專利名稱：大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的α和γ基因序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物基因領域，尤其涉及大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體 PPAR的a和y基因序列。
背景技術：
過氧化物酶體增殖物受體(peroxisome proliferator-activatived receptors, PPARs)是一類由配體激活的核轉錄因子，屬II型核受體家族成員。近年來許多 研究表明PPARs在動物脂肪細胞分化和脂肪代謝中起著重要作用。PPAR分為 三種亞型，即PPARa、 p、 PPARa主要在肝細胞表達，可能主要參與調(diào)節(jié)脂 質代謝；PPARy主要在脂肪細胞表達，參與脂肪細胞分化及其成脂作用；而 PPAR(3分布廣泛，可能與細胞的基礎脂質代謝有關，也可能起到協(xié)助PPARa、 y的作用。PPAR在介導脂肪酸氧化及脂肪代謝中起重要作用，其靶基因均與脂 質轉運和代謝途徑有關。過氧化物酶體增殖物反應元件(peroxisome proliferator response element, PPRE)常位于脂質代謝相關蛋白或酶基因的上游，如編碼脂 肪酸結合蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、脂蛋白脂酶、過氧化物酶體脂肪酸 氧化酶系及脂酰CoA去飽和酶等基因。PPARs與PPRE結合可激活上述基因表 達，表明PPAR參與脂質代謝的許多環(huán)節(jié)。PPAR是調(diào)控肝臟脂肪酸氧化酶基因 表達的轉錄因子，PPAR上調(diào)各種脂肪細胞蛋白包括解偶聯(lián)蛋白1與脂蛋白脂酶 的基因表達。PPARa的靶基因是一組相對同類的基因，它們參與了脂質分解代 謝的幾個方面如脂肪酸的透膜吸收、脂肪酸在細胞內(nèi)的結合、脂肪酸的氧化 (在微球蛋白、過氧化物酶體和線粒體中)和脂蛋白的合成與運輸。PPARa可 以調(diào)節(jié)若干線粒體脂肪酸，化酶的表達，通過誘導肌肉和肝臟特異性的肉毒堿 棕櫚酰轉運酶表達而調(diào)控脂肪酸向線粒體的轉運，刺激卩-氧化過程，降低脂肪 酸和甘油三酯合成。PPARy是脂肪組織發(fā)育的中心調(diào)控劑，其信號通路影響細 胞和系統(tǒng)脂肪代謝。它能夠誘導肝細胞表達載脂蛋白、脂肪酸氧化酶系與脂蛋
白脂酶等，從而促進脂質的氧化代謝，降低血脂濃度。PPARy的活化能夠選擇 性誘導與脂肪酸吸收相關的基因在脂肪組織的表達，如脂蛋白脂酶、脂肪酸轉運蛋白與?；鵆oA合成酶基因等，但并不改變這些基因在肌肉組織中表達，從 而導致脂肪酸在肌肉組織中的相對缺失。
大黃魚(拉丁文名為尸化wdoyc/"ewa crocea , Richardson ， 可簡寫為 尸化wfifo"/aewz cracea, R.或P cracea)是中國重要的海水經(jīng)濟魚類品種之一，養(yǎng) 殖大黃魚由于詞料營養(yǎng)價值不高而造成體內(nèi)脂肪含量增加，降低了魚肉的瘦肉 率。通過對PPAR基因表達的調(diào)控可以改善大黃魚體內(nèi)的脂肪代謝過程，對提 高魚類的肌肉品質具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種大黃魚肝臟過氧化物酶體 增殖物受體PPAR的a和y基因序列。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的大黃魚肝臟過氧化物酶體增 殖物受體PPAR的a禾卩y基因序列，它們分別具有SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2 所示的基因序列。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體 PPAR的a和y的基因克隆及其熒光定量方法，為探討大黃魚肝臟脂肪代謝的分 子作用機制提供了理論基礎，并對其他石首魚科魚類的肝臟PPARa和y基因的 克隆和表達提供了借鑒作用。


圖1為本發(fā)明的PCR電泳圖2為大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的a基因序列圖； 圖3為大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體ppar的y基因序列圖4為表示PPARa和y基因的表達水平隨著日糧中共軛亞油酸含量的增加而顯
著升高的圖，圖中，*表示差異顯著(尸<0.05)。
具體實施例方式
本發(fā)明首先設計四對簡并性引物，然后從大黃魚肝臟中提取RNA，經(jīng)反轉 錄獲得的cDNA作為模板，通過兩輪PCR反應獲取大黃魚肝臟PPARa和Y基因 片段，經(jīng)過連接和轉化反應后，檢測得PPARa具有SEQ ID No.l所示的基因序列，PPARy具有SEQIDNo.2所示的基因序列。
下面根據(jù)附圖詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。
1、 所用材料
大黃魚成年大黃魚(約300g重)，由浙江省象山港寧波海灣水產(chǎn)養(yǎng)殖繁
