瘤的DNA疫苗接種中的用途。根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒含有編碼人類或大鼠癌蛋白質(zhì)p185neu不同片段的序列，并且能夠誘導(dǎo)抗表達(dá)ErbB家族癌基因的腫瘤的體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及含有所述質(zhì)粒的藥物組合物以及它們用于預(yù)防或治療表達(dá)p185neu的腫瘤的用途。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)p185neu是研究最多的腫瘤抗原之一，由于它存在于一些最常見的人類癌細(xì)胞膜上，所以它作為抗癌免疫治療的靶標(biāo)引起了人們極大的興趣。
p185neu是在大鼠體內(nèi)由原癌基因Her2/neu編碼的膜受體，并且屬于I類酪氨酸激酶受體(RTKs)家族，此家族還包括表皮生長因子受體EGF-R(ErbB-1)和其它相關(guān)受體(ErbB-3、ErbB-4)。這些受體與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)(Hynes和Stern，1994BBA 1198165)，因此引起極大的生物學(xué)及臨床興趣。此受體由三個明確區(qū)分的結(jié)構(gòu)域胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。p185neu與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)通訊的機制的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，此所述機制調(diào)節(jié)增殖與分化過程(Boyle 1992Curr.Op.Oncol.4156)。癌基因neu是按化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)胚細(xì)胞瘤(neuroglioblastoma)命名，從神經(jīng)膠質(zhì)胚細(xì)胞瘤首次分離癌基因neu。此活化的neu形式有一個點突變，導(dǎo)致“T”代替“A”，結(jié)果谷氨酸殘基取代p185neu644位的纈氨酸殘基(Val644Glu)(Bargmann等人，Cell 45649)。
人類neu同源基因ErbB-2也已經(jīng)被分離鑒定，并證明大鼠HER2/neu受體和人類ErbB2都與EGFR有顯著同源性(Coussens等人，1985，Science2301132；Yamamoto等人，1986，Nature 319230)。雖然大鼠序列中遺傳突變導(dǎo)致組成型受體通過二聚化激活，但是在ErbB-2陽性人腫瘤中，觀測到癌基因的異常表達(dá)(Di Marco等人，1990，Mol.Cell.Biol.103247；Klapper等人，2000，Adv Cancer Res，7725)，即使在極少數(shù)情況中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了激活點突變和異常剪接機制(Kwong等人，1998，Mol Carcinog 2362；Xie等人，2000，J Natl Cancer Inst，92412)?？傮w效應(yīng)是相似的基因擴增和轉(zhuǎn)錄水平的增加決定了過量的p185neu膜受體，結(jié)果活性二聚體增加，其在細(xì)胞內(nèi)以配體獨立的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)生長信號。最近報導(dǎo)的關(guān)于人類和大鼠p185neu細(xì)胞外區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示此蛋白的特征在于具有剛性構(gòu)象，其允許與其它的ErbB受體相互作用，不直接結(jié)合任何配體，并引發(fā)增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Cho HS等人，2003，Nature 421756)。
正常情況下，人p185neu與器官發(fā)生和上皮生長有關(guān)；在胎盤形成和胎兒發(fā)育期間以高水平表達(dá)，而它在成人組織中則以非常低的水平存在(Press等人，1990，Oncogene 5953)。
一些研究證明，人類p185neu過量表達(dá)與腫瘤性轉(zhuǎn)化過程和腫瘤侵占的水平有關(guān)。已經(jīng)描述了p185neu在肺(Kern等人，1986，CancerRes.505184)、結(jié)腸(Cohen等人，1989，Oncogene 481)、卵巢(Slamon等人，1989，Science 244707)、腺癌以及在多種人乳腺癌(Slamon等人，1989，Science 244707；Jardines等人，1993，Pathobiology 61268)中的過量表達(dá)。
使得p185neu成為質(zhì)粒疫苗接種的最佳靶標(biāo)的基本特性是a)它直接與細(xì)胞生長和癌發(fā)生有關(guān)，因此克隆變體由于腫瘤遺傳不穩(wěn)定性而失去了此抗原的表達(dá)，也失去了它們的致瘤力；b)它表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上，這使它即使是在失去了主要組織相容性體系的表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中也可以被抗體識別(Lollini P.和Forni G.2003，Trends Immunol，2462)。
對活化的大鼠癌基因Her-2/neu轉(zhuǎn)基因的小鼠(其自發(fā)產(chǎn)生p185neu陽性乳腺腫瘤)以及使用p185neu陽性可移植腫瘤系對鼠類模型進(jìn)行的研究證明了預(yù)防和治療癌變前損傷的可能性。具體關(guān)于大鼠活化的Her-2/neu基因轉(zhuǎn)基因小鼠中乳腺腫瘤的預(yù)防，我們證明了與編碼全長大鼠p185neu的質(zhì)粒或者只編碼胞外結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒(分泌抗原)相比，編碼p185neu胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒可以更有效地誘導(dǎo)體內(nèi)保護(Amici A.等人，2000，Gene Ther.，7703；Rovero S.等，2000，J.of Immunol.，1655133)。Chen等人報道了相似的結(jié)果(1998，Cancer Res 581965)。