專(zhuān)利名稱(chēng)：野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及鱗翅目l型乙酰膽堿酯酶基因在昆蟲(chóng) 細(xì)胞中的表達(dá)，以及表達(dá)產(chǎn)物的純化及在農(nóng)藥篩選和檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙酰膽堿酯酶(AChE; EC 3. 1.1.7)能催化神經(jīng)傳遞物質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，從而調(diào) 節(jié)神經(jīng)突觸間隙的乙酰膽堿水平和終止神經(jīng)沖動(dòng)傳遞，是動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一
，。它由乙酰膽堿酯酶基因(ace)編碼，是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用分子 靶標(biāo)。自從第一個(gè)乙酰膽堿酯酶基因從果蠅(&osop/n7a/ e7朋o卵"er )中克隆出來(lái)后 [Hall LM, Spierer P. The Ace locus of Z rasv9; 力iJa鵬7朋。卵ster: structural gene for acetylcholinesterase with an unusual 5， leader, EMB0 J". 1986; 5: 2949 - 2954], 多種昆蟲(chóng)的乙酰膽堿酯酶基因也相繼被報(bào)道。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，果蠅和家蠅只有一種乙酰膽堿 酯酶基因，而許多昆蟲(chóng)都有兩種類(lèi)型的乙酰膽堿酯酶基因；其中一種與果蠅和家蠅的乙酰 膽堿酯酶基因序列很相似，現(xiàn)被稱(chēng)為"2型乙酰膽堿酯酶基因(ace力"，而另一種乙酰 膽堿酯酶基因與果蠅和家蠅的乙酰膽堿酯酶基因序列差異很大，這兩種乙酰膽堿酯酶氨基 酸序列同源性在40%以下，其被稱(chēng)為"l型乙酰膽堿酯酶基因(acel)"。鱗翅目昆蟲(chóng) 中包括棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera[Brun-Barale GenBank AAY59530]、煙芽夜蛾H. assulta [LeeDW， Kim SS， Shin SW， Kim WT， Boo KS. Biochim Biophys Acta. 2006; 1760: 125-33.]小菜蛾7°/由^3 ^ZosteWa (Baek et al, 2005. Pesticide Biochemistry and Physiology 81: 164 - 175)、蘋(píng)果蠹蛾6>t//a ; o歷o/7e仏[Cassanelli， S., Reyes, M., Rault, M. ， Manicardi, G. C. and Sauphanor， B. 2006 Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (8)， 642-653]、家蠶5。/z76/7 yz7orJ' [Shang JY， Shao YM， Lang GJ， Zhang CX， Yuan G, Tang ZH. 2007. Insect Science, 6: 443-449.]等也先后報(bào)道是兩種乙酰膽堿酯酶基因。鱗 翅目昆蟲(chóng)是最大的害蟲(chóng)類(lèi)群，而1型乙酰膽堿酯酶基因在兩種類(lèi)型乙酰膽堿酯酶基因中是 占優(yōu)勢(shì)基因，其l型乙酰膽堿酯酶在農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)、新農(nóng)藥品種和新農(nóng)藥混劑開(kāi)發(fā)的體外
3有效性篩選及農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)需求。但是用鱗翅目昆蟲(chóng)頭部 乙酰膽堿酯酶費(fèi)錢(qián)費(fèi)力。
因此，利用基因工程手段生產(chǎn)具有高度生物學(xué)活性的鱗翅目的1型AChE是許多工作 努力要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。但要表達(dá)生產(chǎn)出具有高活性純的鱗翅目的AChE并不容易、除我們?cè)?嘗試表達(dá)家蠶的AChE外，還沒(méi)有其它相關(guān)成功報(bào)道。但我們表達(dá)的家蠶的AChE存在 酶活性太低，在農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)、新農(nóng)藥品種和新農(nóng)藥混劑開(kāi)發(fā)的體外有效性篩選及農(nóng)藥殘 留檢測(cè)方面還無(wú)法使用的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備野蠶(鱗翅目)l型乙酰膽堿酯酶活性蛋白 的方法，采用該方法能制備高活性的鱗翅目l型乙酰膽堿酯酶，并能將其用于新農(nóng)藥品種 和新農(nóng)藥混劑開(kāi)發(fā)的體外有效性篩選及農(nóng)藥殘留檢測(cè)等方面。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種野蠶l型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方 法，包括以下步驟
1) 、將編碼具有野蠶l型乙酰膽堿酯酶(去除32個(gè)C端氨基酸殘基)基因的核苷酸序列
可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶(鱗翅目)1型乙酰膽堿酯酶表達(dá)
pFastBac系歹喊體；
2) 、將上述步驟所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，形成野蠶l型乙酰膽堿酯酶的重 組細(xì)胞；
