專利名稱：編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物基因技術(shù)領(lǐng)域的基因序列，具體涉及一種編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列。
背景技術(shù)：
在多細(xì)胞動(dòng)物中，乙酰膽堿酯酶(簡(jiǎn)稱AChE)位于神經(jīng)元間、神經(jīng)元與肌肉細(xì)胞間的化學(xué)突觸上，是主要的信號(hào)傳遞分子，行使水解膽堿酯的功能。研究表明，多種化合物可抑制AChE活性，導(dǎo)致有機(jī)體類膽堿代謝途徑過(guò)度，膽堿酯不能被有效水解，大量積累于神經(jīng)末梢，有機(jī)體表現(xiàn)出肌肉抽搐，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等癥狀，嚴(yán)重者甚至死亡。在眾多抑制劑中，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類被認(rèn)為是AChE的專性抑制劑，它們可使昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE的絲氨酸羥基基團(tuán)發(fā)生磷酸化或甲氨?；?，從而AChE失去活性，不能迅速水解乙酰膽堿，致使昆蟲(chóng)死亡，因而被大量用作農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。農(nóng)產(chǎn)品表面殘留的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類是否抑制人體神經(jīng)系統(tǒng)的AChE，對(duì)人體產(chǎn)生危害？這一問(wèn)題隨著人民食品安全意識(shí)的普遍提高正受到研究人員的關(guān)注。人體主要存在兩種膽堿酯酶，AChE和丁酰膽堿酯酶(簡(jiǎn)稱BuChE)。AChE除主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，還結(jié)合于紅血細(xì)胞表面，BuChE主要分布在血清中。當(dāng)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類侵入機(jī)體時(shí)，這些分散在循環(huán)系統(tǒng)中的膽堿酯酶優(yōu)先結(jié)合它們，從而使神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE免受磷酸化的威脅。然而，若抑制劑含量超出機(jī)體可耐受范圍，充當(dāng)信號(hào)傳遞分子的AChE將被破壞。
農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有兩大類-色譜檢測(cè)法和快速檢測(cè)法。色譜檢測(cè)法因?yàn)槠浔O(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的精確性和準(zhǔn)確性可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供有力的參考依據(jù)。但其操作程序復(fù)雜、需要高技術(shù)專業(yè)檢測(cè)人員，檢測(cè)儀器和費(fèi)用都相當(dāng)昂貴。快速檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便、不需昂貴儀器，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及大批樣品的篩選檢測(cè)，主要用來(lái)防止有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜和水果流入市場(chǎng)。其中應(yīng)用最為廣泛的是酶抑制法，原理即是乙酰膽堿酯酶的活性受有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)一些公司已研制出酶抑制法檢測(cè)儀器和試紙，并在一些城市的市場(chǎng)中推廣應(yīng)用。這表明，我國(guó)的農(nóng)藥生物學(xué)檢測(cè)手段已不再依賴于國(guó)外進(jìn)口的試劑盒。不足的是，這些產(chǎn)品使用的酶原料主要是生物體的蛋白提取液，除AChE外，其它蛋白也存在其中，這在很大程度上影響了檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性；同時(shí)，酶原料的多少受限于供體生物的數(shù)量，這極大地限制了這些產(chǎn)品的大量生產(chǎn)應(yīng)用。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，美國(guó)專利相關(guān)報(bào)道US Patent No.6770799，Expression of recombinant human Acetylcholinesterase in transgenic plants(美國(guó)專利號(hào)6770799，人源性乙酰膽堿脂酶在轉(zhuǎn)基因植物中的重組表達(dá))；USPatent No.5595903，Genetically engineered human Acetylcholinesterase(美國(guó)專利號(hào)5595903，基因工程人源性乙酰膽堿脂酶)。研究者利用這些重組蛋白注射老鼠、豚鼠和靈長(zhǎng)類，證明其在有機(jī)磷中毒事件中取得了良好的預(yù)防與治療效果。關(guān)于果蠅AChE基因的重組表達(dá)、以及在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用，國(guó)外自90年代起已開(kāi)展了大量研究工作，但至今未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題密切聯(lián)系的文獻(xiàn)與專利的報(bào)道。不同生物來(lái)源的AChE對(duì)抑制劑的敏感程度不同。果蠅的AChE發(fā)生磷酸化與甲氨酰化的速度高于其它生物的酶，也就是說(shuō)，它對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是最為敏感的。