LRR-RLK受體激酶AtMDIS1及其在打破物種間生殖隔離中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本申請(qǐng)?jiān)O(shè)及但不限于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及擬南芥的LRR-RLK化eucine-rich repaeat-receptor like kinase)受體激酶AtMDISl(fele Discoverl)及其應(yīng)用;更具體地 設(shè)及在花粉中特異表達(dá)的LAT52啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)擬南芥受體激酶編碼基因 AtMDISlW轉(zhuǎn)基因手 段打破物種間生殖隔離的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于各方面的原因，親緣關(guān)系接近的類(lèi)群之間在自然條件下不交配，或即使能交 配也不能產(chǎn)生后代或不能產(chǎn)生可育性后代的隔離機(jī)制，被稱(chēng)為生殖隔離。若生殖隔離發(fā)生 在受精W前，稱(chēng)為受精前的生殖隔離，其中包括地理隔離、生態(tài)隔離、季節(jié)隔離、生理隔離、 形態(tài)隔離和行為隔離等;若生殖隔離發(fā)生在受精W后，就稱(chēng)為受精后的生殖隔離，其中包括 雜種不活、雜種不育和雜種衰敗等。
[0003] 各種生殖隔離的實(shí)質(zhì)都是阻礙不同物種間的基因交流，該隔離現(xiàn)象給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造 成了困難，比如雜交時(shí)的雜種不育，使人們不能利用雜種優(yōu)勢(shì)育種。運(yùn)種生殖隔離給農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)造成了一定的負(fù)效應(yīng)。如能實(shí)現(xiàn)打破植物的近緣雜交不親和，對(duì)不同物種之間的基因交 流W及農(nóng)作物的增產(chǎn)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环NDNA片段，所述DNA片段具有SEQ ID No.:l所示的核巧酸序列， 或與SEQ ID No.: 1具有60% W上的同源性、優(yōu)選地75%或更高、更優(yōu)選地85%或更高、進(jìn)一 步更優(yōu)選地90%或更高、最優(yōu)選地95%或更高的同源性的核巧酸序列。運(yùn)里使用的術(shù)語(yǔ)"同 源性"指與天然核巧酸序列的序列相似性。同源性可W用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用 計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性可W用百分比（％ )表示，其可W用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān) 序列之間的同源性。
[0005] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环NDNA片段，所述DNA片段的核巧酸序列與W上所述的DNA片段的 核巧酸序列互補(bǔ)。運(yùn)里使用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"系指遵循堿基配對(duì)原則產(chǎn)生。
[0006] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝撕蠾上所述的DNA片段的重組載體。在一些實(shí)施方案中，所述重組 載體可包括花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子;優(yōu)選地，所述花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子可W是LAT52啟動(dòng)子。 在一些實(shí)施方案中，所述重組載體可包括SEQ ID NO. :3所示的序列。
[0007] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝税琖上所述的DNA片段的植株、細(xì)胞系或重組菌株。
[000引本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N打破植物間生殖隔離的方法，所述方法包括:將W上所述的DNA 片段導(dǎo)入與其來(lái)源不同的另一種植物;獲得轉(zhuǎn)入所述DNA片段的植物。在一些實(shí)施方案中， 所述植物可為擬南芥W外的所有植物物種，優(yōu)選地所述植物可為雙子葉植物或單子葉植 物，更優(yōu)選地所述植物可為擬南芥的近緣物種和遠(yuǎn)緣物種，最優(yōu)選地所述植物可為擬南芥 的近緣物種。在一些實(shí)施方案中，所述擬南芥的近緣物種可W是十字花科(Cruciferae)云 苔屬（Brassica)，包括白菜（B.pekinensis)、小油菜（B.chinensis L.)、圓白菜 (B.oleracea)、油菜（B.napus)、憲菁（Brassica rapa)、蘿h(Raphanus sativus)、 Arabidopsis lyrataXapsella 1'油611日;和/或所述擬南芥的遠(yuǎn)緣物種可^是煙草、番茄、 小麥、玉米或水稻。
