專利名稱:一種表皮生長因子受體二聚化抗原肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及治療性多肽疫苗和抗體藥物制備領(lǐng)域,具體涉及一種表皮生長因子受體二聚化抗原肽及其制備方法和抗體。
背景技術(shù):
靶向性藥物研發(fā)在改善惡性腫瘤藥物療效、降低毒副反應(yīng)方面具有重大意義。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFr)家族(包括 EGFr、HER2/ ErbB-2、HER3/ErbB-3和HER4/ErbB_4等)在胚胎和正常組織的生長發(fā)育中起重要作用,但它們在一系列上皮癌,如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá),并導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的快速增殖、轉(zhuǎn)移、新血管形成、耐藥和抗凋亡,目前已成為最為熱門的腫瘤藥物靶分子之一。EGFr類受體為跨膜糖蛋白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)等三個區(qū)域組成,完整的受體分子胞外區(qū)含配體結(jié)合區(qū),胞內(nèi)區(qū)含有酪氨酸激酶活性區(qū),二者是抗腫瘤藥物的主要靶向位點(diǎn),而針對此二靶點(diǎn)的產(chǎn)品形式主要是抗胞外域的單克隆抗體(嵌合抗體或人源化抗體)和抑制酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑。目前已有抗EGFr抗體(C225/Erbitux,嵌合抗體)、抗HER2抗體(Trastuzumab/Herc印tin,人源化抗體)和小分子酪氨酸激酶抑制劑 (ZD1839、0SI-774)等正式上市。單抗類產(chǎn)品其靶向性更強(qiáng),毒副作用更?。涣硗?,除了像酪氨酸激酶抑制劑那樣直接通過阻斷信號通路來毒殺腫瘤細(xì)胞外,抗體產(chǎn)品尚可利用ADCC (抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)效應(yīng)毒殺腫瘤細(xì)胞,綜合效果更理想。因此,單抗類產(chǎn)品比酪氨酸激酶抑制劑在新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用中更受青睞。EGFr家族受體的表達(dá)上調(diào)在各類上皮癌細(xì)胞間存在多態(tài)性。不同的上皮癌類型、 甚至同種不同亞型中表達(dá)上調(diào)的受體種類不同,約有30%左右過表達(dá)EGFr或ErbB-2,另有 5%左右過表達(dá)ErbB-3,限制了此類抗體的抗瘤譜。另外,用藥前需要采用復(fù)雜的分子生物學(xué)和免疫學(xué)手段鑒定過表達(dá)的受體類型,因此在臨床上給用藥帶來了極大的麻煩。在EGFr 家族受體介導(dǎo)的信號傳遞過程中,胞外信號分子(配體)與胞外配體結(jié)合區(qū)結(jié)合引起構(gòu)象改變、并導(dǎo)致受體分子間的“二聚體化”,二聚體化進(jìn)一步導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)的激活,從而激發(fā)下游信號的傳導(dǎo),產(chǎn)生細(xì)胞增殖等系列生物學(xué)效應(yīng)。二聚體化可在同種受體分子間或同一家族的異種受體分子間進(jìn)行,分別形成同源二聚體或異源二聚體。HER2缺配體結(jié)合區(qū), 但其參與二聚體化的相應(yīng)界面始終處于暴露狀態(tài),因此無需配體誘導(dǎo)即可與本家族其它成員形成異源二聚體。HER3缺失胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū),可與其它成員形成異源二聚體來傳導(dǎo)信號。因此,“二聚體化”是EGFr家族信號傳導(dǎo)早期的關(guān)鍵步驟和共有事件。Pertuzumab和 806是近年開發(fā)的新一代抗體產(chǎn)品,目前已處于III期臨床試驗階段。二者分別針對HER2 和HER3的二聚體化界面區(qū),前者對HER2過表達(dá)和非過表達(dá)的HER3陽性腫瘤細(xì)胞均具有顯著毒性,而后者對EGFr和HER3過表達(dá)腫瘤細(xì)胞均具有顯著殺傷活性,顯然,此類針對二聚化界面的抗體更具抗瘤廣譜性。由于EGFr是其受體家族中結(jié)構(gòu)最完善、分布最廣泛的成員,且二聚體化界面所在序列為高度保守序列,因此有理由相信針對EGFr “二聚體化”界面的抗體可能更具抗腫瘤廣譜效應(yīng)。盡管單抗類產(chǎn)品在臨床上表現(xiàn)出了良好的療效,但該類產(chǎn)品主要是嵌合抗體或人源化抗體,需要大規(guī)模高密度細(xì)胞培養(yǎng),工藝復(fù)雜,生產(chǎn)成本高。