專利名稱：一種能同時抑制vegfr和egfr受體激酶家族的小分子抑制劑化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物，該化合物的特征在于可以同時抑制血管內(nèi)皮生長因子受體家族激酶(VEGFRs)和表皮生長因子受體激酶(EGFRs)，具有高效的抗腫瘤以及抗炎癥活性，具體說為一種能同時抑制VEGFR和EGFR受體激酶家族的小分子抑制劑化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)又稱為血管滲透性因子和血管增殖因子，迄今為止，VEGF被確認(rèn)具有高度特異，及有效的促新生血管形成作用。研究表明，VEGF不僅誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的移行，并且刺激產(chǎn)生一系列的蛋白產(chǎn)物參加血管外基質(zhì)的降解，這些功能使VEGF具有在生理和病理?xiàng)l件下起調(diào)節(jié)血管新生的主要作用。
VEGF選擇性直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的兩種亞型酪氨酸激酶受體Flt-1 (又稱VEGFR-1^P KDR (又稱VEGFR-2)，一般認(rèn)為只有血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)這兩種受體。VEGF結(jié)合到其酪氨酸激酶受體可誘發(fā)多種生物活性，如細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。這個家族的受體包括VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR3。VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR3表達(dá)主要限于腫瘤淋巴管和血管。血管新生是腫瘤生長的必備條件，大量研究證明VEGF在腫瘤變化進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用。VEGF的表達(dá)與組織中微血管的密度及新生血管的數(shù)量密切相關(guān)。許多動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)血管生成抑制劑能明顯抑制腫瘤生長。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這是腫瘤治療中干預(yù)治療的一個極有潛力的方法。抑制腫瘤的新生血管，可能成為治療腫瘤特別是實(shí)體腫瘤的一種有效方法。
表皮生長因子受體(EGFRs)是表皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。EGFRs屬于ErbB酪氨酸激 酶型受體家族的一種，該家族包括EGFR (ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2), Her 3 (ErbB-3)和Her 4 (ErbB_4)。EGFR廣泛分布于哺乳動物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面。受EGFR調(diào)節(jié)的信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。研究表明在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFRs的高表達(dá)或異常表達(dá)。EGFRs與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。EGFRs的過表達(dá)在惡性腫瘤的演進(jìn)中起重要作用，膠質(zhì)細(xì)胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中都有EGFRs的過表達(dá)。對膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究發(fā)現(xiàn)EGFRs的高表達(dá)主要與其基因擴(kuò)增有關(guān)。許多腫瘤中有突變型EGFRs存在，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多種EGFRs突變型。突變型EGFRs的作用可能包括:具有配體非依賴型受體的細(xì)胞持續(xù)活化；由于EGFRs的某些結(jié)構(gòu)域缺失而導(dǎo)致受體下調(diào)機(jī)制的破壞；異常信號傳導(dǎo)通路的激活；細(xì)胞凋亡的抑制等。EGFRs的配體對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)有很大影響。EGFRs的配體通過自分泌形式激活EGFRs促進(jìn)細(xì)胞增殖，他們的共表達(dá)往往預(yù)示腫瘤預(yù)后不良。
目前已知的抗癌藥物靶點(diǎn)和通路以及它們各自對應(yīng)的小分子化合物和大分子生物藥物多為針對VEGFRs受體激酶家族或者EGFRs受體激酶家族其中一個的單一靶點(diǎn)藥物。這些單一靶點(diǎn)對應(yīng)的藥物很多作為首選癌癥治療方案對一些早期的癌癥具有一定的抑制作用。但是對于晚期和機(jī)理復(fù)雜的癌癥這些藥物或多或少存在著活性偏低和易產(chǎn)生耐藥性等不足。值得注意的是，療效顯著的藥物往往具有多靶點(diǎn)的特征。但因?yàn)樵谘邪l(fā)和優(yōu)化的階段并沒有針對和兼顧多個靶點(diǎn)，現(xiàn)有的藥物都不具備同時有效抑制VEGFRs和EGFRs兩個靶點(diǎn)和通路的特性。多靶點(diǎn)研究代表了各大跨國醫(yī)藥公司和研究單位最新的藥物研發(fā)方向。輝瑞于2006年上市的索坦(Sutent)雖然以多祀點(diǎn)為研發(fā)方向但缺乏導(dǎo)向性,在抑制相關(guān)癌癥靶點(diǎn)和信號通路的同時也抑制了其它正常通路的信號從而具有較高毒副作用。通過選擇與病理相關(guān)的多個通路以及通路中的靶點(diǎn)和它們所對應(yīng)的藥物進(jìn)行組合和篩選?；旌纤幬镌诏熜Ш湍退幏矫鏁忻黠@的提高，但是不可避免地增加了藥物吸收和代謝的復(fù)雜性和不確定性以及藥物之間的相互作用和影響。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有藥物只針對單一藥物靶點(diǎn)，同時對于晚期和機(jī)理復(fù)雜的癌癥這些藥物存在著活性偏低和易產(chǎn)生耐藥性等不足活性較低的缺點(diǎn)，本發(fā)明的主要目的在于提供一種能同時抑制VEGFR和EGFR受體激酶家族的小分子抑制劑化合物及其制備方法，以解決上述問題。