因此，它是農(nóng)藥殘留檢測(cè)的理想生物學(xué)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種編碼果蠅AChE蛋白的核苷酸基因序列。使其在酵母細(xì)胞中得到高效表達(dá)，蛋白分泌至培養(yǎng)液中，易于分離純化，為檢測(cè)農(nóng)藥殘留提供了優(yōu)良的基因工程酶；進(jìn)一步在甲醇酵母中表達(dá)對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感的AChE蛋白，為開(kāi)發(fā)農(nóng)藥生物學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品提供豐富的蛋白原料。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明編碼具有AChE活性的蛋白質(zhì)，且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5相同。所述的編碼，果蠅AChE蛋白的信號(hào)肽與糖磷脂錨定信號(hào)的核苷酸被切除，且剩余的核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同。
所述的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.7相同。
米氏常數(shù)Km＝12.3±3.7μM，近似于從果蠅提取的AChE的Km值(17.0±3μM)。
提取果蠅總RNA，以oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄獲得果蠅總cDNA。以果蠅總cDNA為模板，用引物1(核苷酸序列與SEQ ID NO1相同)和引物2(核苷酸序列與SEQ ID NO2相同)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得AChE的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，為1950bp。將果蠅AChE cDNA與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含AChE cDNA的大腸桿菌克隆。以抽提大腸桿菌的質(zhì)粒pT-AChE為模板，用引物3(核苷酸序列與SEQ ID NO3相同)和引物4(核苷酸序列與SEQ ID NO4相同)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得切除信號(hào)肽序列及糖磷脂錨定序列后的AChE cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，為1749bp。用限制性內(nèi)切酶ECoR1與Not1酶切改造后的AChE cDNA和酵母表達(dá)載體pPIC9K，連接兩者酶切后的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含改造后的AChE cDNA的大腸桿菌克隆。
甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9K-AChE，含有與SEQ ID NO6相同的核苷酸序列，且含有該表達(dá)載體的甲醇酵母可表達(dá)果蠅乙酰膽堿酯酶，并將乙酰膽堿酯酶分泌至酵母培養(yǎng)液中。抽提大腸桿菌的重組質(zhì)粒pPIC9K-AChE，用限制性內(nèi)切酶Sal1酶切，使其線性化。線性化質(zhì)粒pPIC9K-AChE-L電轉(zhuǎn)化甲醇酵母GS115，獲得重組菌株。以甲醇誘導(dǎo)甲醇酵母重組菌株表達(dá)乙酰膽堿酯酶，收集培養(yǎng)液，通過(guò)測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性，在1000個(gè)重組子中篩選出表達(dá)0.307U/mg乙酰膽堿酯酶的菌株AChE*-GS115。以甲醇誘導(dǎo)甲醇酵母菌株ACHE*-GS115表達(dá)乙酰膽堿酯酶，離心收集培養(yǎng)液，濃縮脫鹽，得到乙酰膽堿酯酶粗酶液。
通過(guò)測(cè)定粗酶液活性，計(jì)算重組蛋白的Km值；計(jì)算敵敵畏，樂(lè)果，毒死蜱，抗蚜威對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制常數(shù)Ki。
以下進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)術(shù)語(yǔ)作出說(shuō)明1.外源基因插入酵母基因組外源DNA轉(zhuǎn)化甲醇酵母時(shí)，經(jīng)線性化處理的該DNA片段將在酵母基因組的同源區(qū)域重組，使酵母的某一營(yíng)養(yǎng)表型恢復(fù)，產(chǎn)生重組菌株。與重組有關(guān)的酵母基因組區(qū)域有兩個(gè)AOX1區(qū)和his4區(qū)。
(1)外源基因在his4基因區(qū)的單點(diǎn)插入，外源基因插入到his4基因座中，載體中HIS4表達(dá)框的一部分序列與基因組his4基因的一部分結(jié)合，組成可表達(dá)組氨醇脫氫酶的表達(dá)框。由于這種基因重組未涉及AOX1基因區(qū)，該重組子的表型是Mut+。
(2)外源基因在AOX1基因區(qū)的單點(diǎn)插入，外源基因插入到AOX1基因座的3’端，可產(chǎn)生Mut+表型的重組子。同時(shí)，外源片段也可插入到AOX1基因座的5’端，這取決于線性化DNA時(shí)所用的酶。環(huán)狀DNA亦可插入酵母基因組中，但頻率很低。
(3)外源基因在基因組中的多拷貝插入。多拷貝插入是自發(fā)產(chǎn)生的，在AOX1基因座或his4基因座上皆可發(fā)生，它的頻率較低，一般占所獲得重組子的1-10％。
(4)外源基因替換基因組中AOX1基因區(qū)插入或替換由線性化外源DNA所用的酶決定。對(duì)于pPIC9K，SacI酶切后的DNA將插入AOX1基因座，SalI酶切后的DNA將插入his4基因座，而DraI酶切后的DNA則會(huì)替換AOX1基因座。與插入不同，替換發(fā)生時(shí)整個(gè)AOX1基因座完全被外源基因替代，其表型是Muts。