另外,抗體治療屬于被動免疫療法,因抗體分子量大、半衰期短,所以需要長期、大劑量重復(fù)給藥(每周一次,每次數(shù)百毫克),因此給患者帶來較大的安全風(fēng)險(如目前已發(fā)現(xiàn)Herceptin可導(dǎo)致急性心肌損傷)和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)(年費(fèi)用約5萬美元)。主動免疫治療可誘發(fā)體內(nèi)針對腫瘤相關(guān)抗原(TAA) 的體液免疫反應(yīng)或T細(xì)胞免疫反應(yīng),且可形成免疫記憶性細(xì)胞,因此無需像被動免疫那樣的重復(fù)給藥。在理論上,TAA并非真正意義上的抗原,因為它們屬于自身抗原,人體對其具有免疫耐受性。但在腫瘤患者體內(nèi)可檢測到TAA的特異抗體和T細(xì)胞免疫反應(yīng),以及EGF疫苗已正式上市等事實表明,通過外源TAA給藥有可能打破患者對TAA的免疫耐受,從而激發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此,開發(fā)針對EGFr類受體“二聚體化”界面的治療性多肽疫苗成為可能。傳統(tǒng)的多肽疫苗是將小分子抗原肽化學(xué)偶聯(lián)于大的載體蛋白,以增強(qiáng)抗原肽免疫原性。常用的載體蛋白有小牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)和鑰孔血藍(lán)素(KLH)等, 但該類載體蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜,且屬于天然提取,分子大小和質(zhì)量均一性差,難以用于臨床。分枝寡聚賴氨酸是近年發(fā)展出來的一類新型載體分子,因分子量小而又呈分枝狀,幾乎所有的賴氨酸的ε -ΝΗ2均可偶聯(lián)上抗原肽,形成所謂的多抗原肽(ΜΑΡ)。ΜΑΡ具有較強(qiáng)的免疫原性,但抗原表位的過于密集聚合可能導(dǎo)致表位構(gòu)象的改變而影響此類抗原的特異性,且多聚賴氨酸可能存在較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。Ρ64Κ蛋白是由古巴科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種來自腦膜炎球菌的外膜蛋白,該蛋白具有強(qiáng)免疫原性,分子大小適中,結(jié)構(gòu)簡單,可通過大腸桿菌基因工程系統(tǒng)大量生產(chǎn),因此易于低成本規(guī)模生產(chǎn)和質(zhì)控。目前,由古巴開發(fā)的以重組人EGF(hEGF) 與重組P64K化學(xué)偶聯(lián)的多肽疫苗已批準(zhǔn)上市,并正在北美進(jìn)行II期臨床試驗。該疫苗用于非小細(xì)胞肺癌(EGFr過表達(dá))患者時可誘導(dǎo)高滴度的抗hEGF抗體,并顯著增加中位生存率,且在不良反應(yīng)方面僅表現(xiàn)出輕微的皮疹反應(yīng)。該疫苗為國際上第一個正式上市的多肽疫苗。按采用的抗原表位類型的不同可將多肽疫苗粗略地分為T細(xì)胞疫苗和B細(xì)胞疫苗二大類。過去研制的多肽疫苗主要為T細(xì)胞疫苗,其原因是T細(xì)胞免疫一直被認(rèn)為是最主要的免疫途徑。盡管已有眾多CTL與Th細(xì)胞表位肽作為疫苗用于臨床試驗(195,197, 221),但直到目前尚無T細(xì)胞表位多肽疫苗獲準(zhǔn)上市,其原因主要在于CTL或Th細(xì)胞表位存在專一性HLA限制。B細(xì)胞表位疫苗沒有T細(xì)胞表位那樣的HLA限制,而抗體類產(chǎn)品和 EGF疫苗(B細(xì)胞表位疫苗)等體液免疫類產(chǎn)品的成功上市則進(jìn)一步表明,B細(xì)胞疫苗比T細(xì)胞疫苗更具開發(fā)前景。目前,已分別通過實驗分析Pertuzumab和806等二種抗“二聚體化” 抗體分離、鑒定到HER2和HER3的B細(xì)胞表位,該類表位均為“線性化”表位,位于保守的、 二硫鍵豐富的“二聚體化”界面區(qū)域。以B細(xì)胞表位和“萬用Th表位”組成融合肽是美國科學(xué)家Kaumaya近年提出的一種新的B細(xì)胞多肽疫苗構(gòu)建形式。其中的Th表位為來自麻疹病毒融合蛋白(MVF)或破傷風(fēng)類毒素(TT)的小分子多肽,由18個左右的氨基酸殘基組成,能有效打破MHC II類分子的限制,因此被稱為“萬用Th表位”。Kaumaya的實驗室利用幾株抗HER2抗體進(jìn)行實驗分析獲得了 HER2的一系列B細(xì)胞“線性”表位,其中包括來自“二聚體化”界面的B細(xì)胞表位。他們用化學(xué)合成方法構(gòu)建了一系列B細(xì)胞表位-MVF融合肽。