[0009]本申請(qǐng)?zhí)峁┝?W上所述的DM片段在提高植物雜交的親和性、打破生殖隔離中的 用途。在一些實(shí)施方案中，所述植物可為擬南芥W外的所有植物物種，優(yōu)選地所述植物可為 雙子葉植物或單子葉植物，更優(yōu)選地所述植物可為擬南芥的近緣物種和遠(yuǎn)緣物種，最優(yōu)選 地所述植物可為擬南芥的近緣物種。在一些實(shí)施方案中，所述擬南芥的近緣物種可W是十 字花科（Cruciferae)云苔屬（Brassica)，包括白菜（B.pekinensis)、小油菜（B. chinensis L.)、圓白菜（B.oleracea)、憲菁（Brassica rapa)、蘿KRaphanus sativus)、Arabidopsis lyrata、Capsella 1'山3日11日;和/或所述擬南芥的遠(yuǎn)緣物種可^是煙草、番茄、小麥、玉米或 水稻。
[0010] 本申請(qǐng)克隆了擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的膜定位受體AtMDISl并用基因 工程的方法轉(zhuǎn)入其近緣物種化psella rubella中，能夠增加 C.rubella花粉管識(shí)別成熟擬 南芥胚珠的效率。
[0011] 本申請(qǐng)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是用轉(zhuǎn)基因手段打破近緣雜交不親和的新方法。
[0012] 本申請(qǐng)?zhí)峁┑腄NA片段的核巧酸序列如下：
[OOU] 擬南芥AtMDISl的核巧酸序列如沈Q ID NO. :1所示。
[0014] Capsella rubella中的MDIS1的直系同源基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. :2所 /J、- 〇
[0015] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在近緣物種中基因表達(dá)的方法，包括如下步驟:將本申請(qǐng)的擬 南芥DNA片段導(dǎo)入其近緣物種C.rubella中，得到轉(zhuǎn)基因植物，使得上述DNA片段在所述轉(zhuǎn)基 因植物中轉(zhuǎn)錄;與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因的C.rubella植物中表達(dá)了擬南芥的AtMDISl基 因。
[0016] 所述方法中從地1101 (Clontech)改造的最終表達(dá)載體，依次由lJVr52啟動(dòng)子、酶切 位點(diǎn)、AtMDUl片段W及轉(zhuǎn)錄終止子NOS-Terminitor依次連接而成，序列如SEQ ID No. :3所 /J、- 〇
[0017] 總的來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)利用在番茄花粉中特異表達(dá)的啟動(dòng)子LAT52驅(qū)動(dòng)AtMDISl,可W 高效地在十字花科（Cruciferae)云苔屬（Brassica)，包括白菜（B.pekinensis)、小油菜 (B. chinensis L .)、圓白菜（B. oleracea)、油菜（B .napus)、憲菁（Brassica rapa)、蘿h (Ra地anus sativus)、Arabidopsis lyrata、Capsella rubella和遠(yuǎn)緣物種煙草、番茄、小 麥、玉米或水稻等等擬南芥W外其他植物的花粉管中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，利用LAT52驅(qū)動(dòng) AtMDISl在花粉管中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，可W提高化psella rubella花粉管定向地導(dǎo)向未受精擬 南芥胚珠的效率。說(shuō)明在擬南芥近緣物種化psella rubella中表達(dá)AtMDISl能夠提高轉(zhuǎn)基 因的C.rubella花粉管識(shí)別擬南芥胚珠的效率，從而增加異緣雜交的受精效率。
[0018] 本申請(qǐng)的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說(shuō)明書(shū)中闡述，并且，部分地從說(shuō)明書(shū)中變 得顯而易見(jiàn)，或者通過(guò)實(shí)施本申請(qǐng)而了解。本申請(qǐng)的目的和其他優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)在說(shuō)明書(shū)、權(quán)利 要求書(shū)W及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本 申請(qǐng)的實(shí)施例一起用于解釋本申請(qǐng)的技術(shù)方案，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的限制。
[0020] 圖1示出改造后的pLAT52:AtMDISl-N0ST載體。