3) 、在適合分泌表達(dá)野蠶l型乙酰膽堿酯酶多肽的條件下，培養(yǎng)上述步驟的重組細(xì)胞;
4) 、用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶l型乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。 作為本發(fā)明的制備方法的改進(jìn)步驟3)的培養(yǎng)條件為昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)溫度為26-28'C，
用無(wú)血清昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
作為本發(fā)明的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟2)的宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞為粉紋夜蛾 Tn-5Bl-4宿主細(xì)胞。
作為本發(fā)明的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟i)的編碼具有野蠶l型乙酰膽堿酯酶的核 苷酸序列，包含編碼信號(hào)肽(以利于表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中)和所有乙酰膽堿酯 酶發(fā)揮完整功能的核苷酸序列，但去除了不利于表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外的32個(gè)C端氨基酸 殘基的編碼核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了上述方法制得的野蠶l型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的用途，用于農(nóng)藥的有效性篩選和檢測(cè)。農(nóng)藥為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑。
因此，本發(fā)明主要解決了以下幾個(gè)問(wèn)題1、外源基因在昆蟲(chóng)粉紋夜蛾Tn-5Bl-4細(xì)胞 中的表達(dá)技術(shù)，2、用procainamide親和層析柱乙酰膽堿酯酶的純化技術(shù)，3、野蠶l型乙 酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的篩選檢測(cè)。
本發(fā)明所提供的制備這種野蠶1型乙酰膽堿酯酶的表達(dá)系統(tǒng)，含野蠶1型乙酰膽堿酯 酶核苷酸的重組載體，含重組載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明所提供的一種農(nóng)藥篩選檢測(cè)的新方法，利用上述從宿主細(xì)胞中表達(dá)出的野蠶1 型乙酰膽堿酯酶活性蛋白，通過(guò)分離純化，得到了純度較高的活性蛋白。純度較高的活性 蛋白進(jìn)行農(nóng)藥篩選檢測(cè)的新方法。
在本發(fā)明中，應(yīng)用分子生物學(xué)手段克隆了桑樹(shù)鱗翅目害蟲(chóng)野蠶(5ow6;awam/fl〃'"") 浙江品系的1型乙酰膽堿酯酶基因(GenBank登錄號(hào)FJ542315)，克隆之后，利用無(wú)血 清培養(yǎng)基在昆蟲(chóng)細(xì)胞中快速穩(wěn)定高效表達(dá)，表達(dá)的蛋白分泌到無(wú)血清培養(yǎng)基中，容易純化， 純化之后蛋白具有很高的酶活性，在農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)、新農(nóng)藥品種和新農(nóng)藥混劑開(kāi)發(fā)的體外 有效性篩選及農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面具有廣泛用途。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
(1) 目前市場(chǎng)還缺乏主要害蟲(chóng)類(lèi)群鱗翅目酶源供應(yīng)，用來(lái)自于敏感家蠅頭部的 粗提酶液，不能代表鱗翅目l型乙酰膽堿酯酶，而從鱗翅目頭部提取的粗提酶液中還有夾 有2型乙酰膽堿酯酶和許多其余的雜蛋白，會(huì)干擾對(duì)酶活性的研究，所以使用純化的酶來(lái) 檢測(cè)效果要好得多。
(2) 此法應(yīng)用基因工程手段，克隆到野蠶的1型乙酰膽堿酯酶基因，利用 Bac-to-Bac桿狀病毒高效表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)此外源基因，獲得大量表達(dá)蛋白， 易純化，經(jīng)過(guò)純化后可以獲得大量的高活性蛋白。此方法只需要一次性構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)染進(jìn) 細(xì)胞，獲得重組病毒之后就可以不斷地表達(dá)目的蛋白。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 圖1為野蠶1型乙酰膽堿酯酶基因在Tn-5Bl-4細(xì)胞中的表達(dá)和純化分析圖； M:標(biāo)準(zhǔn)分子量；Ll:分泌到培養(yǎng)基中1型乙酰膽堿酯酶；L2: Tn-5Bl-4細(xì)胞中
1型乙酰膽堿酯酶；L3:對(duì)照病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)基；L4:對(duì)照病毒感染細(xì)胞；L5:純化