在以HER2過表達(dá)腫瘤患者所做的I期臨床試驗中,這些融合肽疫苗均顯示了良好的免疫原性,3次皮下接種免疫即可在體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度抗HER2抗體反應(yīng),并產(chǎn)生顯著的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種表皮生長因子受體二聚化抗原肽。本發(fā)明的另一目的是提供上述抗原肽與通用T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種表皮生長因子受體二聚化抗原肽,具有表皮生長因子受體二聚體化抗原活性,有如下(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列
(a)SEQ ID NO: 1 ;
(b)將SEQID NO: 1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有表皮生長因子受體二聚化抗原活性;
(c)SEQID NO: 2 ;
(d)將SEQID NO: 2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有表皮生長因子受體二聚化抗原活性。一種表皮生長因子受體二聚化融合抗原肽,是上述任一種抗原肽與通用T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽。上述融合抗原肽,根據(jù)SEQ ID NO: 1序列與T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽具有如下(e)的氨基酸序列
(e)SEQID NO: 3;根據(jù)氨基酸密碼子簡并性,其序列還可以有以下(f)所述的變化形式
(f MfSEQ ID N0: 3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與(e)的蛋白質(zhì)具有相同功能。根據(jù)SEQ ID N0: 2序列與T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽具有如下(g)的氨基酸序列,同時也可以做(h)中所述的變化形式
(g)SEQ ID N0: 4 ;
(h)將SEQID N0: 4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與(g)的蛋白質(zhì)具有相同功能。上述融合抗原肽SEQ ID N0: 3的基因合成方法為以序列SEQ ID N0: 5和SEQ ID N0: 6互為引物和模板,進(jìn)行第一輪PCR;然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID N0: 7和SEQ ID N0: 8為引物,進(jìn)行第二輪PCR;再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID N0: 9 和SEQ ID NO: 10為引物進(jìn)行第三輪PCR,得到產(chǎn)物。上述融合抗原肽SEQ ID N0: 4的基因合成方法為以序列SEQ ID NO: 11和SEQ ID N0: 12互為引物和模板,進(jìn)行第一輪PCR;然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID N0: 13和SEQ ID N0: 14為引物,進(jìn)行第二輪PCR ;再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID N0: 15和SEQ ID N0: 16為引物進(jìn)行第三輪PCR ;以第三輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID N0: 17 和SEQ ID N0: 18為引物進(jìn)行第四輪PCR;以第四輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID N0: 9和 SEQ ID N0: 19為引物進(jìn)行第五輪PCR,得到產(chǎn)物SEQ ID N0: 4。
