一種含酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種含酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物及其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其所述的藥物組合物包含以物質(zhì)的量比為10:1?10的熊果酸和厄洛替尼，兩者聯(lián)用可以起到協(xié)同抗腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。其聯(lián)用對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲等具有顯著的抑制作用。
【專利說明】
一種含酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn) 移藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物組合物，屬于藥物組合物領(lǐng)域，具體的屬于抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥 物組合物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 熊果酸即3β_羥基-熊果-12-稀_28_酸（30-hydroxy-urs-12-en-28-〇ic acid，簡 稱UA)，又名烏索酸、屬于a-香樹脂醇（a-amyrin)型五環(huán)三萜類化合物，其相對(duì)分子量為 456.68，分子式為C 3qH48O3，結(jié)構(gòu)如式I所示是自然界中分布較廣的天然活性化合物，主要以 游離或糖苷的形式存在，其廣泛分布于枇杷葉、熊果、山楂、白花蛇舌草等多種天然植物中， 也是許多傳統(tǒng)中藥的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病 毒、抗氧化等其中以抗癌活性最為顯著，不僅對(duì)多種致癌物有抵抗作用，而且對(duì)多種腫瘤細(xì) 胞在體內(nèi)、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，顯示出較大的臨床應(yīng)用潛力。近年來國 內(nèi)外對(duì)UA的抗腫瘤研究日趨深入，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤預(yù)防、治療以及防止晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方 面有著獨(dú)特的優(yōu)勢及潛在的應(yīng)用前景。專利N201510097801.9公開了一種含有熊果酸和環(huán) 磷酰胺的藥物組合物，所述組合物既可以增強(qiáng)單組分的抗腫瘤藥效，也能降低其對(duì)正常組 織的毒性，從而提高腫瘤治療的效果，在腫瘤治療領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。專利 N03150714.X公開了熊果酸對(duì)人肝癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人淋巴瘤細(xì)胞、人成淋巴細(xì)胞白 血病和人急性成淋巴細(xì)胞白血病、人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有細(xì)胞毒效 應(yīng)。
[0003] 厄洛替尼(Erlotinb，簡稱E1)，結(jié)構(gòu)如式Π所示，是近年來才上市的治療晚期非 小細(xì)胞肺癌藥物，在國際及國內(nèi)肺癌指引中厄洛替尼均被列為晚期非小細(xì)胞肺癌二線治療 藥物之一，它是通過口服治療非小細(xì)胞肺癌的靶向藥物。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑 制劑（the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)是重要的靶向治療藥物之一，是以EGFR為靶點(diǎn)的小分子藥物，通過競爭性結(jié)合受體的 ATP或底物結(jié)合區(qū)域，從源頭阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)揮作用。厄洛替尼作為EGFR小分子酪氨酸 激酶抑制劑，因其有口服簡便、副作用小、易于被患者接受而臨床應(yīng)用廣泛。結(jié)構(gòu)如圖2所 示。專利N201510360703.X公開了苦鬼臼毒和厄洛替尼聯(lián)合用藥用藥肺癌的治療，兩者聯(lián)合 使用后會(huì)產(chǎn)生協(xié)同抗肺癌作用；專利N 200680041064.X公開了將N-辛二酰苯胺異羥肟酸和 厄洛替尼聯(lián)合使用用于肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥的治療。
[0004] 以不同癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，通過將熊果酸和厄洛替尼聯(lián)合用藥，對(duì)不同癌細(xì) 胞系進(jìn)行體外抗癌活性測試，結(jié)果表明，熊果酸和厄洛替尼的聯(lián)合使用對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞，特 別是對(duì)非小細(xì)胞肺癌的增殖迀移、侵襲等具有顯著的抑制作用，呈濃度和時(shí)間依賴性的抑 制非小細(xì)胞肺癌的增殖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種含酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物及其在制備抗腫瘤 轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，通過將酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼與高效低毒的抗腫瘤天然產(chǎn)物熊果 酸進(jìn)行聯(lián)合用藥，考察其聯(lián)合用藥后對(duì)癌細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移作用，其可望獲得較為安全可靠的 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新型候選藥物。