1型乙酰膽堿酯酶。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明中的"分離的"、"純化的"或"基本純的"DNA 是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)；還指該DNA或片 段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"野蠶1型乙酰膽堿酯酶蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有野蠶 l型乙酰膽堿酯酶蛋白(或多肽)的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與野蠶1型乙酰膽堿酯酶相同功能的蛋白的序列的變異形 式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5' 和/或3'端添加數(shù)個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，"基本純的"蛋白質(zhì)或多肽是指其占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳地至 少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的 方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層折、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜?含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"野蠶1型乙酰膽堿酯酶蛋白多肽"指具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶 蛋白活性的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與野蠶1型乙酰蛋白膽堿酯酶蛋白相同功能的序列的 變異形式例如氨基酸同源性>95的其它鱗翅目1型乙酰膽堿酯酶等鱗翅目昆蟲(chóng)1型乙酰膽 堿酯酶蛋白。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相 似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括野蠶1型乙酰膽堿酯酶 蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導(dǎo)突變體，在高或 低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與野蠶1型乙酰膽堿酯酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利 用抗野蠶1型乙酰膽堿酯酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
本發(fā)明還包括檢測(cè)家野蠶(鱗翅目)l型乙酰膽堿酯酶核苷酸序列的方法，該樣品是 PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于家野蠶(鱗翅目)l型乙酰膽堿酯酶多肽的編 碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長(zhǎng)度一般為15——50個(gè)核苷酸。
本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括Tn-5Bl-4細(xì)胞、Bm細(xì)胞等昆蟲(chóng)細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)野蠶l型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的純化，指將表達(dá)的野蠶 1型乙酰膽堿酯酶從真核宿主細(xì)胞中和培養(yǎng)基分離純化出來(lái)，獲得大量純化活性蛋白，應(yīng) 用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的篩選檢測(cè)。
本發(fā)明的活性蛋白制備可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行制備。 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、野蠶1型乙酰膽堿酯酶基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物純化 在該實(shí)施例中，
RT-PCR反應(yīng)中使用的5'寡核苷酸引物序列為
Bmmd-ace 1F 5 ，-AAGCTTATGCGCGTGGTGTTGGCAGC-3 ，，
3，端引物序列為Bmmd-flcelR (5，-CTCGAGTTAATTCGTACAATTCTTCGGC-3，)。
具體如下
SEQIDNO: 1的信息
(I) 序列特征
(A) 長(zhǎng)度26堿基
(B) 類(lèi)型:核酸
(C) 鏈性單鏈 (D)拓?fù)洌痪€(xiàn)性
(II) 分子型寡核苷酸 (m)序列描述SEQIDNO: 1
5，-AAGCTTATGCGCGTGGTGTTGGCAGC隱3，。 SEQIDNO: 2的信息
(I) 序列特征
(A) 長(zhǎng)度28堿基
(B) 類(lèi)型核酸
(C) 鏈性單鏈 (D)拓?fù)?；線(xiàn)性
(II) 分子型寡核苷酸
7(III)序列描述SEQIDNO: 2 (5，陽(yáng)CTCGAGTTAATTCGTACAATTCTTCGGC-3，)
5'端引物含有HindlII酶切位點(diǎn)，3'端引物含有XhoI酶切位點(diǎn)。該對(duì)引物擴(kuò)增出的野蠶 l型乙酰膽堿酯酶基因序列，包含編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，以利于表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng) 基中，包含了所有乙酰膽堿酯酶的發(fā)揮完整功能的編碼序列，但去除了會(huì)將表達(dá)產(chǎn)物錨定 于細(xì)胞膜從而不利于表達(dá)產(chǎn)物分泌的32個(gè)C端氨基酸殘基 (SVSSLWPSRKALSFNVIATAALTGTSLFKYTI)的編碼核苷酸序列。