2.甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)——誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白甲醇酵母體內(nèi)，AOX1基因和AOX2基因皆編碼產(chǎn)生醇氧化酶(簡(jiǎn)稱AOX)，這是甲醇代謝途徑的關(guān)鍵酶。其中，AOX1基因啟動(dòng)子專一性受甲醇誘導(dǎo)，產(chǎn)生的AOX可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白的30％，含量很高，這使得甲醇酵母能在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)。AOX1啟動(dòng)子后接外源基因時(shí)，外源基因在甲醇以外的碳源(如葡萄糖、甘油或乙醇)中處于非表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)在培養(yǎng)液中加入甲醇后，即被誘導(dǎo)表達(dá)。AOX1與AOX2的同源性達(dá)97％，但后者產(chǎn)物代謝甲醇的活性很弱，這一特征被用于分離Muts表型的菌株。
3.Ellman方法測(cè)定AChE活性AChE可水解乙酰硫代膽堿，生成硫代膽堿和乙酸鹽。硫代膽堿還原二硫二硝基苯甲酸形成硝基苯甲酸鹽，這種黃色物質(zhì)在405nm具吸收峰值。這是AChE活性測(cè)定的通用方法，有機(jī)磷或氨基甲酸酯抑制了AChE活性，其抑制程度也可根據(jù)該方法計(jì)算出。
4.酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(1)米氏常數(shù)Km米氏常數(shù)即為反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的作用物濃度。它是酶的特征性常數(shù)，表示酶與作用物的親和力大小。Km越大，酶與作用物的親和力越小。這個(gè)常數(shù)可以通過(guò)反應(yīng)速度及作用物濃度的雙倒數(shù)作圖獲得。
(2)抑制常數(shù)Ki酶抑制劑分為兩類不可逆抑制劑與可逆性抑制劑。有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥被認(rèn)為是AChE的不可逆抑制劑，它們使AChE活性中心的絲氨酸發(fā)生磷酸化或甲氨酰化，抑制機(jī)制可表示為
E酶，PX抑制劑，X抑制劑中除有機(jī)磷或氨基甲酸酯外的基團(tuán)。Ki表示酶被抑制的程度。有機(jī)磷或氨基甲酸酯抑制AChE的模型公式如下[E][E0]=([PX0]-[E0])e-Kit([PX0]-[E0])[PX0]-[E0]e-Kit([PX0]-[E0])]]>t代表酶與抑制劑反應(yīng)的時(shí)間；[PX0]和[E0]分別是抑制劑與酶的初始濃度；[E]代表酶在反應(yīng)不同時(shí)間后的殘余濃度。
本發(fā)明獲得了含果蠅乙酰膽堿酯酶cDNA的大腸桿菌克隆，在此基礎(chǔ)上，獲得了含改造后的果蠅乙酰膽堿酯酶cDNA的大腸桿菌克隆，將乙酰膽堿酯酶基因插入甲醇酵母GS115基因組后，本發(fā)明在1000個(gè)重組子中篩選獲得了可表達(dá)活性為0.307U/mg乙酰膽堿酯酶的酵母重組子AChE*-GS115。1個(gè)酶單位定義為在室溫(25℃)，一分鐘內(nèi)水解1mM底物的酶量。1M發(fā)色團(tuán)DTNB的消光系數(shù)＝13.6×104。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，AChE*-GS115表達(dá)的乙酰膽堿酯酶分泌在酵母培養(yǎng)液中。而不同抑制劑對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制常數(shù)不相同，說(shuō)明抑制劑的抑制能力不同(表1)。這表明，甲醇酵母表達(dá)的乙酰膽堿酯酶可被用于有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)。此外，重組乙酰膽堿酯酶還可為農(nóng)藥殘留檢測(cè)生物傳感器、試紙條的研制等提供靈敏的生物學(xué)材料。
表1 甲醇酵母表達(dá)的重組AChE蛋白受各種抑制劑抑制的抑制常數(shù)




圖1本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2以引物1(核苷酸序列與SEQ ID NO1相同)和引物2(核苷酸序列與SEQ ID NO2相同)擴(kuò)增含果蠅AChE cDNA的大腸桿菌所產(chǎn)生的片段。泳道1DNA分子量標(biāo)記；泳道2擴(kuò)增陽(yáng)性克隆產(chǎn)生的目的片段，1950bp。
圖3用限制性內(nèi)切酶ECoR 1和Sal 1酶切質(zhì)粒pPIC9K-AChE，鑒定含改造后的果蠅AChE cDNA的大腸桿菌克隆。泳道1pPIC9K質(zhì)粒，酶切后有2.0kb片段切出；泳道2pPIC9K-AChE質(zhì)粒，酶切后有3.7kb片段切出；泳道3DNA分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作出詳細(xì)具體的描述1.實(shí)驗(yàn)材料1.1黑腹果蠅黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室。
1.2菌株與質(zhì)粒大腸桿菌和酵母菌株由上海農(nóng)科院生物中心基因工程實(shí)驗(yàn)室提供。
甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9K由上海農(nóng)科院生物中心基因工程實(shí)驗(yàn)室提供，大腸桿菌載體pMD18-T購(gòu)自日本TAKARA公司。
1.3引物、酶與試劑PCR引物由上海博亞生物公司合成，詳細(xì)序列信息見(jiàn)SEQ ID NO1-4；限制性內(nèi)切酶、PyrobestTM DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自日本TAKARA公司；Trizol試劑盒購(gòu)自北京塞百盛基因技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自杭州V-gene生物技術(shù)公司；
YNB購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)公司；Ellman試劑成分(Acetylthiocholine iodide，DTNB)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇、山梨醇、甘油、各種氨基酸等生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。