[0006] 一種含酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物及其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其所述的藥 物組合物包含以物質(zhì)的量比為10:1-10的熊果酸和厄洛替尼，兩者聯(lián)用可以起到協(xié)同抗腫 瘤轉(zhuǎn)移的效果。
【附圖說明】
[0007] 圖1.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24h對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果； 圖2.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對(duì)H1975細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果； 圖3.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對(duì)H1299細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果； 圖4.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的抑制結(jié)果； 圖5.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對(duì)A549細(xì)胞侵襲的抑制率； 圖6.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h后對(duì)A549細(xì)胞迀移能力的抑制結(jié)果； 圖7.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對(duì)A549細(xì)胞迀移的抑制率； 圖8.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用48 h后對(duì)A549細(xì)胞迀移能力的抑制結(jié)果； 圖9.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用48 h對(duì)A549細(xì)胞迀移的抑制率； 圖10.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用72 h后對(duì)A549細(xì)胞迀移能力的抑制結(jié) 果； 圖11.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用72 h對(duì)A549細(xì)胞迀移的抑制率； 圖12.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用于A549細(xì)胞對(duì)EGFR蛋白表達(dá)水平的影 響； 圖13.熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用于H1975細(xì)胞對(duì)EGFR蛋白表達(dá)水平的影 響。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0009] 實(shí)施例1 熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用及聯(lián)合使用24 h對(duì)不同肺癌細(xì)胞系的增殖抑制作用:采用 標(biāo)準(zhǔn)MTT比色法測定了熊果酸和厄洛替尼不同聯(lián)合比例對(duì)不同肺癌細(xì)胞系的增殖抑制活 性，結(jié)果如圖1_3所不。
[0010] 如圖1-3所示，當(dāng)熊果酸（10 μΜ)和厄洛替尼（1-10 μΜ)在低濃度范圍內(nèi)聯(lián)合用藥 24 h后，對(duì)癌細(xì)胞無明顯增殖抑制作用且對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用小。因此后續(xù)選擇將安全 有效的低劑量濃度(無明顯細(xì)胞殺傷作用）的熊果酸和厄洛替尼聯(lián)用，繼續(xù)研究其對(duì)肺癌細(xì) 胞侵襲及轉(zhuǎn)移的抑制能力，以探索其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移領(lǐng)域應(yīng)用的潛力。
[0011] 實(shí)施例2 熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對(duì)A549細(xì)胞株侵襲能力的影響 A549細(xì)胞先加無血清無酚紅培養(yǎng)基饑餓過夜，消化、離心收集的細(xì)胞用含不同藥物濃 度的空白培養(yǎng)基懸浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 yL含不同藥物濃度的細(xì)胞懸浮 液(約5 X IO5/孔），下室加500 yL含10%小牛血清的培養(yǎng)基，藥物作用24 h，取出小室，用4% 的多聚甲醛固定20 min，用棉簽擦掉上層未迀移細(xì)胞，用PBS洗3次，用0.1 %結(jié)晶紫染色40 min，用PBS洗3次，將小室的底膜取下，封片保存，倒置顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野下拍照，統(tǒng)計(jì)迀 移的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖4、5所示。
[0012] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、5所示，熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用24 h后對(duì)A549 細(xì)胞株侵襲能力的檢測，結(jié)果表明，空白對(duì)照組、UA(濃度在10 μΜ條件下）和厄洛替尼(濃 度在10-40 μΜ條件下)單獨(dú)使用組，穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于熊果酸和厄洛替尼(濃 度在1-8 μΜ條件下)聯(lián)合用藥組;兩者聯(lián)用細(xì)胞侵襲能力明顯受到了抑制，可以減少厄洛替 尼的給藥劑量。