一種融合抗原肽,是抗HER2 二聚化抗體pertuzumab分離鑒定到的表位HER2 (266-296)與通用T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽,氨基酸序列為SEQ ID NO: 20,其基因合成方法為以序列SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22互為引物和模板,進(jìn)行第一輪PCR ;然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 23為引物,進(jìn)行第二輪PCR ; 再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: M為引物進(jìn)行第三輪PCR,得到產(chǎn)物 SEQ ID NO: 20。上述抗原肽或融合抗原肽在制備治療EGFr過表達(dá)的上皮癌藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用可以是作為治療性多肽疫苗的活性組分或作為抗原制備抗體??贵w包括單克隆抗體和多克隆抗體。上述上皮癌包括非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、腎癌、胃寺。本發(fā)明的表皮生長因子受體二聚化抗原肽作用機(jī)理表皮生長因子受體(EGFr) 是一類跨膜受體,主要由胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)域組成,胞外域含配體結(jié)合區(qū),胞內(nèi)域含酪氨酸激酶活性。配體分子與胞外域的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合后可引起受體分子間同源(二個EGFr 間)或異源(與家族其它成員,如HER2、HER3和HER4) 二聚化,引起胞內(nèi)域酪氨酸激酶的激活,從而導(dǎo)致下游信號的傳遞,引起細(xì)胞增殖、抗凋亡和誘導(dǎo)新血管形成等相關(guān)的基因表達(dá)。EGFr家族成員過表達(dá)與上皮癌的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后高度相關(guān)。本發(fā)明的抗原肽可刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗EGFr 二聚化的抗體,阻斷EGFr過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的、與增殖和抗凋亡相關(guān)的信號通路,從而達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和新血管形成的治療效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下有益效果
(1)本發(fā)明的抗原肽是針對EGFr過表達(dá)上皮癌的,而現(xiàn)有的抗原肽是分別針對HER2 (抗體Pertuzumab的B細(xì)胞表位)和HER3 (抗體806的B細(xì)胞表位)。應(yīng)用對象及范圍都不同于現(xiàn)有的抗原肽。(2)本發(fā)明的抗原刺激產(chǎn)生的抗體主要針對EGFr受體分子間的同源二聚化(EGFr 之間)和異源二聚化(EGFr與同家族其它成員,如HER2、HER3和HER4),目前已用于臨床的抗體無一針對EGFr 二聚體化的。所產(chǎn)生的抗體主要與二聚化界面結(jié)合,而二聚化界面的暴露屬于中間過渡性構(gòu)象,與抗體接觸的機(jī)會相對較少,只有EGFr過表達(dá)的細(xì)胞才有較多的二聚化界面暴露,所以抗二聚體化抗體或疫苗對受體無表達(dá)上調(diào)的正常細(xì)胞毒性相對較小,且因抗二聚體化可同時阻斷EGFr受體家族其它成員介導(dǎo)的信號通路,因此抗癌效果更好。(3)本發(fā)明的抗原肽主要用于制備治療型疫苗。因疫苗制造成本遠(yuǎn)低于各類人源化或全人源抗體,且不需要后者那樣的大劑量、長時期的重復(fù)給藥,因此使用成本低,毒副反應(yīng)小。(4)本發(fā)明用重組DNA技術(shù)制備抗原肽,比常規(guī)的化學(xué)合成法成本低、更易于工業(yè)化放大和質(zhì)控。
圖1 抗EGFr家族二聚體化界面的B細(xì)胞表位比對分析; 圖2 抗EGFr 二聚體化的B細(xì)胞表位肽;圖3 抗EGFr 二聚體化的MVF-GPSL-B細(xì)胞表位肽形式的抗原肽; 圖4 抗EGFr 二聚體化的MVF-GPSL-B細(xì)胞表位肽形式的抗原肽基因序列; 圖5 抗EGFr 二聚體化的MVF-GPSL-B細(xì)胞表位肽形式的抗原肽基因電泳圖,其中1 為 DNA Maker, 2 和 3 為 MVF-GPSL-Her2 (266-296),4 和 5 為 MVF-GPSL-EGFr (262-292),6 為 MFV-GPSL-EGFr(311-3 ),7 為 MVF-GPSL-EGFH262_3^);
圖6 抗EGFr 二聚體化B細(xì)胞表位抗原肽基因表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析,M為分子量標(biāo)準(zhǔn),1 為 MVF-GPSL-EGFr (262-292)工程菌的破碎上清,2 為 MVF-GPSL-EGFr (262-292)工程菌的破碎沉淀;3 為 MVF-GPSL-EGFr (311-3 )工程菌的破碎上清,4 為 MVF-GPSL-EGFr (311-326) 工程菌的破碎沉淀,5為MVF-GPSL-EGFH262-3^)工程菌的破碎上清,6為 MVF-GPSL-EGFr (262-326)工程菌的破碎沉淀;