從四齡野蠶幼蟲(chóng)整體提取總RNA并按常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR條件為94 °C 3 min，接下來(lái)31循環(huán)為94 。C變性30 sec， 53。C退火30 sec和72 °C延伸2 min，最后一步 72 'C延伸10 min。 PCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-18T載體(Takara公司產(chǎn)品)并測(cè)序列 確定。
引物上限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)移載體pFastbacl上的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位 點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gmr)， 一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(Ori)、 一個(gè)病毒復(fù)制 起點(diǎn)(SV40)、 一個(gè)T7啟動(dòng)子、 一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)， 一個(gè)SV40啟動(dòng)子、 一個(gè)SV40 加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、 一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用JWw/ /和歷"d III消化pFastBacl及插入片段，隨后用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化￡. co/Z TG1 菌株(Stratagene公司產(chǎn)品)，在含有Ampf和Gm的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，補(bǔ)加Ampf 和Gmr的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證野蠶 1型乙酰膽堿酯酶基因cDNA片段已正確插入了載體。隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化co// DH10Bac菌株(Invitrogen公司產(chǎn)品)，在含有Amp\ Gmf、四環(huán)素的LB培養(yǎng)皿上37 'C培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Ampf、 Gn/、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)含所需構(gòu)建物 的克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)Sepharose2B柱純化，回收質(zhì)粒-7(TC保存。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tn-5Bl-4細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清，含 重組病毒粒子的細(xì)胞上清用于下一輪感染。感染重組病毒的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基SF express medium (GIBCO公司產(chǎn)品)培養(yǎng)。培養(yǎng)96-120小時(shí)后收集培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基； 40g的硫酸銨，飽和度為40%，劇烈振蕩后放置4i:保存。4'C以4000rpm離心20min， 棄上清；用25mMPBpH7.0 + 0.02。/。NaN3懸浮沉淀；4°C以4000 rpin離心20 min，收集 上清，酶比活力測(cè)定。同時(shí)用0.45um的膜對(duì)上清過(guò)濾。4'C以1 mL/min速度把樣品注射 入procainamide親和層析柱；用25 mM PB pH 7.0將未結(jié)合于親和層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫
8下來(lái)；再用procainamide把親和層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，最后對(duì)樣品進(jìn)行部份收集， 每管收集5mL;測(cè)定每管樣品酶的比活力。最后將具有較高酶活力的各管樣品集中在一 起，并測(cè)定酶比活力。然后以25MmPBS(PH7. O)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最 后凍干保存。用10X的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為73kDa， 具體如圖1所示。
實(shí)施例2、野蠶1型乙酰膽堿酯酶酶活的測(cè)定
純化蛋白的活力測(cè)定采用Ellman方法[Ellman GL， Courtney KD, Andres V， Featherstone RM., 1961 Biochem. Pharmacol., 7: 88-95]。
反應(yīng)液含180 pi (0.1 M)磷酸緩 沖液(pH8.0)禾卩碘化硫代乙酰膽堿(ATC， acetylthiocholine iodide, 1 mM), DTNB (5, 5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid, 0.1 mM)及20^1酶。反應(yīng)液在25。C下放置5 min,用Tecaa Genios多功能酶標(biāo)儀在405 nm光波下測(cè)定OD,計(jì)算AChE酶活。酶對(duì)ATC的i^為5.1士0.6 (拜ol'U1) ， Fmax為57.5士1.2 0unol/mgprotein/min)。表明純化的蛋白具有很高的底物專(zhuān) 一性和單位酶活力。而我們已經(jīng)報(bào)道家蠶同一基因表達(dá)產(chǎn)物的酶活^ax僅為30.5 nmo