[0013] 實(shí)施例3 熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對(duì)Α549細(xì)胞株迀移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞(約3 X IO6/孔)接種于該板中，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24 h，待細(xì)胞接近融合后，用白色槍頭在孔板的1/4、1/2、3/4處垂直的劃三條平行線，用 PBS清洗細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下拍劃痕寬帶，記錄下所拍圖片的坐標(biāo)軸。加入含不同藥物 濃度的培養(yǎng)基，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h在同一部位再次拍照，測定 迀移距離，對(duì)比各組兩次拍照的迀移距離，結(jié)果如圖6-11所示。
[0014] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6-11所示，熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用24、48、72 h后 對(duì)A549細(xì)胞株細(xì)胞迀移抑制率檢測，結(jié)果表明：在0 h，給藥干預(yù)組與空白對(duì)照組對(duì)比迀移 距離無明顯影響，經(jīng)給藥24 h后，空白對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生了很明顯的迀移，劃痕寬帶變窄；當(dāng) UA濃度為10 μΜ的時(shí)候，細(xì)胞也明顯的發(fā)生了迀移;厄洛替尼在高濃度（多20 μΜ)的條件下， 細(xì)胞的迀移能力受到了抑制，劃痕愈合速度減慢;但當(dāng)兩者聯(lián)合使用后，在厄洛替尼在多4 μΜ的情況下，劃痕寬帶明顯比單用厄洛替尼多20 μΜ來的寬，且呈濃度依賴性的抑制細(xì)胞的 迀移能力。經(jīng)給藥48 h后，空白對(duì)照組細(xì)胞的劃痕已經(jīng)閉合；當(dāng)UA濃度為10 μΜ的時(shí)候，細(xì)胞 很明顯的發(fā)生了迀移，劃痕寬度變得很窄;厄洛替尼在多20 μΜ的條件下能明顯的抑制細(xì)胞 的迀移能力;但當(dāng)兩者聯(lián)合使用后，在厄洛替尼在3 μΜ的條件下，就能較明顯的抑制細(xì)胞的 迀移能力，隨著厄洛替尼藥物濃度的增大，細(xì)胞的迀移能力也會(huì)變小。經(jīng)給藥72 h后，空白 對(duì)照組、UA濃度為10 μΜ及厄洛替尼在10 μΜ的條件下，細(xì)胞的劃痕都已經(jīng)趨于閉合;但當(dāng)兩 者聯(lián)合使用后，在厄洛替尼在1 μΜ的條件下，就能較明顯的抑制細(xì)胞的迀移能力。因此兩者 聯(lián)合用藥，能呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性的抑制細(xì)胞的迀移能力，劃痕寬度與空白對(duì)照組 相比差異明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈〇.01)。
[0015] 實(shí)施例4 熊果酸和厄洛替尼單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對(duì)Α549、Η1975細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)水平的影 響 將細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞達(dá)80 %以上加不同藥物干預(yù)細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，用 預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，向6孔板中的每孔加入新鮮配制的細(xì)胞裂解液R I PA (radioimmunopre-cipitation assay) 200 yL[l mL RIPA中加入 10 yL蛋白酶抑制劑、10 UL磷酸酶抑制劑和5 yL苯甲基橫酰氣(phenylmethanesulfonyIfIuoride，PMSF)]，冰上放 置30 min，每5 min搖晃一次，12000Xg 4°C離心15 min，取上清液，制備總蛋白；采用二喹 啉甲酸(bicincho-ninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以β-actin水平作 為等量蛋白質(zhì)上樣，取20 yg蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 電泳，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙稀(p〇lyvinylidene, PVDF)膜上，室溫下用 含5%脫脂奶粉的TBST封閉I h，加入一抗4°C反應(yīng)過夜，次日用TBST室溫下洗膜3次（10 min/次），再加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋)在室溫下孵育I h，用TBST在室溫下再次洗膜 3次（10 min/次），最后電化學(xué)發(fā)光顯影。采用圖像分析軟件Image J對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分 析，結(jié)果如圖12、13所示。
[0016] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12、13所示，空白對(duì)照組不影響A549和H1975細(xì)胞EGFR蛋白水平的表 達(dá)；當(dāng)UA濃度為10 μΜ和厄洛替尼在20 μΜ的條件下，對(duì)A549和H1975細(xì)胞EGFR蛋白水平的表 達(dá)水平的影響不大;但當(dāng)兩者聯(lián)合給藥(厄洛替尼在4 μΜ條件下），就能起到協(xié)同增效的作 用，能夠明顯的抑制EGFR蛋白表達(dá)水平，通過下調(diào)EGFR蛋白的表達(dá)水平進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的 增殖、抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的藥物組合物，其特征在于包含物質(zhì)的量比為?ο: 1-10的 熊果酸和厄洛替尼。2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/517GK105963305SQ201610519494
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月5日
【發(fā)明人】邵敬偉, 鄭桂容, 江凱
【申請(qǐng)人】福州大學(xué)