圖7 抗EGFr 二聚體化B細(xì)胞表位抗原肽免疫原性分析結(jié)果圖,其中HER 為 MVF-GPSL-Her2 (266-296),EGFr-I 為 MVF-GPSL-EGFr (262-292), EGFr-2 為 MFV-GPSL-EGFr (311-326),EGFr-3 為 MVF-GPSL-EGFH262-326);
圖8 抗抗原肽抗體對鱗癌細(xì)胞A431抑制分析(MTT法)結(jié)果圖,Anti-HER為抗 MVF-GPSL-Her2 U66-296)抗體,anti-EGFr-I 為抗體 MVF-GPSL-EGFr (洸2_四2) 抗體,anti-EGFr-2 為抗 MFV-GPSL-EGFr(311-326)抗體,anti_EGFr_3 為抗 MVF-GPSL-EGFr (262-326)抗體。
具體實施例方式下述實施例中,EGFr(262-292)為 SEQ ID NO: l,EGFr (262-326)為 SEQ ID NO: 2, MVF-GPSL-EGFr (262-292)為 SEQ ID NO: 3, MVF-GPSL-EGFr (262-326)為 SEQ ID NO: 4, MVF-GPSL-Her2 (266-296)為 SEQ ID NO: 20。實施例1 EGFr家族抗二聚體化界面B細(xì)胞表位比對分析
根據(jù)抗HER2 二聚體化抗體Pertuzumab和抗HER3 二聚體化抗體806分離鑒定到的已知表位為HER2 (266-296)和HER3 (287-303),以該二表位與hEGFr的氨基酸序列(GenBank ID: AAX41033,BAI46646)進(jìn)行同源序列比對分析,結(jié)果如圖1。結(jié)果表明,EGFrC262-292) 與HER2 (266-296)互為同源序列,同源性為53%,二者均含2個半胱氨酸殘基,該二殘基的位置及其附近的序列或殘基性質(zhì)高度保守。EGFr (311-326)序列則與HER3 (觀7_302)同源。另外,EGFr (262-3 )序列為高度保守序列,與鼠、兔、雞的相應(yīng)序列100%同源,含3對二硫鍵,位于受體胞外區(qū)的二硫鍵豐富區(qū)。根據(jù)上述分析結(jié)果,EGFrU62-326)應(yīng)為受體二聚化界面區(qū),選取EGFK262-292)、 EGFr (311-326)和EGFr U62-326)作為抗EGFr 二聚體化的候選B細(xì)胞表位肽,見圖2。實施例2制備MVF-GPSL-B細(xì)胞表位肽形式的抗原肽
可以采用化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)制備MVF-GPSL-B細(xì)胞表位肽形式的抗原肽,上述 B 細(xì)胞表位肽 MVF-GPSL-EGFr (262-292)、MVF-GPSL-EGFr (311-326)、MVF-GPSL-EGFr (262-3 ),其中的MVF為“萬用Th表位序列”,GPSL為彈性接頭。同時以MVF-GPSL-HER2 (266-296)為對照(圖3)。化學(xué)合成法可采用常規(guī)多肽合成技術(shù)進(jìn)行。DNA重組技術(shù)法是人工合成抗原肽編碼序列(目的基因),并將其克隆于大腸桿菌、酵母或其他表達(dá)系統(tǒng),以適當(dāng)方式誘導(dǎo)目的基因高效表達(dá),再經(jīng)常規(guī)方法分離純化即得。
重組抗EGFr 二聚體化B細(xì)胞表位抗原肽的構(gòu)建
常規(guī)方法構(gòu)建重組抗原肽基因,抗EGFr 二聚體化B細(xì)胞表位抗原肽基因如圖4所示。(1) MFV-GPSL-EGFr (311-326)基因合成
按下述3步進(jìn)行PCR,PCRl和PCR2的反應(yīng)條件為94°C 30 s,68°C 30 s,共25個循環(huán),PCR3 的反應(yīng)條件為 94°C 5 min,94°C 30 s,55°C 30 s,72°C 30 s,共 25 個循環(huán),72°C 7 min。PCRl :SEQ ID N0:25+SEQ ID NO :26 PCR2 :SEQ ID NO :7+ SEQ ID N0:26+PCR1 PCR3: SEQ ID NO :9+ SEQ ID N0:27+PCR2 (2) MFV-GPSL-EGFr (262-326)基因合成