2.操作過(guò)程2.1提取果蠅總RNA，并用Oligo-dT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄按TRIZOL方法(Molecular Research Center，Inc.，USA)提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。取1-5μg果蠅總RNA，與1μl 10mM的oligodT引物混合，加Rnase free水至20μl總體積，80℃保溫5min，然后置于冰上；加入4μl 5×Reaction Buffer，2μl 10mM dNTP，1μl RNase inhibitor，37℃溫育5min，置于冰上；加入1μl Reverse Transcriptase，42℃溫育30-60min；最后80℃保溫10min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為果蠅總cDNA的第一條鏈。
2.2PCR擴(kuò)增在無(wú)菌PCR管中加入5μl 10×PyrobestTM PCR緩沖液，5μl 2mM 4dNTPs，20μM上游及下游引物各1μl，模板DNA，2U PyrobestTM DNA聚合酶，加水至50μl總體積，最后加適量礦物油以防止蒸發(fā)。反應(yīng)條件如下94℃，3min；94℃30sec，56℃30Sec，72℃2min(退火溫度及延伸時(shí)間根據(jù)引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不同作相應(yīng)改變)，30個(gè)循環(huán)；終延伸72℃10min。
反應(yīng)結(jié)束后，在PCR體系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃1h。
2.3TBE-瓊脂糖凝膠電泳和回收PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠(含10ng/ml EB)電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束，將凝膠置于紫外分析儀內(nèi)，切取含PCR產(chǎn)物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒回收，PCR產(chǎn)物最終溶于25-30μl的Eluent Buffer中。
2.4DNA連接反應(yīng)在無(wú)菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4 DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR產(chǎn)物，0.25μl pMD18-T載體，1μl T4 DNA連接酶，總體積為10μl。將各組分混勻，4℃中連接16h。當(dāng)PCR產(chǎn)物與載體DNA片段通過(guò)酶切形成的互補(bǔ)粘端相連時(shí)，兩者之間的質(zhì)量比為5∶1。
2.5制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞在LB平板上劃線接種大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用接種環(huán)挑取10-12個(gè)單菌落(2-3mm直徑)，接種于250mL的SOB培養(yǎng)液中。振蕩培養(yǎng)(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細(xì)胞。用80ml預(yù)冷的TB溶液重懸細(xì)胞，冰浴10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細(xì)胞。用20ml預(yù)冷的TB輕輕地重懸細(xì)胞，加入DMS0至終濃度7％，輕輕混勻，置于冰上。10min后，按每管500μl分裝細(xì)胞懸液于無(wú)菌的eppendorf管中。用液氮快速冷凍，儲(chǔ)存于-70℃。
2.6DNA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受態(tài)細(xì)胞與10μl的DNA連接產(chǎn)物，手指輕彈管壁，混勻混合物。冰浴30min。42℃，溫育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培養(yǎng)液，37℃，劇烈振蕩混合液1h。將混合液涂布在選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
2.7DNA序列分析采用ABI377型測(cè)序儀(購(gòu)自美國(guó)ABI公司)測(cè)定DNA序列，用PCGENE軟件分析序列，由上海博亞生物公司完成。
2.8小量制備質(zhì)粒DNA從培養(yǎng)基平板上挑取含目的質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(37℃，200rpm，)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4℃，13000rpm，30sec)，倒去上清，收集菌體，將離心管倒扣在紙巾上，晾干管壁上的殘余液滴。加入100μl預(yù)冷的溶液I，劇烈震蕩，懸浮菌體；加入200μl新鮮的溶液II，將蓋關(guān)閉，迅速顛倒5次，混勻混合物，注意不要旋轉(zhuǎn)離心管；加入150μl溶液III，將蓋關(guān)閉，顛倒數(shù)次，使溶液III均勻分散在粘稠的菌裂解液中，冰浴3-5min。離心(4℃，13000rpm，5min)，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，常溫放置10min，離心(4℃，13000rpm，5min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，將蓋關(guān)閉，顛倒數(shù)次，離心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數(shù)分鐘，待管壁上的殘余乙醇液滴完全揮發(fā)，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉淀，37℃保溫30min，DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.9限制性內(nèi)切酶酶切DNA