育中心提供，肝臟取出后液氮凍存?zhèn)溆谩?br> 主要酶類及其他生化試劑Trizol (Invitrogen公司)，氯仿，異丙醇，75 %乙醇，DEPC-H20， M-MLV Reverse Transcriptase cDNA synthesis kit (Promega 公司)，pUCm-T載體(BBI公司)，Biospin膠回收試劑盒(BioFlux)， X-Gal， IPTG， T4DNA連接酶(TaKaRa公司)，TOPO10感受態(tài)細胞，質粒純化試劑盒 (Omega公司)，SYBR Premix Ex-TaqTM Kit (TaKaRa公司)。限制性內(nèi)切酶 iVco I禾B I等購自Promega生物工程有限公司。
2、 分別設計四對簡并性引物
PPARa弓i物
upper 1: 5'-CTRARRCTGGAGTAYGACA-3' lower 1: 5'-GGGGAARAGGAARKTGTC國3' upper2: 5'畫CCYCAGKCRGAGAARCTA-3' 1ower2: 5 '-GATCRTTBAGRTCCAGGCT-3' PPARy引物
upper 1: 5'畫ACATGAAGGATTTGTCCAC-3' lower 1: 5'-TTCGGCNGAACGTGACT-3' upper2: 5 '-TGACCAACATGGACTACAC-3' 1ower2: 5'畫GGACTTCTTGTGAATGCG-3'
3、 反轉錄聚合酶鏈反應(rtJ-pcr)
取液氮凍存的大黃魚肝臟200mg，分別按Trizol試劑盒和反轉錄試劑盒說 明抽提其總RNA，并反轉錄成cDNA，取2nl為模板通過兩輪PCR進行擴增， 第一輪PCR反應以cDNA為模板，利用upperl和lowerl進行擴增；第二輪PCR 以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，利用引物upper2和1ower2進行二次擴增來分別 獲取PPARa和PPARY基因片段。兩輪PCR反應條件均為94 。C預變性5 min， 然后94 °C 30 s + 56 °C 30 s + 72 °C 30 s，共35個循環(huán)，循環(huán)結束后72 。C延伸 10 min。
4、 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定
將PCR產(chǎn)物用Biospin膠回收試劑盒進行切膠純化，混合PCR產(chǎn)物、PUCm-T 載體和T4DNA連接酶進行連接，并轉化到TOPO 10感受態(tài)細胞中，將經(jīng)過轉100嗎/ml氨芐青霉素和X-Gal)上進行 培養(yǎng)，通過藍白篩選，挑取白色菌落用作PCR反應模板，以通用引物M13 Forward (-20) Primer和M13 Reverse Primer為引物進行PCR反應，反應條件為94 。C預 變性5 min，然后94 °C 30 s + 56 °C 30 s + 72 °C 1 min，共35個循環(huán)，循環(huán)結束 后72 'C延伸10 min。 PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。根據(jù)片段大小各 篩選兩個陽性菌株委托上海英駿生物技術有限公司進行測序，并將所測序列通 過NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行Blast比較分析。
5、 大黃魚PPARa和y基因表達水平的分析
由浙江省象山港寧波海灣水產(chǎn)養(yǎng)殖繁育中心提供成年大黃魚(約300g重)， 該大黃魚日糧中含有不同水平共軛亞油酸(0%、 1%、 2%和4%)，將肝臟取出 后液氮凍存?zhèn)溆谩?br> 取液氮凍存的大黃魚肝臟200mg，分別按Trizol試劑盒和反轉錄試劑盒說 明抽提其總RNA，并反轉錄成cDNA。
根據(jù)大黃魚肝臟中已經(jīng)克隆到的PPARa和y基因片段以及內(nèi)參actin基因設 計熒光定量PCR引物。
PPARa引物
upper: 5'-GTCAAGCAGATCCACGAAGCC-3' lower: 5 '-TGGTCTTTCCAGTGAGTATGAGCC-3'
PPARy引物
upper: 5'-CAGTGGCAGCGTTAAACATCG-3' lower: 5 '誦GAAGAAACCCTTACAGCCCTCA誦3' actin弓l物
upper: 5'-GACCTGACAGACTACCTCATG-3' lower: 5'-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGGA-3'
PPARa引物的擴增長度為82bp, PPARy引物的擴增長度為98bp，內(nèi)參actin 引物的擴增長度為87bp，由上海生物工程有限公司合成。
以cDNA為模板進行SYBR Green I熒光定量PCR反應，反應條件為95 °C 預變性10 s，然后95 °C變性10 s， 60 °C 20 s退火/延伸(收集熒光信號)，共 45個循環(huán)。然后進行熔點曲線的制作并測定Ct值。
6、 結果
PPARa和y基因兩輪PCR擴增后電泳分析
經(jīng)過兩輪PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳顯示PPARa和y基因各有一條明顯的 條帶(圖l)，且長度與設計擴增長度相似，割膠回收目的條帶。PPAR(X基因的克隆及序列分析