按下述5步進(jìn)行PCR,PCR1-PCR4的反應(yīng)條件為94°C 30 s,68°C 30 s,共25個循環(huán), PCR5 的反應(yīng)條件為 94°C 5 min, 94°C 30 s,55°C 30 s,72°C 30 s,共 25 個循環(huán),72°C 7 min。PCRl SEQ ID NO:11+ SEQ ID NO:12 PCR2: SEQ ID NO:13+ SEQ ID N0:14+PCR1 PCR3: SEQ ID NO:15+ SEQ ID N0:16+PCR2 PCR4: SEQ ID NO:17+ SEQ ID N0:18+PCR3 PCR5: SEQ ID NO :9+ SEQ ID N0:19+PCR4
抗EGFr 二聚體化B細(xì)胞抗原肽基因組裝結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物與理論
大小一致。(3)基因克隆
上述擴(kuò)增產(chǎn)物以Nc0I-HindIII雙酶切后按常規(guī)方法克隆于表達(dá)載體pET3h的相同位點(diǎn),以便與Trx融合表達(dá)??寺『蟮萌诤媳磉_(dá)載體pET3h-MVF-EGFr (311-326)和 pET32a-MVF-EGFr (262-326)0所有表達(dá)載體的構(gòu)建均以大腸桿菌DH5 α為宿主菌,所獲表達(dá)載體委托深圳華大基因有限公司進(jìn)行目的基因表達(dá)盒序列分析。表達(dá)盒經(jīng)測序分析,結(jié)果表明與理論序列一致。經(jīng)序列分析確證后的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3),得表達(dá)工程菌。(4)基因表達(dá)誘導(dǎo)
工程菌接種于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基,37°C振蕩培養(yǎng)過夜,按1% (V/V) 比例轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2.證,加入IPTG至終濃度lmmol/L進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo),共誘導(dǎo)4h。6000 r/min離心5 min收集菌體。所獲工程菌以IPTG誘導(dǎo)后得大小與理論值一致的Trx-Hi s6-抗原肽融合蛋白。(5)表達(dá)產(chǎn)物分離純化
經(jīng)表達(dá)誘導(dǎo)所獲菌體按10% (W/V)懸浮于含500 mmol/L NaCl和20mmol/L咪唑的20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 5),于冰浴中以300瓦輸出功率間歇式超聲破碎10 min, 12000 r/min離心10 min。取上清過上述破菌緩沖液平衡的HisTrap FF柱,相同緩沖液洗平后用含500 mmol/L NaCl和200mmol/L咪唑的20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 5)洗脫,收集目標(biāo)峰樣品。所獲樣品對20mmol/L Tris-HCl (pH7. 5)緩沖液透析過夜,期間換液3次。所獲脫鹽樣品按蛋白/單位酶的比例加入重組腸激酶_His6,37°C保溫》ir。酶解產(chǎn)物過 HisTrap FF 柱,收集穿透液即為 MVF-EGFr (311-326)和 MVF-EGFr (262-326)融合肽, akpharose G25脫鹽后_25°C凍存?zhèn)溆谩?6)蛋白質(zhì)SDS-PAGE與凝膠掃描分析
參照常規(guī)方法進(jìn)行各種樣品的SDS-PAGE。菌體培養(yǎng)物或純化過程中的蛋白樣品以2倍上樣緩沖液煮沸5 min,還原電泳上樣緩沖液不含β-巰基乙醇。電泳所獲凝膠以“天能牌” 凝膠密度掃描儀按廠家說明進(jìn)行拍照和表達(dá)水平或蛋白質(zhì)純度分析。SDS-PAGE分析結(jié)果表明,除含6個半胱氨酸的MVF-GPSL-EGFr (262-326)的表達(dá)產(chǎn)物幾乎全部為包涵體外,其余均以可溶性表達(dá)產(chǎn)物為主(圖6)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化后以腸激酶切下Trx-His6標(biāo)簽,再過Ni柱并收集穿透液即為不帶任何標(biāo)簽的抗原肽。 實施例3重組抗EGFr 二聚體化B細(xì)胞抗原肽免疫原性分析經(jīng)純化的抗原肽經(jīng)蛋白濃度測定后按以下方法免疫小鼠和兔。1.抗原乳化
用2-5mL注射器,取1.25mL含抗原的PBS,另一支注射器取(等體積)福氏完全佐劑或不完全佐劑,用不銹鋼連接接頭連接,反復(fù)推拉混合約10-30分鐘,平放靜置30分鐘,如水乳相不再分離,即可注射動物。2.免疫程序
取生育期雌性BALB/c小鼠和新西蘭大白兔,第一次用福氏完全佐劑,小鼠每只lOOPg, 皮下多點(diǎn)注射,總劑量0. 2mL/只,大白兔每只lOOOPg,皮下多點(diǎn)注射,總劑量0. 5mL/只,第二次起用福氏不完全佐劑,劑量與第一次相同,間隔3周,第三次注射后10天以ELISA法測血清抗體滴度。如滴度未達(dá)到IXlO4以上,則繼續(xù)免疫。3.抗體滴度測定