其他作者證明不管是編碼未改變的p185neu的質(zhì)粒還是編碼突變p185neu以除去它的酪氨酸激酶活性的質(zhì)粒，在預(yù)防p185neu陽性細(xì)胞接種物引起的腫瘤發(fā)生中都是有效的(Wei WZ等人，1999，Int J.Cancer 81748)。而且，缺乏負(fù)責(zé)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工的信號(前導(dǎo)區(qū)，其決定p185neu抗原在細(xì)胞質(zhì)中的定位)的質(zhì)粒經(jīng)證明同樣有效。由不同質(zhì)粒誘導(dǎo)的保護作用主要對于p185neu的膜表達(dá)的情況由體液免疫應(yīng)答介導(dǎo)，對于細(xì)胞質(zhì)定位的情況由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答介導(dǎo)(Pilon SA等人2001，J.of Immunol.1673367)。然而，用誘導(dǎo)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中p185neu都過表達(dá)的質(zhì)粒聯(lián)合疫苗接種在對抗腫瘤生長的保護中更加有效(Piechocki MP等人，2001，J.Immunol.1673367)。
因此，不同免疫應(yīng)答機制之間的平衡可能尤其重要(Reilly等人，2001，Cancer Res.61880)。而且，觀察到用編碼大鼠p185neu的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒接種，當(dāng)細(xì)胞接種物過表達(dá)p185neu時，能夠消滅直徑為2mm的腫瘤塊，這是免疫系統(tǒng)的許多不同的效應(yīng)機制(T輔助細(xì)胞和T殺傷細(xì)胞、抗體、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、Fc受體、γ干擾素和穿孔蛋白)實現(xiàn)的，所述效應(yīng)機制協(xié)力排斥腫瘤(Curcio C.等人，2003，J.Clin.Invest.1111161)。
發(fā)明描述已經(jīng)將編碼人或人/大鼠嵌合p185蛋白質(zhì)的多種構(gòu)建體插入質(zhì)粒載體并用于旨在防止腫瘤發(fā)展的免疫實驗中。為了質(zhì)粒構(gòu)建，由ErbB2癌基因序列制備出人p185neu蛋白質(zhì)的片段，其含有跨膜結(jié)構(gòu)域和長度減少的胞外結(jié)構(gòu)域的部分，或者其部分用大鼠Her-2/neu cDNA同源序列代替以構(gòu)建嵌合質(zhì)粒。
在接種過表達(dá)人p185neu的腫瘤細(xì)胞的小鼠中通過疫苗接種實驗評估所得質(zhì)粒。含有p185neu的截短形式的質(zhì)粒誘導(dǎo)殺傷性T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)性，而嵌合質(zhì)粒誘導(dǎo)針對人和大鼠p185neu的抗體應(yīng)答。
以體內(nèi)實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，挑選能夠誘導(dǎo)細(xì)胞型和體液型強免疫反應(yīng)的含p185neu序列的質(zhì)粒。這些本發(fā)明的目的質(zhì)粒含有編碼p185neu片段的序列，此序列選自SEQ ID NO.1-14(人和大鼠p185neu參考序列可以分別以Gene Bank檢索號M11730和X03362得到)。
根據(jù)本發(fā)明，p185neu編碼序列可以插入適合人施用的任意質(zhì)粒。除了編碼序列，質(zhì)粒還可以含有用于轉(zhuǎn)錄控制的功能元件，特別是置于編碼序列上游的啟動子，優(yōu)選CMV啟動子、起始和終止轉(zhuǎn)錄元件、選擇標(biāo)記，如氨芐青霉素或卡那霉素抗性基因；CpG基序、聚腺苷酸化位點或轉(zhuǎn)錄激活因子。轉(zhuǎn)錄控制元件應(yīng)與載體在人體中的使用相容。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的質(zhì)粒含有至少4個CpG基序，優(yōu)選地，至少8個CpG基序，最多80個CpG基序。細(xì)菌來源的CpG基序(ATAATCGACGTTCAA)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-2，其又誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞分泌IFN-γ，從而激活T輔助淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(Chu R.S.等人，1997，J.Exp.Med.，1861623)。因此，質(zhì)粒序列中CpG基序的插入增強免疫應(yīng)答。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，它含有一種或多種不同的如上定義的質(zhì)粒及與之聯(lián)合使用的可藥用載體(vehicle)和賦形劑。此藥物組合物為適合腸胃外施用的形式，優(yōu)選地，為可注射溶液劑的形式，方便地用于DNA疫苗接種。DNA疫苗接種的原理和方法是技術(shù)人員已知的并且公開在例如，Liu MA 2003，J Int Med 253402。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了組合制劑，其含有至少兩種，優(yōu)選地，至少四種，更優(yōu)選地，至少八種不同的質(zhì)粒，用于同時、順序或者單獨施用于個體或患者。
根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒、組合物和制劑用于預(yù)防性或治療性治療處于患p15neu-陽性腫瘤危險中的個體，或者患有p15neu-陽性腫瘤的原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤或復(fù)發(fā)的患者。預(yù)防可以是主要的，此時腫瘤還沒有表現(xiàn)出來，預(yù)防可以是次要的，此時腫瘤處在初始階段作為癌前病變，預(yù)防可以是第三位的，此時腫瘤處于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移過程。能從用本發(fā)明的質(zhì)粒治療中受益的腫瘤是那些上皮來源腫瘤的，特別是肺、卵巢和乳腺腺癌，更一般地，表達(dá)p18neu蛋白質(zhì)的腫瘤。
