鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應(yīng)用，該鐵死亡抑制劑為Ferrostatin?1。本發(fā)明為以鐵死亡為靶點(diǎn)的鐵過載疾病的治療提供了理論依據(jù)，特別是對(duì)遺傳性血色病的藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
【專利說明】
鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在治療鐵過載疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵死亡(Ferroptosis)是一類鐵依賴的細(xì)胞死亡途徑，不同于凋亡、壞死、自噬等其他死亡途徑。鐵死亡表現(xiàn)為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平和標(biāo)志基因Ptgs2表達(dá)量升高，可特異性被鐵離子螯合劑抑制。
[0003]Ferrostatin-1是目前公認(rèn)的鐵死亡抑制劑。作為含有N-環(huán)己基的化合物，F(xiàn)errostatin-1與細(xì)胞膜磷脂雙分子層有較高親和性，能有效清除細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化。體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)errostatin-1作用于癌細(xì)胞，抑制Erast in誘導(dǎo)的胞楽和脂質(zhì)ROS積累，進(jìn)而抑制鐵死亡。在新生大鼠大腦中，F(xiàn)errostatin-1抑制谷氨酸鹽誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡。此外，F(xiàn)errostat in_l不能抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化或螯合鐵，說明Ferrostat in_l抑制鐵死亡不通過調(diào)控MEK/ERK通路、細(xì)胞鐵水平或抑制蛋白合成。與生育酚等還原劑類似，F(xiàn)errostatin-1不穩(wěn)定，容易被氧化成穩(wěn)定的2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)。
[0004]鐵是人體必需的微量元素之一，鐵代謝平衡紊亂會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。在鐵過載時(shí)，細(xì)胞內(nèi)過量的鐵會(huì)通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量氧化自由基，破壞蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。血色病(Hemochromatosis)又稱遺傳性血色病，是常見的慢性鐵負(fù)荷增多的常染色體遺傳疾病，表現(xiàn)為過多的鐵儲(chǔ)存于肝臟、心臟和胰腺等實(shí)質(zhì)性器官，導(dǎo)致組織器官退行性病變，引發(fā)肝病、糖尿病、心臟病等慢性疾病。血色病通常由鐵調(diào)素及其調(diào)控基因突變導(dǎo)致，目前治療方法較為局限。
[0005]雖然鐵在鐵死亡過程中發(fā)揮重要作用，但目前還沒有關(guān)于鐵代謝與鐵死亡的報(bào)道。鐵代謝紊亂(尤其是鐵過載)是否會(huì)導(dǎo)致Ferroptosis也不得而知。目前已知的鐵死亡抑制劑有Ferrostatin-1、生育酸、β-巰基乙醇等，均未被使用或報(bào)道過用來治療遺傳性血色病等鐵過載疾病。
[0006]因此，以鐵死亡為靶點(diǎn)，通過鐵死亡抑制劑靶向抑制鐵過載引發(fā)的鐵死亡，對(duì)遺傳性血色病的治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在制備治療鐵過載疾病藥物中的應(yīng)用，為新藥研發(fā)和創(chuàng)新療法提供基礎(chǔ)。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應(yīng)用，該鐵死亡抑制劑為Ferrostatin-1。
[0009]在發(fā)明過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)鐵過載會(huì)導(dǎo)致鐵死亡。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小分子化合物Ferrostatin-1是鐵死亡特異性抑制劑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在小鼠肝原代細(xì)胞中，F(xiàn)errostatin-1能明顯抑制鐵離子刺激導(dǎo)致的鐵死亡。通過對(duì)野生型小鼠飼喂高鐵飼料誘導(dǎo)鐵過載，F(xiàn)errostatin-1處理能明顯抑制鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡。進(jìn)一步通過血色病小鼠模型證實(shí)，F(xiàn)errostatin-1能明顯抑制鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡，但并不改變小鼠的組織鐵含量。該研究結(jié)果為Ferrostat in-Ι改善鐵過載疾病提供了理論依據(jù)，特別是對(duì)遺傳性血色病的藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