取抗血清56°C保溫30min,以滅活互補(bǔ)反應(yīng)。用50μ1的含/mL抗原肽的PBS溶液包被96孔板,4°C過夜或37°C靜置》ir。棄盡包被液,每孔用100μ 的含1% BSA的PBS封閉, 4°C過夜或37°C靜置》ir。棄盡封閉液,取鼠抗人IgG的抗血清按照1 :1000、1 :2000、…… 倍比稀釋,加入50μ 相應(yīng)孔中,加1:1000的正常鼠血清或者PBS作為陰性對照,1 :100的鼠抗人IgG作為陽性對照。37°C孵育lhr,用PBT洗液洗5次,吸水紙上拍干,加“二抗”(羊抗鼠IgG-HRP),37°C孵育lhr。用PBT洗液洗5次,吸水紙拍干,加底物顯色10分鐘左右, IN的H2S04終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測0D410,減去本底后0D410達(dá)到> 0. 2時的最大稀釋倍數(shù)即為滴度。設(shè)3個重復(fù)。每種抗原肽各有5只小鼠,每個柱體的數(shù)據(jù)來自1只小鼠抗血清的滴度測定值。所獲抗血清經(jīng)ELISA分析得各抗原肽所產(chǎn)生抗體的滴度,見圖7。結(jié)果表明,所有抗原肽接種的5只小鼠均產(chǎn)生了高于40000滴度的抗體,其中MVF-GPSL-EGFr (262-326)的抗體滴度略高于其他抗原肽的,最高滴度達(dá)到160000。實施例4抗重組抗表皮生長因子受體二聚體化B細(xì)胞表位抗原肽抗體純化及抗體活性分析
取實施例3中大白兔抗血清56°C保溫30min,以滅活互補(bǔ)反應(yīng)。用以Hi1Trap Protein G柱按照廠家說明書進(jìn)行純化,其中柱平衡緩沖液為20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.4),洗脫緩沖液為lOOmmol/L的甘氨酸-HCl (pH2. 7),目的峰樣收集于預(yù)置中和緩沖液lmol/LTris-HCl (pH9.0)。測抗體的蛋白濃度,_20°C保存?zhèn)溆谩K@純化抗體以MTT法檢測抑制EGFr過表達(dá)的鱗癌細(xì)胞A431生長的活性。取 EGFr過表達(dá)的鱗癌細(xì)胞株A431,按1 X IO4細(xì)胞/孔接種96孔板,37°C培養(yǎng)過夜,加入0. μδ /mL 1.9項所述純化的兔抗肽抗體,以鼠IgG作陰性對照,37°C培養(yǎng)72 hr。測0D570,按下述公式計算抑制率(%) (0D正常兔IgG-OD抗肽抗體)X 100/ OD正常兔IgG。設(shè)3個重復(fù)。 檢測結(jié)果如圖8所示,結(jié)果顯示,所制備的抗肽抗體可有效抑制EGFr過表達(dá)腫瘤細(xì)胞A431 的生長。結(jié)果表明,由本發(fā)明公開的EGFr 二聚化B細(xì)胞表位融合抗原肽可誘導(dǎo)小鼠和兔產(chǎn)生高滴度的特異性抗體,而該類抗體可在體外有效抑制EGFr過表達(dá)的人腫瘤細(xì)胞A431的生長。由于所采用的B細(xì)胞表位在人、鼠和兔之間擁有100%的同源性,因此可以推斷上述抗原肽在人體內(nèi)亦可誘導(dǎo)高滴度的、抗EGFr 二聚體化的特異性抗體產(chǎn)生,而只要有高滴度抗體產(chǎn)生必然可以達(dá)到類似于抗二聚體化抗體Pertuzumab和806那樣的惡性腫瘤治療效 果。
權(quán)利要求
1.一種表皮生長因子受體二聚化抗原肽,有如下(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO: 1;(b)將SEQID NO: 1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有表皮生長因子受體二聚化抗原活性;(c)SEQ ID NO: 2 ;(d)將SEQID NO: 2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有表皮生長因子受體二聚化抗原活性。
2.一種表皮生長因子受體二聚化融合抗原肽,是權(quán)利要求1所述抗原肽與通用T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合抗原肽,具有如下(e)或(f)的氨基酸序列(e)SEQID NO: 3 ;(f MfSEQ ID NO: 3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與(e)的蛋白質(zhì)具有相同功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合抗原肽,具有如下(g)或(h)的氨基酸序列(g)SEQ ID NO: 4 ;(h)將SEQID NO: 