發(fā)明詳述pCMV3.1質(zhì)粒骨架的構(gòu)建為了構(gòu)建編碼人p185neu片段的質(zhì)粒和嵌合質(zhì)粒，使用pCMV3.1質(zhì)粒骨架。將得自人類原癌基因ErbB2 cDNA的片段和得自大鼠原癌基因Her-2/neu cDNA的片段插入由限制酶DraIII(nt1531)和BsmI(nt189)除去1658bp片段的pCMV3.1(Invitrogen，米蘭，意大利)中，所述1658bp片段含有復(fù)制起點f1、復(fù)制起點和早期SV40啟動子、編碼新霉素抗性的基因和SV40多腺苷酸化信號。與天然pCMV3.1相比，所得改造后的質(zhì)粒(pCMV3.1)呈現(xiàn)出某些優(yōu)勢。實際上，質(zhì)粒大小減小到3900bp和無關(guān)序列的除去有助于提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染功效。
質(zhì)粒pCMV3.1erbB2的構(gòu)建從質(zhì)粒pSVerB2獲得的人ErbB2 cDNA已經(jīng)插入pCMV3.1的多克隆位點中限制位點HindIII和XbaI中。此質(zhì)粒用于構(gòu)建表達(dá)截短的p185neu的質(zhì)粒和嵌合質(zhì)粒。
含有序列4XCpG的質(zhì)粒pCMV3.1hECD-TM-4CpG和pCMV3.1hECD-TM-4noCpG的構(gòu)建從質(zhì)粒pCMV3.1-erbB除去編碼細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列后，制備編碼原癌基因ErbB2胞外區(qū)和跨膜區(qū)的兩種質(zhì)粒。此過程包括首先進(jìn)行限制性分析，用以鑒定存在于ErbB2 cDNA核苷酸序列中的獨特位點。鑒定了酶AccIII(nt2195)所識別的一個獨特位點，其位于跨膜結(jié)構(gòu)域末端下游大約20bp處。
用以獨特限制性酶切位點存在的酶AccIII和酶XbaI除去細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。為了將識別為翻譯終止信號的核苷酸三聯(lián)體TAA重新插入ErbB2ECD-TM DNA的3’末端，我們使用兩條合成序列，這兩條序列由兩條有義寡核苷酸(寡核苷酸#1、#3)和兩條反義寡核苷酸(寡核苷酸#2、#4)組成，所述寡核苷酸它們的末端有限制性位點AccIII和XbaI。在這些合成的序列中，還存在著四個重復(fù)序列CpG和noCpG，后者用做陰性對照。將這兩種新質(zhì)粒命名為pCMV3.1hECD-TM-4CpG和pCMV3.1hECD-TM-4noCpG。
含在序列8XCpG的質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD-TM-8noCpG的構(gòu)建為了增加其他的無特異性免疫刺激，我們構(gòu)建了含有4個免疫刺激性CpG序列的新的質(zhì)粒骨架，命名為pCMV3.1H/N-4CpG。為達(dá)到這個目的，我們改進(jìn)了pCMV3.1以便除去酶PmeI的兩個限制性位點中的一個，并通過由兩條有義(寡核苷酸#5)和反義(寡核苷酸#6)寡核苷酸組成的合成序列顛倒多克隆位點上存在的HindIII和NneI限制性位點。在此命名為pCMV3.1H/N的新質(zhì)粒中，插入了兩條合成的序列，此兩序列由兩條有義(寡核苷酸#7，#9)和反義核苷酸(寡核苷酸#8，#10)組成，并在唯一限制性位點XbaI和PmeI中含有CpG和noCpG序列的四個重復(fù)，從而獲得了pCMV3.1H/N-4CpG和4noCpG質(zhì)粒。此后，將DNA片段hECD-TM-4CpG和hECD-TM-4noCpG分別插入pCMV3.1H/N-4CpG和pCMV3.1H/N-4noCpG中，由此得到兩種新的質(zhì)粒，命名為pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD-TM-8noCpG。
含有人p185neu的第二個半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG的構(gòu)建人p185neu胞外結(jié)構(gòu)域的特征是兩個富含半胱氨酸的區(qū)域，稱作第一和第二個半胱氨酸亞結(jié)構(gòu)域(1stcys和2ndcys)。不像大鼠cDNA序列，其只含有胞外結(jié)構(gòu)域中的一個位點BstEII(nt1250)，該胞外結(jié)構(gòu)域位于分隔1stcys和2ndcys的核苷酸區(qū)域中，ErbB2的胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA序列有兩個BstEII限制性位點除了與大鼠相同位置的位點(nt1372)外，另一個BstEII位點(nt963)存在于編碼胞外結(jié)構(gòu)域的1stcys部分中。用HindIII和BstEII消化質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG，得到由來自胞外結(jié)構(gòu)域的2ndcys、跨膜結(jié)構(gòu)域、序列8CpG和質(zhì)粒pCMV3.1H/N組成的DNA片段。然后使用有義寡核苷酸和反義寡核苷酸，通過酶促DNA擴增(PCR反應(yīng))將大鼠p185neu經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的信號插入，所述有義寡核苷酸由識別T7RNA聚合酶的引物T7(寡核苷酸#11)(存在于pCMV3.1H/N多克隆位點的開始處)組成，所述反義寡核苷酸(寡核苷酸#12)在其末端具有BstEII位點。經(jīng)純化后，擴增的片段用限制酶HindIII和BstEII酶促消化，隨后克隆，得到pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG(圖.1)。此質(zhì)粒用于疫苗接種實驗，將它與pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG比較。此后，制備了編碼融合蛋白質(zhì)的嵌合cDNA，此融合蛋白質(zhì)是人序列的2ndcys和跨膜結(jié)構(gòu)域(nt1372-nt2204)與大鼠序列的1stcys(nt1-nt1250)之間的融合蛋白質(zhì)。通過分別來自大鼠和人cDNA的部分的融合重構(gòu)完整蛋白質(zhì)允許增強免疫應(yīng)答。