酶切反應(yīng)參照限制性內(nèi)切酶試劑盒(購(gòu)自TAKARA公司)說(shuō)明書(shū)中的具體操作進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，回收操作與PCR產(chǎn)物回收相同。
2.10線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化甲醇酵母在50ml三角瓶中加入5ml YPD，將GS115酵母單菌落接種其中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(30℃，200rpm)。取0.1-0.5ml菌液，接種在100ml新鮮培養(yǎng)液中，再次劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，至OD600＝1.3-1.5。離心(4℃，5000rpm，5min)，用100ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸細(xì)胞沉淀。離心(4℃，5000rpm，5min)，用50ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸細(xì)胞沉淀。離心(4℃，5000rpm，5min)，用4ml預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞沉淀。離心(4℃，5000rpm，5min)，用200μl預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞沉淀。
取80μl經(jīng)上述處理的酵母細(xì)胞懸液，與線性化質(zhì)粒(5-20μg)混合。將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。冰上放置5min。用電轉(zhuǎn)化儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(參數(shù)2KV，200Ω，25μF)。在電轉(zhuǎn)化杯中迅速加入1ml預(yù)冷的1M山梨醇，顛倒數(shù)次，以混勻細(xì)胞，冰浴數(shù)分鐘，取250μl等份，涂布于MD平板，溫育(30℃，3-4d)至菌落出現(xiàn)。
2.11誘導(dǎo)甲醇酵母細(xì)胞表達(dá)AChE蛋白即使在同一個(gè)轉(zhuǎn)化事件中，外源基因也可能以多種形式發(fā)生重組，不同的重組子表達(dá)外源蛋白的效率不同。實(shí)驗(yàn)中，挑選1000個(gè)酵母重組子，誘導(dǎo)其表達(dá)AChE，篩選表達(dá)水平高的重組子。為保證表達(dá)活力，從平板上挑取新鮮的單菌落，或從-70℃凍存的菌種中挑取一部分培養(yǎng)。誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)過(guò)程如下從MD平板上挑取單菌落，接種于25ml的BMGY中，振蕩培養(yǎng)(28℃，250rpm)，至OD600＝2(約18h)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。離心(室溫，5000rpm，5min)，收集細(xì)胞。用50ml BMMY重懸細(xì)胞沉淀，至OD600＝1。將菌液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)三角瓶，用兩層紗布蓋住瓶口，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。為持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，每24h補(bǔ)充甲醇，終濃度為0.5％。為確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間，分別在誘導(dǎo)后第48、72、96、120、144小時(shí)，收集500μl培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，離心(室溫，13000rpm，2min)，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管。所有樣品用液氮快速冷凍后，保存于一70℃。
2.12用Ellman方法檢測(cè)AChE活性吸取50μl酵母培養(yǎng)液，加入96孔酶標(biāo)板的對(duì)應(yīng)微孔中，25℃，放置5min。在孔中加入250μl Ellman試劑(1mM AsCh，0.3mM DTNB，0.1M磷酸鈉緩沖液)，混勻，立即將96孔板置于酶標(biāo)儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-tech公司)中，測(cè)定405nm波長(zhǎng)下前3min吸光值的變化(ΔOD/min)。陰性對(duì)照是以50μl的磷酸緩沖液代替酵母培養(yǎng)液。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的收集樣品平行測(cè)定2次。
2.13提取AChE粗酶液挑取新鮮的AChE*-GS115單菌落，在100ml BMMY培養(yǎng)液中持續(xù)誘導(dǎo)AChE表達(dá)144h。離心(4℃，13000rpm，5min)，收集上清。用0.22μm的濾膜過(guò)濾上清，除去殘留的酵母細(xì)胞。將上清轉(zhuǎn)移至半透膜中，兩端以袋夾夾緊，放入表面皿，在膜的上表面及兩側(cè)撒上適量的聚乙二醇粉末，8h后，由于聚乙二醇的吸水性，培養(yǎng)液的大多數(shù)水分子被吸出半透膜，培養(yǎng)液被濃縮10倍。將盛有濃縮液的半透膜轉(zhuǎn)移至Tris緩沖液(0.1M，pH7.4)，透析(4℃，2-3h)，即得濃縮脫鹽的AChE粗酶液。
2.14計(jì)算重組AChE蛋白的米氏常數(shù)Km將六個(gè)濃度(0.05，0.1，1，5，10，50mM)的AsCh，分別與五個(gè)濃度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，25℃，測(cè)定酶的反應(yīng)速度，計(jì)算Km值。