[0021] 圖2示出用PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物陽(yáng)性苗的鑒定結(jié)果。pLM'SSiAtMDISl-NOST轉(zhuǎn) 入近緣物種化psella rubella后，其中擬南芥基因 AtMDISl的表達(dá)。泳道1為陰性對(duì)照(野生 型Capsella rubella植株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物），泳道2和3為WT1代不同株的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物 (表達(dá)AtMDISl的C. rubel la植物）的基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖中箭頭所示，較 大的條帶為野生型化psella rubella中的CrMDISUAtMDUl的直系同源基因），較小的條帶 為轉(zhuǎn)入的擬南芥的AtMDISl。
[0022] 圖3示出AtMDISl轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性化psella rubella植物花粉半體外萌發(fā)導(dǎo)向未受精 擬南芥胚珠。左圖：表達(dá)擬南芥的AtMDUl基因的化psella rubella的花粉管識(shí)別并進(jìn)入未 受精的成熟擬南芥胚珠;右圖：野生型Capsella rubella的花粉管不能被成熟的未受精擬 南芥胚珠所吸引，花粉管在珠孔附近經(jīng)過(guò)而未進(jìn)入珠孔。
[0023] 圖4為野生型W及轉(zhuǎn)基因化psel la rubel la植物的花粉管被成熟的未受精擬南芥 胚珠吸引的效率統(tǒng)計(jì)。圖中誤差線為Ξ次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Student ' S t-test方法，p***<0.01表示差異極顯著。星號(hào)顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將W實(shí)施例的方式對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，W使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 實(shí)踐本申請(qǐng)。應(yīng)當(dāng)理解，可W采用其他實(shí)施方式，并且可W做出適當(dāng)?shù)母淖兌黄x本申請(qǐng) 的精神或范圍。為了避免對(duì)于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)不必要的細(xì)節(jié)，說(shuō)明 書(shū)可能省略了對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知的某些信息。因此，W下詳細(xì)描述不應(yīng)W限制 性的意義來(lái)理解，且本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求界定。
[0025] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0026] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027] W下實(shí)施例便于更好地理解本申請(qǐng)，但并不限定本申請(qǐng)的范圍。
[0028] 本申請(qǐng)列舉的實(shí)施例中進(jìn)行基因編輯時(shí)使用的具體工具如下：
[00巧]擬南芥Col-〇生態(tài)型（Arabidopsis thaliana L.)在文獻(xiàn)^in-Ran Li ,Hong-Ju Li,Li Yuan,Man Liu,Dong-Qiao Shi ,Jie Liu and Wei-Cai Yang.(2014)Arabidopsis DAYU/ABERRANT PEROXISOME M0RPH0L0GY9Is a Key Regulator of Peroxisome Biogenesis and Plays Critical Roles during Pollen Maturation and Germination in Planta.化e Plant Cell ,26:619-635/'中描述，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物 學(xué)研究所獲得。
[0030] C.rubellaKapsella rubella)種子在ABRC stock centrer獲得。
[0031] DNA內(nèi)切酶購(gòu)自化w England Biolabs公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有 限公司；T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；T0Y0B0K0D Plus酶購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司。
[0032] LAT52啟動(dòng)子由McCormick S.實(shí)驗(yàn)室在番茄中分離出來(lái)，是可W驅(qū)動(dòng)基因在花粉、 萌發(fā)中的花粉管中表達(dá)的啟動(dòng)子。在文獻(xiàn)"Muschietti J,Di;rcks L,Vancanneyt G, McCormick S.(1994)LAT52 protein is essential for tomato pollen development: pollen expressi