含有大鼠p185neu的第一半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和人第二個半胱氨酸結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域(nt1-nt1250)的序列的嵌合質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG的構(gòu)建不像大鼠cDNA序列，其只含有胞外結(jié)構(gòu)域中的一個BstEII位點(nt1250)，該胞外結(jié)構(gòu)域位于分隔富含半胱氨酸的第一個和第二個區(qū)的核苷酸區(qū)域中，Erb2的胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA序列有兩個BstEII限制性位點一個在1372(nt)位，和大鼠序列中位置相同；另一個在963(nt)位上，即位于編碼胞外結(jié)構(gòu)域的1stcys的序列部分中。BstEII位點存在于大鼠cDNA結(jié)構(gòu)域(1250nt)和人類cDNA(1372nt)中同一個位置上使得可以構(gòu)建能夠編碼大鼠1stcys與人2ndcys之間的融合產(chǎn)物。事實上，用限制酶HindIII和BstEII消化pCMV3.1H/N-h2°cysTM-8CpG使得可以將編碼大鼠p185neu分泌信號的DNA片段用編碼大鼠1stcys的核苷酸序列替換，所述編碼大鼠1stcys的核苷酸序列用同樣的酶消化pCMV3.1rECD-TM-4CpG獲得的。質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG(圖2)的產(chǎn)物由大鼠p18neu的422個氨基酸的部分和人p185neu的274個氨基酸的部分組成。此新質(zhì)粒pCMV.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG已用于免疫接種實驗，實驗中用pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG做為比較項。令人驚奇地，編碼嵌合蛋白的質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)針對表達(dá)人p185neu的腫瘤的完全保護作用(表)。此保護作用與pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG誘導(dǎo)的保護作用相似。而且，對用兩種質(zhì)粒接種的小鼠血清的分析證明對人p185neu具有相似的抗體效價。
能夠編碼人p185neu胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的減短片段的質(zhì)粒構(gòu)建編碼人p185neu胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的減短片段的7種質(zhì)粒，即pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG(-70個氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG(-150個氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG(-230個氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG(-310個氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG(-390個氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG(-470個氨基酸)和pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG(-550個氨基酸)。
這些片段中第一個片段編碼的片段縮短70個氨基酸(缺失360bp)。所有其它的則逐個縮短80個氨基酸(缺失240bp)。
這些片段已經(jīng)經(jīng)DNA酶促擴增得到，該擴增使用末端具有NheI限制性位點的七條不同的有義寡核苷酸(寡核苷酸#13-#19)，和能夠識別存在于pCMV3.1的3’末端的多接頭處名為“pCMV3.1/BGH反向引發(fā)位點”(830-850nt)的反義寡核苷酸(寡核苷酸#20)。用限制性酶NheI和PmeI酶促消化后，擴增產(chǎn)物克隆入先前獲得的pCMV3.1H/N-neu前導(dǎo)區(qū)，將大鼠p185neu的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌信號插入限制性位點中。大鼠p185neu分泌信號的DNA片段是用引物T7(寡核苷酸#11)作為有義核苷酸，和在末端具有NheI位點的反義核苷酸(寡核苷酸#21)經(jīng)酶促DNA擴增得到的。擴增得到的片段經(jīng)過純化和用HindIII和NheI限制性消化后，被克隆到用同樣的酶消化的質(zhì)粒pCMV3.1H/N中，得到pCMV3.1H/N-neu前導(dǎo)區(qū)。由于存在大鼠p185neu的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌信號，所以預(yù)計人p185neu不同截短形式的膜表達(dá)。編碼截短形式的質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG(圖3)、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG(圖4)、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG(圖5)、pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG(圖6)和對照質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG都保護100％接種的小鼠對抗表達(dá)人p185neu的腫瘤細(xì)胞的致死性接種物(表)。質(zhì)粒pCMV3.1H/N-hECD5-TM-8CpG(圖7)保護60％動物，而質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG(圖8、9)對于表達(dá)人類P185neu的腫瘤細(xì)胞的致死性接種物沒有保護作用(表)。不同的質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物沒有通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌。糖基化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工所必需的共有序列的缺乏，或-NH2末端氨基酸的缺失導(dǎo)致的構(gòu)象改變可以解釋膜中蛋白質(zhì)產(chǎn)物的缺乏。因此，為了進(jìn)一步驗證不同截短形式的人p185neu胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域是否被正確表達(dá)，產(chǎn)生了編碼以-NH2末端表位myc為特征的融合蛋白的新質(zhì)粒。這些重組蛋白質(zhì)被抗myc單克隆抗體所識別，因此，就可能用共焦顯微術(shù)分析它們的表達(dá)和定位。