該化合物的制備方法如下:
首先，將3- (6-氯-嘧啶-4 -氨基)苯酚(ImL) (0.085克，0.38毫摩爾)和7 -氨基-5 -甲氧基苯并呋喃(0.056克，0.38毫摩爾)在2-乙氧基乙醇的制備的混合物，在150°C下攪拌過夜；
再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，再在室溫將10%的K2C03溶液(2.50毫升，1.81毫摩爾)滴加到懸浮液中，邊滴加邊攪拌，并放置過夜；
然后將反應(yīng)混合物用水稀釋，并通過真空過濾收集析出的固體，用水洗滌并真空干燥，粗產(chǎn)物在硅膠上純化(9%甲醇+1 % Et3N在DCM)得到0.138克[6_( I氫)-吲哚-5-基氧基-嘧啶-4-基]-(4-(哌嗪-1-基)苯)-胺，分子量:387。
化合物及其中間體經(jīng)過氫核磁共振譜和液質(zhì)聯(lián)用的檢測和鑒定其化學(xué)位移及質(zhì)荷比符合該化合物結(jié)構(gòu)特征。
熒光偏振酶動力學(xué)分析
為檢測該化合物對VEGFRs激酶家族和EGFRs激酶家族的抑制活性，我們采用了一種動力學(xué)突光偏振分析法(fluores`cence polarization immunoassay, FP assay)。突光偏振分析方法是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)。FP最適宜檢測小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測定。
熒光偏振免疫分析常用于測定半抗原的藥物濃度。反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)除待測抗原外，同時加入一定量用熒光素標(biāo)記的小分子抗原，使二者與有限量的特異性大分子抗體競爭結(jié)合。當(dāng)待測抗原濃度高時，經(jīng)過競爭反應(yīng)，大部分抗體被其結(jié)合，而熒光素標(biāo)記的抗原多呈游離的小分子狀態(tài)。由于其分子小，在液相中轉(zhuǎn)動速度較快，測量到的熒光偏振程度也較低。反之，如果待測抗原濃度低時，大部分熒光素標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合，形成大分子的抗原抗體復(fù)合物，此時檢測到的熒光偏振程度也較高。熒光偏振程度與待測抗原濃度呈反比關(guān)系。我們測定待測抗原標(biāo)準(zhǔn)品后制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過檢測反應(yīng)系中偏振光的大小，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以精確地得知樣品中待測抗原的相應(yīng)含量。
我們選擇了人源VEGFR，EGFR作為活性酶，在底物肽飽和濃度0.8uM下，測算每種激酶的ATP的Km值。針對不同化合物濃度梯度的檢測條件都經(jīng)過優(yōu)化和驗(yàn)證。酶動力學(xué)研究表明該化合物對EGFR和VEGFRs的抑制機(jī)理是針對底物ATP的線性競爭性抑制，即ATP與該化合物的直接競爭酶活性部位的同一結(jié)合位點(diǎn)。該化合物對VEGFRs和EGFR激酶具有極強(qiáng)的抑制作用，相關(guān)Ki值如下，Ki (VEGFRl)= 3.5 nM; Ki (VEGFR2)= 120 nM; Ki(VEGFR3) = 18 nM; and Ki (EGFR) = 120 nM。
具體實(shí)施方式
需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合，一種能同時抑制VEGFR和EGFR受體激酶家族的小分子抑制劑化合物的制備方法為:首先，將3-(6-氯-嘧啶-4 -氨基)苯酚(lmL)(0.085克，0.38毫摩爾)和7 -氨基_5-甲氧基苯并呋喃(0.056克，0.38毫摩爾)在2-乙氧基乙醇的制備的混合物，在150°C下攪拌過夜；
再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，再在室溫將10%的K2C03溶液(2.50毫升，1.81毫摩爾)滴加到懸浮液中，邊滴加邊攪拌，并放置過夜；
然后將反應(yīng)混合物用水稀釋，并通過真空過濾收集析出的固體，用水洗滌并真空干燥，粗產(chǎn)物在硅膠上純化(9%甲醇+1 % Et3N在DCM)得到0.138克[6_( I氫)-吲哚-5-基氧基-嘧啶-4-基]-(4-(哌嗪-1-基)苯)-胺，分子量:387。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等 ，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種能同時抑制VEGFR和EGFR受體激酶家族的小分子抑制劑化合物及其制備方法，其特征在于:該化合物的制備方法如下: 首先，將3- (6-氯-嘧啶-4 -氨基)苯酚(ImL) (0.085克，0.38毫摩爾)和7 -氨基-5 -甲氧基苯并呋喃(0.056克，0.38毫摩爾)在2-乙氧基乙醇的制備的混合物，在150°C下攪拌過夜； 再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，再在室溫將10%的K2C03溶液(2.50毫升，1.81毫摩爾)滴加到懸浮液中，邊滴加邊攪拌，并放置過夜； 然后將反應(yīng)混合物用水稀釋，并通過真空過濾收集析出的固體，用水洗滌并真空干燥，粗產(chǎn)物在硅膠上純化(9%甲醇+l%Et3N在DCM)得到0.138克[6- (1氫)-吲哚_5_基氧基-嘧啶-4-基]-(4-(哌嗪-1-基)苯) -胺，分子量:387。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能同時抑制VEGFR和EGFR受體激酶家族的小分子抑制劑化合物及其制備方法，通過將3-(6-氯-嘧啶-4-氨基)苯酚(1mL)(0.085克，0.38毫摩爾)和7-氨基-5-甲氧基苯并呋喃(0.056克，0.38毫摩爾)在2-乙氧基乙醇的制備的混合物，在150℃下攪拌過夜等方法，針對現(xiàn)有藥物只針對單一藥物靶點(diǎn)，同時對于晚期和機(jī)理復(fù)雜的癌癥這些藥物存在著活性偏低和易產(chǎn)生耐藥性等不足活性較低的缺點(diǎn)，使得該化合物同時抑制VEGFR和EGFR受體激酶家族。
文檔編號C07D405/12GK103159743SQ20131009603
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:常州費(fèi)洛斯藥業(yè)科技有限公司