[0010]鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在治療鐵過載疾病時(shí)，其用法和用量為:每天肌肉注射或靜脈滴注ferrostatin-l(lmol/kg體重)，2周為一療程。
[0011]綜上所述，本發(fā)明提供了鐵死亡抑制劑在治療鐵過載疾病中的應(yīng)用，具體的，所述鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1可用于制備治療遺傳性血色病(HereditaryHemochromatosis)并發(fā)癥的藥物，或者預(yù)防補(bǔ)鐵時(shí)鐵死亡毒性的補(bǔ)充劑。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了Ferrostatin-1在抑制膳食性鐵過載和遺傳性血色病中的鐵死亡過程，為以鐵死亡為靶點(diǎn)的鐵過載疾病的治療提供了理論依據(jù)，特別是對(duì)遺傳性血色病的藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0013]圖1為Ferrostatin-1體外抑制鐵過載引發(fā)的鐵死亡；
[0014]A:空白處理(Con)、檸檬酸鐵FAC(10yM)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加二甲基亞砜(DMSO)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加Ferrostatin-1 (2μΜ)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加DFO(1yM)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(10yg/mL)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加壞死抑制劑Necrostat in-1 (10yg/mL)共處理小鼠肝原代細(xì)胞12小時(shí)，對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的抑制效果;
[0015]B:空白處理(Con)、檸檬酸鐵FAC(10yM)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加二甲基亞砜(DMSO)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加Ferrostatin-1 (2μΜ)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加DFO(1yM)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(10yg/mL)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加壞死抑制劑Necrostatin-1(10yg/mL)共處理小鼠肝原代細(xì)胞12小時(shí)，對(duì)細(xì)胞Ptgs2 mRNA表達(dá)的抑制效果。
[0016]圖2為Ferrostatin-1腹腔給藥能抑制小鼠膳食鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡；
[0017]A:高鐵飼料飼喂8周，F(xiàn)errostatin-1 (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，C57BL/6小鼠肝臟Ptgs2mRNA表達(dá)水平；
[0018]B:高鐵飼料飼喂8周，F(xiàn)errostatin-l(Ferr_l，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，C57BL/6小鼠肝臟非血紅素鐵含量。
[0019]圖3為Ferrostatin-1腹腔給藥能抑制血色病小鼠中的鐵死亡并改善肝損傷；
[0020]A:Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠肝臟Ptgs2 mRNA表達(dá)水平；
[0021 ] B: Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠肝臟非血紅素鐵含量。
[0022]C: Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠血清ALT活性。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0024]實(shí)施例1:
[0025]1.材料和方法
[0026]1.1實(shí)驗(yàn)原料制備
[0027]化合物單體Ferrostatin-l、DFO、Z-VAD-FMK、Necrostatin_l和朽1檬酸鐵均購自SIGMA公司。Ferrostatin-l、DF0、Z_VAD-FMK、Necrostatin_l溶于無菌二甲基亞諷DMSO中，檸檬酸鐵溶于磷酸鹽緩沖液中，配置成所需濃度。
[0028]1.2小鼠肝原代細(xì)胞