4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與(g)的蛋白質(zhì)具有相同功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述融合抗原肽,其特征在于SEQID NO: 3的基因合成方法為以序列SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6互為引物和模板,進(jìn)行第一輪PCR ;然后以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8為引物,進(jìn)行第二輪PCR ;再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10為引物進(jìn)行第三輪PCR,得到產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述融合抗原肽,其特征在于SEQID NO: 4的基因合成方法為以序列SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12互為引物和模板,進(jìn)行第一輪PCR ;然后以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14為引物,進(jìn)行第二輪PCR ;再以第二輪PCR 產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16為引物進(jìn)行第三輪PCR ;以第三輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18為引物進(jìn)行第四輪PCR ;以第四輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 19為引物進(jìn)行第五輪PCR,得到產(chǎn)物SEQ ID NO: 4。
7.一種表皮生長因子受體二聚化融合抗原肽,其特征是抗HER2 二聚化抗體 pertuzumab分離鑒定到的表位HER2 (266-296)與通用T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽, 核苷酸序列為SEQ ID NO: 20,其基因合成方法為以序列SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22 互為引物和模板,進(jìn)行第一輪PCR;然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 23為引物,進(jìn)行第二輪PCR;再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板,以SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: M為引物進(jìn)行第三輪PCR,得到產(chǎn)物SEQ ID NO: 20。
8.權(quán)利要求1所述抗原肽在制備治療EGFr過表達(dá)的上皮癌藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征是作為治療性多肽疫苗的活性組分或作為抗原制備抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于所述上皮癌為非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、腎癌或胃癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表皮生長因子受體二聚化抗原肽,涉及治療性多肽疫苗和抗體藥物制備領(lǐng)域??乖陌被嵝蛄袨镾EQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,或前述任一序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有表皮生長因子受體二聚化抗原活性的多肽。本發(fā)明還公開了表皮生長因子受體二聚化融合抗原肽,是前述抗原肽與通用T細(xì)胞表位肽MVF組成的融合肽。本發(fā)明的抗原肽或融合抗原肽主要用于制備治療型疫苗。因疫苗制造成本遠(yuǎn)低于各類人源化或全人源抗體,且不需要后者那樣的大劑量、長時期的重復(fù)給藥,因此使用成本更低,毒副反應(yīng)更小。用重組DNA技術(shù)制備抗原肽,比化學(xué)合成法成本低、更易于工業(yè)化放大和質(zhì)控。
文檔編號A61K39/00GK102153644SQ20101061885
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者吳梅芝, 朱磊, 李黃金 申請人:廣東藥學(xué)院