2.15計(jì)算重組AChE蛋白的抑制常數(shù)Ki將三個(gè)不同濃度(10-6，10-8，10-10M)的抑制劑與五個(gè)不同濃度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，分別在兩者反應(yīng)的第15sec、1min、3min、5min，10min、15min、20min、30min時(shí)收集等量混合液，25℃，以1mM AsCh測(cè)定其殘余酶的濃度，最后計(jì)算Ki值。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件和具體技術(shù)要求進(jìn)一步結(jié)合具體實(shí)施闡述本發(fā)明。這些實(shí)施僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1——酵母表達(dá)的重組AChE蛋白的活性受微量敵敵畏的抑制1.溶液、試劑(1)BMGY溶液在700ml水中溶解10g酵母提取物與20g蛋白胨，高壓滅菌(20min)；溶液溫度降至室溫后，分別加入100ml磷酸鉀緩沖液(1M，pH6.0)、100ml10×YNB、2ml 500×B、100ml 10×GY；溶液在4℃的保質(zhì)期為兩個(gè)月。
(2)BMMY溶液將BMGY溶液中的10×GY換為10×M，其余成分不變。溶液在4℃的保質(zhì)期為兩個(gè)月。
(3)敵敵畏溶液稱量0.11g敵敵畏(MW＝220.98)晶體，溶于5ml丙酮中，此時(shí)敵敵畏濃度為0.1M。以10的倍數(shù)逐級(jí)稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
(4)Ellman試劑稱量0.426g Na2HPO4(MW＝142)溶于30mL水中，調(diào)節(jié)pH＝7.0，配制成100mM磷酸鈉溶液；稱量0.0396g DTNB溶于10mL Na2HPO4溶液中，加入15mg NaHCO3，混勻后，用鋁箔包裹，避光。配制好后置于冰上，使用時(shí)間不超過(guò)一天；稱量0.0217g ACThI，溶于1mL水中，用鋁箔包裹，避光。配制好后置于冰上，使用時(shí)間不超過(guò)一天。按15mL∶500uL∶200uL混合磷酸鈉溶液、DTNB與ACThI溶液，即得Ellman試劑。
2.操作步驟(1)挑取新鮮的AChE*-GS115單菌落，接種于25ml的BMGY液中，振蕩培養(yǎng)(28℃，200rpm)。
(2)18h后，離心(室溫，5000rpm，5min)，收集菌體，倒去上清，用50ml BMMY液懸浮菌體，用兩層紗布封住三角瓶瓶口，振蕩培養(yǎng)(28℃，250rpm)。每隔24h，向培養(yǎng)液中加入甲醇，終濃度為0.5％。在第144h，收集菌液，離心(4℃，12000rpm，10min)，將上清(45ml)轉(zhuǎn)移至無(wú)菌三角瓶中，置于冰上。
(3)取出一段無(wú)菌的半透膜，一端用夾子夾緊，將全部上清倒入膜內(nèi)，再夾緊另一端，確認(rèn)沒(méi)有液體滲漏后，把它放入表面皿中，在膜的上下表面鋪撒聚乙二醇，靜置(4℃，8h)，用水沖洗膜表面殘留的聚乙二醇后，將它放入500ml的Tris緩沖液(0.1M，pH7.4)，透析(4℃，3h)，打開(kāi)一端的夾子，用移液器吸取膜內(nèi)粗酶液，按1ml/管分裝在無(wú)菌Eppendorf管中，取1管，在冰上放置，其余用液氮速凍，保存于-70℃，備用。
(4)用丙酮溶解敵敵畏晶體，配制成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的酶標(biāo)板孔中，輕輕搖動(dòng)以混勻，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處3min內(nèi)樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對(duì)照組)，分別測(cè)定三次，取平均值。
(5)按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計(jì)算酶受敵敵畏抑制的抑制率。其中，Ri代表抑制率，ΔA0代表活性未受抑制的酶引起的吸光度變化值，ΔA代表酶受抑制后引起的吸光度變化值。
結(jié)果表明，低濃度的敵敵畏對(duì)AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表2所示。
表2 甲醇酵母表達(dá)的重組AChE蛋白受敵敵畏抑制的抑制率(％)

實(shí)施例2——酵母表達(dá)的重組AChE蛋白的活性受微量毒死蜱的抑制1.溶液(1)毒死蜱溶液稱量0.175g毒死蜱(MW＝350.6)晶體，溶于5ml丙酮中，此時(shí)毒死蜱濃度為0.1M。以10的倍數(shù)逐級(jí)稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、試劑配方同實(shí)施例1。
2.操作步驟操作與實(shí)施例1基本相同。用丙酮溶解毒死蜱晶體，配制成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的酶標(biāo)板孔中，輕輕搖動(dòng)以混勻，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處3min內(nèi)樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對(duì)照組)，分別測(cè)定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計(jì)算酶受毒死蜱抑制的抑制率。
結(jié)果表明，低濃度的毒死蜱對(duì)AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表3所示。
表3 甲醇酵母表達(dá)的重組AChE蛋白受毒死蜱抑制的抑制率(％)


實(shí)施例3——酵母表達(dá)的重組AChE蛋白的活性受微量抗蚜威的抑制1.溶液(1)抗蚜威溶液稱量0.119g抗蚜威(MW＝238.33)晶體，溶于5ml丙酮中，此時(shí)抗蚜威濃度為0.1M。以10的倍數(shù)逐級(jí)稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、試劑配方同實(shí)施例1。