[0029]小鼠肝原代細(xì)胞通過II型膠原酶緩沖液灌流法從C57BL/6小鼠肝臟中獲得。培養(yǎng)條件:含10%FBS(GIBC0)的DMEM高糖型培養(yǎng)基(GIBC0)，37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱。待細(xì)胞貼壁后，在培養(yǎng)基中分別加入磷酸鹽緩沖液PBS，檸檬酸鐵(ΙΟΟμΜ，終濃度，下同)，檸檬酸鐵(ΙΟΟμΜ)+凋亡抑制劑(10yg/mL)，檸檬酸鐵(ΙΟΟμΜ)+壞死抑制劑(10yg/mL)，檸檬酸鐵(100yM)+Ferrostatin-l(2yM)。處理 12小時(shí)后，收集細(xì)胞，進(jìn)行Real-time PCR(見1.3)和細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平測(cè)定(見1.4)。
[0030]1.3RNA提取和Real-time PCR
[0031 ] Trizol(Life Techno1gies)法提取細(xì)胞和組織的RNA，具體操作按說明書進(jìn)行。Nanodrop lOOOSpectrophotometer上檢測(cè)RNA純度(00260/00280^?= 1.9-2.1)及RNA濃度(ng/μ?)，調(diào)整RNA濃度到lyg/μ?。
[0032]2.0yg RNA經(jīng)DNase (Promega)處理后，]\1_]\11^反轉(zhuǎn)錄酶(？1'01116 8&)和01丨80((1丁)18primer(Takara B1 Inc.)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。CFX96Real_Time System(B1-Rad)中進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)Ptgs2mRNA水平，檢測(cè)體積為1ul，試劑米用iQ SYBR Green Supermix(B1-Rad)，引物序列如下:
[0033]mouseActb(P-actin):
[0034]forward:AAATCGTGCGTGACATCAAAGA
[0035]reverse:GCCATCTCCTGCTCGAAGTC
[0036]mouse Ptgs2:
[0037]forward:CTGCGCCTTTTCAAGGATGG
[0038]reverse:GGGGATACACCTCTCCACCAo
[0039]1.4細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平測(cè)定
[0040]貼壁的小鼠肝原代細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液。Cll-BODIPY(1yM)室溫避光孵育30分鐘，PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。C11-B0DIPY購自Invitrogen。
[0041 ] 1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0042]3周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SPF環(huán)境飼養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)飼料AIN-76A(鐵含量50mg/Kg，Research Diets，Inc)適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分組，每組6?8只。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)照組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周；高鐵組用高鐵飼料喂養(yǎng)8周；治療組用高鐵飼料(鐵含量8.3g/Kg,Research Diets，Inc)喂養(yǎng)8周，最后2周每隔一天腹腔注射Ferrostatin-l (lmol/kg體重)。5 %水合氯醛腹腔麻醉后，心臟采血，分離血清，并收集肝脾腎組織(液氮保存)，檢測(cè)肝損傷指標(biāo)(見1.6)和肝臟Ptgs2表達(dá)量(方法同1.3)。
[0043]1.6肝損傷指標(biāo)的檢測(cè)
[0044]臨床上常用血清中谷氨酸-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的活性來衡量肝損傷水平。血清ALT活性檢測(cè)使用上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒，檢測(cè)方法依照說明書。
[0045]1.7統(tǒng)計(jì)方法
[0046]所用統(tǒng)計(jì)采用R軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean± SD表示。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的組間比較采用Tukey ’ s檢驗(yàn)(ANOVA)，兩組間比較以Student ’ s t_test檢驗(yàn)，以P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0047]2.結(jié)果
[0048]2.1 Ferrostatin-l在小鼠肝原代細(xì)胞中抑制鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡
[0049]分離商品化C57BL/6小鼠的肝原代細(xì)胞并體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中分別加入磷酸鹽緩沖液I3BS，檸檬酸鐵FAC( ΙΟΟμΜ，終濃度，下同)，檸檬酸鐵FAC( ΙΟΟμΜ)+凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(10yg/mL)，檸檬酸鐵 FAC(10yM)+壞死抑制劑Necrostatin-1 (10yg/mL)，檸檬酸鐵 FAC(100yM)+Ferrostatin-l (2μΜ)。12小時(shí)后，檢測(cè)鐵死亡指標(biāo)，包括細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和Ptgs2 mRNA水平。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0050]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檸檬酸鐵刺激能顯著上調(diào)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平和Ptgs2mRNA表達(dá)，說明體外鐵過載會(huì)引發(fā)鐵死亡。鐵離子螯合劑DFO和Ferrostatin-l處理能明顯抑制鐵對(duì)脂質(zhì)過氧化和Ptgs2表達(dá)量的上調(diào)，而凋亡抑制劑Z-VAD-FMK和壞死抑制劑Necrostatin_l處理則沒有抑制作用。這說明Ferrostatin-l在體外水平能抑制鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡。
[°°511 2.2 Ferrostatin-l抑制膳食鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡
[0052]4周齡的C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分成3組，分別飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料(鐵含量50mg/kg，Research Diets, Inc)8周、高鐵飼料(鐵含量8.3g/kg，Research Diets, Inc)8周、高鐵飼料8周加最后2周腹腔注射Ferrostatin-l (每天lmol/kg)，檢測(cè)肝臟Ptgs2mRNA水平和肝臟非血紅素鐵含量。
[0053]結(jié)果顯示，高鐵飼料飼喂能明顯上調(diào)肝臟非血紅素鐵含量和Ptgs2mRNA水平，說明體內(nèi)水平鐵過載也會(huì)導(dǎo)致鐵死亡。Ferrostatin-l聯(lián)合處理能明顯抑制高鐵膳食對(duì)Ptgs2表達(dá)的上調(diào)，說明Ferrostatin-l在體內(nèi)水平能抑制鐵過載導(dǎo)致的鐵死亡。同時(shí)，高鐵飼料與Ferrostatin-l聯(lián)合處理組同高鐵飼料單獨(dú)處理組相比，肝臟非血紅素鐵含量沒有明顯差異，說明Ferr ο s tat i η-1抑制鐵死亡的同時(shí)，并不影響機(jī)體的鐵代謝水平。
[0054]鐵劑補(bǔ)充目前常在臨床上用于治療缺鐵性貧血，但鐵的過量攝入會(huì)導(dǎo)致鐵死亡。該研究提示，鐵劑可以與Ferrostatin-l聯(lián)合使用，在不影響補(bǔ)鐵效果的同時(shí)，降低鐵的鐵死亡毒性。
[0055]2.3 Ferrostatin-l緩解血色病小鼠的表型
[0056]遺傳性血色病是常見的鐵過載疾病。Smad4肝臟特異敲除小鼠(Smad4Alb/Alb)的表型與發(fā)病機(jī)制與遺傳性血色病相似。6周齡的雄性Smad4Alb/Alb小鼠給予腹腔注射Ferrostatin-l (lmol/kg每天)，2周后檢測(cè)肝臟非血紅素鐵含量、血清ALT活性和Ptgs2mRNA水平。
[0057]結(jié)果顯示，與對(duì)照小鼠(Smad4fl°x/fl°x)相比，Smad4Alb/Alb小鼠的肝臟鐵含量、Ptgs2mRNA水平明顯上升，說明血色病小鼠中存在鐵死亡。給予Ferrostatin_l處理后，肝臟Ptgs2表達(dá)量明顯下降，說明Ferrostatin-l能抑制血色病小鼠中的鐵死亡。血色病模型中，鐵過載會(huì)導(dǎo)致肝損傷，進(jìn)而引發(fā)一系列并發(fā)癥。本底狀態(tài)下，Smad4Alb/Alb小鼠的血清ALT水平較SmacMfzMnIl明顯升高；對(duì)Smad4AllVA1M、鼠給予Ferrostatin-l處理后，血清ALT水平明顯下降至對(duì)照小鼠水平，說明通過F err ο s tat i η-1革El向抑制鐵死亡能明顯改善了血色病小鼠的病理狀態(tài)。
[0058]基于此，F(xiàn)errostatin-l抑制鐵過載導(dǎo)致鐵死亡是治療鐵過載相關(guān)疾病(血色病)的治療方法。
[0059]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應(yīng)用，該鐵死亡抑制劑為Ferrostatin-10
【文檔編號(hào)】A61P3/12GK105943530SQ201610307748
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】王福俤, 王浩, 閔軍霞
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)