首先，已經(jīng)產(chǎn)生了編碼大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌信號(neu前導(dǎo)區(qū))和myc表位的新質(zhì)粒。使用合成序列實施克隆，此序列由兩端都具有NheI位點的有義(寡核苷酸#22)和反義(寡核苷酸#23)寡核苷酸組成。突變5’位中的NheI位點，從而一旦正確連接，此位點不被所述酶識別。我們因此得到了pCMV3.1H/Nneuleader-myc表位。用此質(zhì)粒，在限制性位點NheI和PmeI中克隆了編碼人p185neu截短形式的序列。隨后用lipofectamine2000(Invitrogen，米蘭，意大利)將質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染3T3 NIH成纖維細(xì)胞。48小時后，使用FITC綴合的抗myc單克隆抗體(Sigma-Aldrich Srl，米蘭，意大利)，用共焦顯微術(shù)分析經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。由此，證明了所有質(zhì)粒編碼的截短形式均定位在細(xì)胞質(zhì)中。3T3 NIH成纖維細(xì)胞用質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG平行轉(zhuǎn)染，使用c-erbB2/c-neu Ab-3單克隆抗體(Oncogene，波士頓，美國)作為一級抗體，和FITC綴合的抗小鼠二級抗體(PharMigen，San Diego，CA)，用共焦顯微術(shù)進(jìn)行分析。觀察到人ECD-TM表達(dá)在膜上。用前述質(zhì)粒的前四種質(zhì)粒(pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG)所得到的結(jié)果證明細(xì)胞應(yīng)答足夠用于抗腫瘤防御。然而，已知細(xì)胞和體液應(yīng)答的同時活化對于更有效的治療是必要的(Rielly等人，2001，Cancer Res61880)。正如前面段落已經(jīng)陳述的那樣，質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG編碼的嵌合蛋白質(zhì)可以100％的保護接種過的動物，并能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)強的體液應(yīng)答。
嵌合質(zhì)粒能夠編碼五種不同的人-大鼠嵌合p185neu為構(gòu)建編碼嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，我們選用了質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG。這四種質(zhì)?？梢?00％保護被接種的小鼠對抗表達(dá)人p185neu的腫瘤細(xì)胞的致死接種物。質(zhì)粒pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG也被選用，即使它僅保護60％的經(jīng)接種小鼠，因為所編碼的蛋白質(zhì)與質(zhì)粒pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG編碼的蛋白質(zhì)相比只有17個氨基酸不同，后者保護60％的經(jīng)接種小鼠。我們可以假設(shè)，這17個氨基酸的肽序列對應(yīng)于誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的重要表位。
DNA酶促擴增獲得了編碼大鼠p185neu部分的DNA片段。為擴增這些cDNA片段，使用都具有相同定位，即T7引物(寡核苷酸#11)的定位的6種寡核苷酸，而設(shè)計了識別適當(dāng)位置的大鼠cDNA并且在它們的末端具有NheI限制性位點的5種反義寡核苷酸(寡核苷酸#24-#28)。擴增得到的片段經(jīng)純化和限制酶HindIII和NheI消化后，插入到經(jīng)同樣限制酶消化的相應(yīng)質(zhì)粒(pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG)中。通過這種方法，我們得到了五種新質(zhì)粒，其可以編碼689個氨基酸的嵌合蛋白質(zhì)，其中2個(Val-Ser)屬于用來連接大鼠和人DNA的限制性位點NheI。這兩個氨基酸的存在使得人和大鼠部分都是異種溶解的。
嵌合蛋白質(zhì)不同于人p185neu縮短部分和大鼠p18neu增加部分。質(zhì)粒pCMV3.1H/Nr73-hECD1-TM-8CpG(

圖10)編碼大鼠p185neu胞外結(jié)構(gòu)域的73個氨基酸和人p185neu的614個氨基酸。質(zhì)粒pCMV3.1H/Nr73-hECD2-TM-8CpG(圖11)編碼大鼠p185neu胞外結(jié)構(gòu)域的153個氨基酸和人p185neu的534個氨基酸。質(zhì)粒pCMV3.1H/Nr233-hECD3-TM-8CpG(圖12)編碼大鼠p185neu胞外結(jié)構(gòu)域的233個氨基酸和人p185neu的454個氨基酸。質(zhì)粒pCMV3.1H/Nr313-hECD4-TM-8CpG(圖13)編碼大鼠p18neu胞外結(jié)構(gòu)域的313個氨基酸和人p185neu的374個氨基酸。質(zhì)粒pCMV3.1H/Nr393-hECD5-TM-8CpG(圖14)編碼大鼠p185neu胞外結(jié)構(gòu)域的393個氨基酸和人類p185neu的294個氨基酸。用這五種新的質(zhì)粒和作為陽性對照的質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG免疫小鼠得到了這些質(zhì)粒編碼的人/大鼠嵌合p185neu的膜表達(dá)的間接證據(jù)。所有接種的小鼠血清都含有抗人p185neu的特異抗體。而且，用編碼五種不同嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒接種的動物也受到保護免于表達(dá)人p185neu的腫瘤細(xì)胞致死性接種物的影響。
實施例實施例1-質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG的構(gòu)建為構(gòu)建嵌合質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG，我們從質(zhì)粒pCMV-ECD-TM開始，該質(zhì)粒表達(dá)大鼠p185neu胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域(Amici等人，2000，Gen Ther.，7703)。質(zhì)粒pCMV-ECD-TM用限制酶HindIII和XbaI(BioLabs，Beverly，MA)消化以從質(zhì)粒骨架分離插入片段。