/mg.pro/min (Shangeta1,2007)，重組野蠶l型乙酰膽堿酯酶是家蠶的AChEl的近2000倍。 實(shí)例3、農(nóng)藥乙酰膽堿酯酶抑制中濃度的測(cè)定
乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定，參考ZhuKY和Clark JM (Pestic Biochem Physiol 1995, 51: 57-67)方法?？傮w積200nL反應(yīng)體系中含有1(^L酶，10pL碘化硫代乙酰膽堿和180pL磷 酸緩沖液(含有DTNB)，在酶標(biāo)板加樣孔中依次加入酶液、不同濃度的碘化硫代乙酰膽堿 溶液和顯色液，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量，在405nm，每隔30'讀一次光密度，共記錄10個(gè) 值，重復(fù)三次。抑制中濃度的測(cè)定是將酶液與以不同濃度稀釋的殺蟲(chóng)劑液混勻于酶標(biāo)板加 樣孔中，25。C下放置5min，領(lǐng)!l定乙酰膽堿酯酶的剩余活力。計(jì)算方法為，以乙酰膽堿酯 酶活力抑制率的機(jī)率值為縱座標(biāo)，以殺蟲(chóng)劑(對(duì)氧磷)濃度對(duì)數(shù)為橫座標(biāo)，得一直線(xiàn)并計(jì) 算求得線(xiàn)性回歸方程，取機(jī)率值為5求得抑制酶50%活力時(shí)的殺蟲(chóng)劑濃度對(duì)數(shù)，反對(duì)數(shù)即 得抑制中濃度(150)。測(cè)定結(jié)果為殘殺威、滅多威、克百威敵敵畏和對(duì)氧磷等殺蟲(chóng)劑對(duì)純 化的重組乙酰膽堿酯酶酶液的抑制中濃度分別為1.6 ±0.08、 0.15 ±0.01、 13.1 ±0.65、 0.3 ± 0.02和0.01 ± 0.001 (1(T4M)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
9<formula>formula see original document page 10</formula>
權(quán)利要求
1、一種野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)、將編碼具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶并去除32個(gè)C端氨基酸殘基的基因的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶1型乙酰膽堿酯酶表達(dá)pFasBac系列載體；2)、將上述步驟所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，形成野蠶1型乙酰膽堿酯酶的重組細(xì)胞；3)、在適合分泌表達(dá)野蠶1型乙酰膽堿酯酶多肽的條件下，培養(yǎng)上述步驟的重組細(xì)胞；4)、用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的野蠶l型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述 步驟3)的培養(yǎng)條件為昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)溫度為26-28'C，用無(wú)血清昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述 步驟2)的宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞為粉紋夜蛾Tn-5B14宿主細(xì)胞。
4、 如權(quán)利要求l、 2或3所述方法制得的野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的用途，用于農(nóng)藥 的有效性篩選和檢測(cè)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的用途，其特征在于所述農(nóng)藥 為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法，包括以下步驟1)將編碼具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶并去除32個(gè)C端氨基酸殘基的基因的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶1型乙酰膽堿酯酶表達(dá)pFasBac系列載體；2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，形成野蠶1型乙酰膽堿酯酶的重組細(xì)胞；3)在適合分泌表達(dá)野蠶1型乙酰膽堿酯酶多肽的條件下，培養(yǎng)上述重組細(xì)胞；4)用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。該野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白可用于農(nóng)藥的有效性篩選和檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101487014SQ20091009534
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日
發(fā)明者張傳溪, 郎國(guó)竣 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)