2.操作步驟操作與實(shí)施例1基本相同。用丙酮溶解抗蚜威晶體，配制成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的微孔中，輕輕搖動(dòng)以混勻，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處3min內(nèi)樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對(duì)照組)，分別測(cè)定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計(jì)算酶受抗蚜威抑制的抑制率。
結(jié)果表明，低濃度的抗蚜威對(duì)AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表4所示。
表4 甲醇酵母表達(dá)的重組AChE蛋白受抗蚜威抑制的抑制率(％)

實(shí)施例4——酵母表達(dá)的重組AChE蛋白的活性受微量樂(lè)果的抑制1.溶液(1)樂(lè)果溶液稱量0.115g樂(lè)果(MW＝229.12)晶體，溶于5ml丙酮中，此時(shí)樂(lè)果濃度為0.1M。以10的倍數(shù)逐級(jí)稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
其余溶液、試劑配方同實(shí)施例1。
2.操作步驟操作與實(shí)施例1基本相同。用丙酮溶解樂(lè)果晶體，配制成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的微孔中，輕輕搖動(dòng)以混勻，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處3min內(nèi)樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對(duì)照組)，分別測(cè)定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計(jì)算酶受樂(lè)果抑制的抑制率。
結(jié)果表明，低濃度的樂(lè)果對(duì)AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表5所示。
表5 甲醇酵母表達(dá)的重組AChE蛋白受樂(lè)果抑制的抑制率(％)

本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例獲得了含果蠅AChE cDNA的大腸桿菌克隆，如圖2；在此基礎(chǔ)上，獲得了含改造后的果蠅AChE cDNA的大腸桿菌克隆，如圖3。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1atggccatctcctgtcggcag(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2ttagaaaacccttttggttcgcaatg(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3agaattcgtcatcgatcgcctggtcgtgca(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4agcggccgcttattacgacgaatcgccatcgcaagtacctgc(5)SEQ ID NO.5-7的信息<110>上海交通大學(xué)<120>果蠅乙酰膽堿酯酶基因的克隆、改造及其在甲醇酵母中的表達(dá)<140>
<141>2005-05-01<160>7<170>PatentIn version 3.1
<210>5<211>1950<212>DNA<213>Drosophila AChE蛋白<400>5atggccatct cctgtcggca gagcagagtc ctgcccatgt ccttgcccct gcctctgacc 60atcccgctgc ccctggtgct ggtgctatca ctgcacctgt ccggcgtctg cggcgtcatc120gatcgcctgg tcgtgcagac atcctccgga cctgtacgcg gtcgctccgt gacggtgcag180ggcagggagg tgcatgtcta cacgggcatc ccctacgcca agccgcccgt cgaggacctg240cgcttccgaa agccggttcc cgcggagcca tggcacggcg tcctcgacgc cacgcggtta300tccgccacct gcgtccaata ccgtgacgag tacttccccg gcttctccgg cgaggagatc360tggaacccca acaccaacgt gtccgaggac tgcctctaca taaatgtctg ggcgccggca420aaggcccgac ttcgccatgg tcggggtgcc aacgggggtg agcaccccaa tggcaaacag480gcggacactg accatctcat ccacaacgga aatccgcaga acacgaccaa cggactgccg540attctgatct ggatctatgg cggtggcttc atgaccggat cggccaccct ggacatctac600aatgcggata tcatggccgc cgtgggcaat gtaatagtgg cctccttcca gtatcgagtg660ggagcctttg ggttcttgca cctggcgccg gaaatgccgt cggagtttgc ggaagaggcg720cccggcaatg tgggcctatg ggatcaggca ctcgccattc gctggctgaa ggacaacgct780catgccttcg gcggaaatcc ggagtggatg acactgttcg gagagtcggc tggatccagt840tcggtgaatg cccagctcat gtcgccggtg acgaggggtc tggtcaagcg cggaatgatg900cagtcgggca ctatgaacgc cccctggagc cacatgacct ccgagaaggc cgtggagatc960ggcaaggcgc tgatcaacga ctgcaactgc aatgcatcta tgctgaagac caatcccgct 1020cacgtgatga gctgcatgcg ttccgtggac gccaagacca