用酶HindIII的限制性消化質(zhì)粒DNA(1μg/μl) 10μl限制性緩沖液10X(NEB2) 10μlHindIII(10U/μl)5μlH2O75μl100μl終體積混合物在37℃孵育4個小時，消化產(chǎn)物由1％瓊脂糖凝膠電泳控制，用分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和未消化的質(zhì)粒作為對照。
一旦證實了質(zhì)粒線性化，即加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和兩倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA。
將樣品置于冰上20分鐘，用小型離心機以14,000轉(zhuǎn)/分鐘離心12分鐘。沉淀物用1mL 70％冷乙醇洗滌三次，真空干燥5分鐘后重懸浮于84μl水中，用限制酶XbaI酶促消化。
酶XbaI的限制性消化重懸浮于水中的DNA(10μg)84μl限制性緩沖液10X(NEB2) 10μlBSA 100X(100mg/ml) 1μlXbaI(10U/ml)5μl100μl混合物在37℃孵育4小時，消化產(chǎn)物如上述沉淀和干燥。將DNA重懸浮于30μl水中。
相應(yīng)于質(zhì)粒骨架(4400bp的pCMV)和插入片段(2100bp的ECD-TM)相應(yīng)的兩種DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離。
將與插入片段相應(yīng)的帶除去，用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen，意大利)從凝膠洗脫DNA。
平行的，將其中DNA片段對應(yīng)于大鼠p185ECD-TM的新質(zhì)粒骨架(pCMV3.1H/N-4CpG)用相同的限制性酶消化并在瓊脂糖凝膠上洗脫。
與大鼠ECD-TM相應(yīng)的DNA片段和線性化質(zhì)粒pCMV3.1H/N-4CpG用于通過連接反應(yīng)獲得pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG。
連接反應(yīng)DNA插入片段(rECD-TM)(50ng/μl) 2μl線性化質(zhì)粒DNA(pCMV3.1H/N4CpG)(50ng/μl)1μlT4DNA連接酶的反應(yīng)緩沖液10X 1μlT4DNA連接酶1μlH2O 5μl10μl連接反應(yīng)物在16℃孵育4小時。
連接產(chǎn)物然后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)菌株DH5α。細(xì)菌細(xì)胞用CaCl2技術(shù)制備成感受態(tài)。
菌株DH5α的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞 100μl連接產(chǎn)物 5μl為了使質(zhì)粒DNA穿透感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化體系放置冰上40分鐘，然后將其進(jìn)行熱休克(42℃1.5分鐘，之后放置冰上2分鐘)。
加入1ml LB生長培養(yǎng)基后，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌細(xì)胞在37℃孵育1小時以恢復(fù)其生理狀態(tài)。
細(xì)胞懸浮液以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，沉淀物重懸浮于100μlLB中。
細(xì)胞接種在含有選擇性固體培養(yǎng)基(含有瓊脂的LB+100μg/ml氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿上，并在37℃生長一夜。氨芐青霉素允許含有質(zhì)粒pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG的細(xì)胞生長，所述質(zhì)粒賦予了氨芐青霉素抗性。
所得克隆用堿裂解分析以挑選出含有重組質(zhì)粒pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG的那些克隆。
為了獲得嵌合質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG，質(zhì)粒pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG用限制酶BstEII和XbaI消化以除去大鼠p185neu的第二個半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。同時，質(zhì)粒pCMV3.1hECD-TM-4CpG用相同的酶消化以分離相應(yīng)于人基因的第二個半胱氨酸亞結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的DNA片段。
用BstEII消化質(zhì)粒DNA(1μg/μl) 10μl限制性緩沖液10X(NEB3) 10μlBstEII(10U/μl) 5μlH2O75μl100μl終體積混合物在60℃孵育4小時。
用XbaI限制性消化，以前已經(jīng)描述了用于用于克隆的片段的回、連接反應(yīng)和感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
所得嵌合質(zhì)粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG已經(jīng)用自動ABIPRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosysterm)測序，以驗證相應(yīng)于人基因的第二個半胱氨酸亞結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的片段的正確插入。
實施例2-體內(nèi)試驗動物約7周齡的Balb/cAnCr(H-2d)雌性小鼠用于所有實驗中。
這些動物由Charles River Laboratories(Calco，MI，意大利)提供，生長在無菌條件中并按照歐洲共同體(European Community)的準(zhǔn)則。
肌內(nèi)施用后體內(nèi)電穿孔為避免脛骨肌肉不必要的收縮，每只小鼠都用腹膜內(nèi)接種300μl的阿佛丁(avertine)麻醉，阿佛丁由將0.58g三溴乙醇(Sigma-Aldrich)和310μl叔戊醇(Aldrich)溶于39.5ml去離子水中制備。隨后，所有小鼠在脛骨肌相應(yīng)處剃毛以便接種。
用含有50μg DNA的40μl溶液在相應(yīng)于兩個脛前肌處接種動物。