以成年大黃魚的肝臟mRNA為模板，參照狼鱸(D.dwtoc)、真鯛(Pmq/or) 和銀頭鯛".^rato) PPARa蛋白保守區(qū)設計引物，用RT-PCR擴增出一段大小 為460bp的DNA片段，將其轉化到TOPO 10感受態(tài)細胞上，篩選陽性菌落經(jīng) 過PCR反應后進行序列分析，經(jīng)分析，該基因序列與其他海水魚類PPARa基因 的同源性較高，如鱸魚D./Wrax (E=2e-161， Identities=90%)和銀頭鯛S.孤rata (E=3e-94， Identities=90°/。)。推斷該片段為大黃魚肝臟PPARa基因的全長序列 (見圖2)。測得該片斷具有SEQIDNo.l所示的基因序列。 PPARY基因的克隆及序列分析
以成年大黃魚的肝臟mRNA為模板，參照狼鱸(Z).cfe"tec)、真鯛(Amq/o/") 和銀頭鯛(S.awrato) PPARy蛋白保守區(qū)設計引物，用RT-PCR擴增出一段大小 為310bp的DNA片段，將其轉化到TOPO 10感受態(tài)細胞上，篩選陽性菌落經(jīng) 過PCR反應后進行序列分析，經(jīng)分析，該基因序列與其他海水魚類PPARy基因 的同源性較高，如海鰈p/afewa (E=5e-31， Identities=98%)、川鰈P y7e (E=5e-31， Identities=98%)和銀頭鯛S.awrato (E=3e-18， Identities=98%)。推 斷該片段為大黃魚肝臟PPARy基因的全長序列(見圖3)。測得該片斷具有SEQ IDNo.2所示的基因序列。
7、大黃魚PPARa和Y基因表達水平的分析結果
以飼喂不同日糧共軛亞油酸水平(0%、 1%、 2%和4%)的成年大黃魚(約 300g重)為研究對象，分別提取其肝臟組織分析PPARa和Y基因的表達水平。 通過對大黃魚血液和組織有關脂肪合成酶活性的測定已經(jīng)證明共軛亞油酸能夠 顯著降低大黃魚機體的脂肪合成效率，結果顯示隨著日糧中共軛亞油酸含量的 增加，PPARa和Y基因的表達水平也有顯著的升高(見圖4)。
大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的a和Y基因序列表 SEQUENCE LISTING <110>浙江大學
<120>大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的a和y基因序列 〈160> 2
<170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 448 <212> 腿〈213〉 P.(二rocG3
〈400〉 1
cctcaggcggagaaacta犯gctcaaggcagaaagca卿tggtggagaa60
agccccatgctggctgaccaC33gattXtggtcaagcaga tccacgaagcctacatgaag120
^cttcetcceitg￡l￡LC￡L￡lggCgaaagcacggctcatactca ctggaaagaccaacaagccg180
cagccgttcatcattcacgacatggaaacgttccagctgg cagagaagacattagcggcc240
catatggtaaacggtgaccatccagagcctgacagcggcc ttcaagctggga犯gtggtt300
cccggtgtgggttgtggggagctacagcagaggg郷ctg鄉(xiāng)ccaggctcttccactgc360
tgccagagcacctcggtggag￡LCa_gtC￡tC3g￡tgCtg￡lC￡Lg agtttgCCaaggcggtgcca420
ggtttccagagcctggacctcaatgatc448
<210〉 2
〈211〉 302
〈212〉 DNA
〈213〉 P. crocea
〈400〉 2
tgaccaLaca/tgctacaggat ggagctggac60
c犯tcaaggtggagccggagtcgcctccgcagttctctga cagtcccgtgttctccaagc120
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ctatcaggtta犯gttggtgtacgatcactgtgatcttca ctgtcgcattceicaag犯gt300
cc30權利要求
1、一種大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的α基因序列。其特征在于，它具有SEQ ID No.1所示的基因序列。
2、 一種大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的y基因序列。其特征在于， 它具有SEQ IDNo.2所示的基因序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了大黃魚肝臟過氧化物酶體增殖物受體PPAR的α和γ基因序列，它們分別具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的基因序列。該兩種基因的成功克隆及基因序列測定為以后闡明大黃魚體內(nèi)脂肪代謝的分子機制打下了良好的基礎。并對其他石首魚科魚類的肝臟PPARα和γ基因的克隆和表達提供了借鑒作用。
文檔編號C12N15/12GK101544980SQ20091009520
公開日2009年9月30日 申請日期2009年1月5日 優(yōu)先權日2009年1月5日
發(fā)明者吳天星, 唐宏剛, 趙占宇 申請人:浙江大學