在臨用前制備含有DNA的混合液，按照F.Pericle博士(Valentis，Inc.The woodlands，德克薩斯，美國)的指示配制。此溶液含有1.25mg/ml質(zhì)粒DNA，6mg/ml聚-L-谷氨酸鈉鹽(Sigma-Aldrich，S.r.l.，Milano，意大利)，150mM氯化鈉(Fluka，BioChemika，Buchs，瑞典)和不含內(nèi)毒素的蒸餾水(Nucleare Free Water，Promega公司)，最終體積為1mL。
在接種后約5分鐘，所處理的區(qū)域用電穿孔儀Electro SquarePorator(T820，BTX，San Diego，CA，USA)進(jìn)行電穿孔，應(yīng)用兩次電脈沖，強度為375V/cm2，每次持續(xù)25ms。通過使用彼此相隔3mm放置于每個爪子邊上的兩個方形鋼電極應(yīng)用經(jīng)皮電脈沖。在接種腫瘤細(xì)胞前21天和7天，對每只動物用電穿孔進(jìn)行2次基因免疫。
腫瘤細(xì)胞的接種用含有2×105個D2F2/E2細(xì)胞的懸浮液接種小鼠。這些細(xì)胞來源于在BALB/C小鼠的增生泡狀結(jié)中自發(fā)產(chǎn)生的乳腺腫瘤，并表達(dá)高水平的人p185。
腫瘤生長的體內(nèi)評估每周通過觸診評估腫瘤生長，用卡尺沿著兩個垂直的直徑測量腫瘤的尺寸。測定大于3毫米的瘤塊即認(rèn)為是腫瘤。
腫瘤生長從腫瘤接種后到100天，或者直到腫瘤生長到直徑大于10mm，然后處死動物。
表小鼠雌性BALB/c腫瘤表達(dá)人p185neu的D2F2-E2
由這些方法測定的IC50值的例子概括在表1中。
表1.
CETP抑制活性(SPA試驗)
或者，在該試驗中可使用其他的CETP源來介導(dǎo)放射性標(biāo)記的膽固醇酯的轉(zhuǎn)移?？墒褂迷从谌搜獫{的內(nèi)源性CETP、源于表達(dá)人類CETP的小鼠的CETP、源于倉鼠的內(nèi)源性CETP和源于其他哺乳動物的CETP作為該試驗中的CETP源。
或者可以使用其它源作為緩沖液。除了在該試驗中已經(jīng)使用的HEPES-NaCI基緩沖液之外，可以使用人血漿、小鼠血漿或Tris-緩沖液(其可富含白蛋白)作為緩沖液，在緩沖液中可以發(fā)生放射性標(biāo)記的膽固醇酯從HDL至LDL的轉(zhuǎn)移。
或者，在該試驗中可使用其他放射性和/或受體源來跟蹤CETP活性。
或者，在該試驗中可以使用放射性標(biāo)記的LDL。本領(lǐng)域技術(shù)人員用最低限度的實驗就能夠?qū)嵤┍疚墓_的不同的試驗方法。
體內(nèi)CETP活性的試驗
5’CTAGATTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTACTT3’#3.AccIII-TAA-4noCpG-erbB2有義71nt5’CCGGAAGTAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAT3’#4.XbaI-TAA-4noCpG-erbB2反義71nt5’CTAGATTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTACTT3’#5.HindIII-NheI有義27nt5’CTAGGAAGCTTGTTTAACTTGCTAGCT3’#6.HindIII-NheI反義27nt5’AGCTAGCTAGCAAGTTAAACAAGCTTC3’#7.XbaI-4CpG-neu有義68nt5’CTAGATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAGTTT3’#8.PmeI-CpG-neu反義64nt5’AAACTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTAT3’#9.XbaI-4noCpG-neu有義68nt5’CTAGATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAGTTT3’#10.PmeI-4noCpG-neu反義64nt5’AAACTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTAT3’#11.T7引物5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’#12.BstEII-neuleader反義32nt5’GGCCGGTTACCCGCGATTCCGGGGGGCAGGAG3’
#13.hECD1-TM-有義-NheI 35nt5’CCGGCTAGCTAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCC3’#14.hECD2-TM-有義-NheI 35nt5’CCGGCTAGCTAGCGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGA3’#15.hECD3-TM-有義-NheI 35nt5’CCGGCTAGCTAGCCTGCCCACTGACTGCTGCCATG3’#16.hECD4-TM-有義-NheI 35nt5’CCGGCTAGCTAGCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGC3’#17.hECD5-TM-有義-NheI 35nt5’CCGGCTAGCTAGCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCC3’#18.hECD6-TM-有義-NheI 35nt5’CCGGCTAGCTAGCAACACCCACCTCTGCTTCGTGC3’#19.hECD7-TM-有義-NheI 35ntCCGGCTAGCTAGCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCA3’#20.pcDNA3.1/BGH反向引物20nt5’TAGAAGGCACAGTCGAGGCT3’#21.NheI-neuleader-反義43nt5’CCGGCTAGCTAGCCGCGATTCCGGGGGGCAGGAGGGCGAGGAG3’#22.His-myc-有義-noNheI 69nt5’CTAGGCATCATCATCATCATCATAATGGTCATACCGGTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGG3’#23.His-myc-反義-NheI 69nt5’CTAGCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCACCGGTATGACCATTATGATGATGATGATGATGC3’#24.NheI-73neu反義35nt5’CCGGCTAGCTAGCGCTGGCATTGGCAGGCACGTAG3’#25.NheI-153neu反義35nt
5’CCGGCTAGCTAGCCAGGATCTCTGTGAGACTTCGA3’#26.NheI-233neu反義35nt5’CCGGCTAGCTAGCGCCCTTGCACCGGGCACAACCA3’#27.NheI-313neu反義35nt5’CCGGCTAGCTAGCTCCCACTTCCGTAGACAGGTAG3’#28.NheI-393neu反義35nt5’CCGGCTAGCTAGCAATGCCGGAGGAGGGGTCCCCA3’
序列表<110>因德納有限公司<120>編碼p185neu的DNA及其治療用途<130>7118M<160>42<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>922<212>DNA<213>人/大鼠<400>1ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct60cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg ttacctatac atctcagcat ggccggacag120cctgcctgac ctcagcgtct tccagaacct gcaagtaatc cggggacgaa ttctgcacaa180tggcgcctac tcgctgaccc tgcaagggct gggcatcagc tggctggggc tgcgctcact240gagggaactg ggcagtggac tggccctcat ccaccataac acccacctct gcttcgtgca300cacggtgccc tgggaccagc tctttcggaa cccgcaccaa gctctgctcc acactgccaa360ccggccagag gacgagtgtg tgggcgaggg cctggcctgc caccagctgt gcgcccgagg420gcactgctgg ggtccagggc ccacccagtg tgtcaactgc agccagttcc ttcggggcca480
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<210>14<211>2086<212>DNA<213>人/大鼠<400>14ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct60cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa120gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg180ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcctctc240attcctgcag gacatccagg aagttcaggg ttacatgctc atcgctcaca accaggtgaa300gcgcgtccca ctgcaaaggc tgcgcatcgt gagagggacc cagctctttg aggacaagta360tgccctggct gtgctagaca accgagatcc tcaggacaat gtcgccgcct ccaccccagg420cagaacccca gaggggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacagaga tcctgaaggg480aggagttttg atccgtggga accctcagct ctgctaccag gacatggttt tgtggaagga540cgtcttccgc aagaataacc aactggctcc tgtcgatata gacaccaatc gttcccgggc600ctgtccacct tgtgcccccg cctgcaaaga caatcactgt tggggtgaga gtccggaaga660ctgtcagatc ttgactggca ccatctgtac cagtggttgt gcccggtgca agggccggct720gcccactgac tgctgccatg agcagtgtgc cgcaggctgc acgggcccca agcattctga780ctgcctggcc tgcctccact tcaatcatag tggtatctgt gagctgcact gcccagccct840cgtcacctac aacacagaca cctttgagtc catgcacaac cctgagggtc gctacacctt900tggtgccagc tgcgtgacca cctgccccta caactacctg tctacggaag tgggatcctg960
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1.含有編碼p185neu片段的序列的DNA轉(zhuǎn)移載體，其中所述序列選自SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA轉(zhuǎn)移載體，其是質(zhì)粒。
3.權(quán)利要求2的質(zhì)粒，其還含有轉(zhuǎn)錄啟動子。
4.權(quán)利要求3的質(zhì)粒，其中所述啟動子是CMV。
5.權(quán)利要求2的質(zhì)粒，其還含有4個CpG基序。
6.權(quán)利要求5的質(zhì)粒，其還含有8個CpG基序。
7.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的DNA轉(zhuǎn)移載體與可藥用載體和賦形劑的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其適于腸胃外施用。
9.權(quán)利要求8的組合物，其是可注射溶液劑的形式。
10.含有根據(jù)權(quán)利要求1-6的至少兩種不同質(zhì)粒的組合藥物制劑，其用于同時、順序或者單獨的治療用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合制劑，其是適于DNA接種的形式。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6的質(zhì)粒用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防性或治療性治療處于患p185neu陽性腫瘤危險中的個體，或者患有表達(dá)p185neu的腫瘤的原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，用于制備DNA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有編碼p18文檔編號C07K14/82GK1863547SQ200480029315
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者A·阿米其, F·卡瓦洛, G·福爾尼, C·馬爾其尼 申請人:因德納有限公司