tatcggtgca gcagtggaac 1080tcctactcgg gcatcctcag ctttccctcg gcgcccacca ttgatggtgc gttcctgccg 1140gcggatccca tgacgctgat gaagacggcg gatctgaagg actacgacat cctgatggga 1200aatgtcaggg atgagggcac ttacttcttg ctgtacgatt tcatcgatta cttcgataag 1260gacgatgcca cggccctgcc acgggacaaa tacctggaaa ttatgaacaa tatttttggc 1320aaggcaacgc aagcggaacg cgaggccatc attttccagt ataccagttg ggaaggcaat 1380cctggctatc agaaccagca gcaaatcgga cgcgccgtgg gcgatcactt cttcacctgc 1440cccaccaacg agtatgccca ggctctggcg gagcgaggcg cttccgtgca ctactactac 1500tttacacacc gcacaagcac ctcattgtgg ggcgaatgga tgggcgtgct gcacggcgat 1560gagatcgaat acttctttgg ccagccgctg aacaactccc tgcagtatcg acctgtggag 1620cgtgagctgg gcaagcgtat gctcagtgcg gtcatcgagt ttgctaagac gggaaatccc 1680gctcaggatg gcgaggagtg gcccaacttc tccaaggagg atcccgtcta ctatattttc 1740agcaccgacg ataagatcga gaaattggcc aggggtcctt tggcggctcg ctgctcgttc 1800tggaatgatt acttgccaaa agtcaggagt tgggcaggta cttgcgatgg cgattcggga 1860agtgcttcca tatccccgag gctccagctc cttggaatcg ctgctctgat ctacatctgc 1920gccgcattgc gaaccaaaag ggttttctaa1950
<210>6<211>1749<212>DNA<213>Drosophila AChE蛋白<400>6gtcatcgatc gcctggtcgt gcagacatcc tccggacctg tacgcggtcg ctccgtgacg 60gtgcagggca gggaggtgca tgtctacacg ggcatcccct acgccaagcc gcccgtcgag120gacctgcgct tccgaaagcc ggttcccgcg gagccatggc acggcgtcct cgacgccacg180cggttatccg ccacctgcgt ccaataccgt gacgagtact tccccggctt ctccggcgag240gagatctgga accccaacac caacgtgtcc gaggactgcc tctacataaa tgtctgggcg300ccggcaaagg cccgacttcg ccatggtcgg ggtgccaacg ggggtgagca ccccaatggc360aaacaggcgg acactgacca tctcatccac aacggaaatc cgcagaacac gaccaacgga420ctgccgattc tgatctggat ctatggcggt ggcttcatga ccggatcggc caccctggac480atctacaatg cggatatcat ggccgccgtg ggcaatgtaa tagtggcctc cttccagtat540cgagtgggag cctttgggtt cttgcacctg gcgccggaaa tgccgtcgga gtttgcggaa600gaggcgcccg gcaatgtggg cctatgggat caggcactcg ccattcgctg gctgaaggac660aacgctcatg ccttcggcgg aaatccggag tggatgacac tgttcggaga gtcggctgga720tccagttcgg tgaatgccca gctcatgtcg ccggtgacga ggggtctggt caagcgcgga780atgatgcagt cgggcactat gaacgccccc tggagccaca tgacctccga gaaggccgtg840gagatcggca aggcgctgat caacgactgc aactgcaatg catctatgct gaagaccaat900cccgctcacg tgatgagctg catgcgttcc gtggacgcca agaccatatc ggtgcagcag960tggaactcct actcgggcat cctcagcttt ccctcggcgc ccaccattga tggtgcgttc 1020ctgccggcgg atcccatgac gctgatgaag acggcggatc tgaaggacta cgacatcctg 1080atgggaaatg tcagggatga gggcacttac ttcttgctgt acgatttcat cgattacttc 1140gataaggacg atgccacggc cctgccacgg gacaaatacc tggaaattat gaacaatatt 1200tttggcaagg caacgcaagc ggaacgcgag gccatcattt tccagtatac cagttgggaa 1260ggcaatcctg gctatcagaa ccagcagcaa atcggacgcg ccgtgggcga tcacttcttc 1320acctgcccca ccaacgagta tgcccaggct ctggcggagc gaggcgcttc cgtgcactac 1380tactacttta cacaccgcac aagcacctca ttgtggggcg aatggatggg cgtgctgcac 1440ggcgatgaga tcgaatactt ctttggccag ccgctgaaca actccctgca gtatcgacct 1500gtggagcgtg agctgggcaa gcgtatgctc agtgcggtca tcgagtttgc taagacggga 1560aatcccgctc aggatggcga ggagtggccc aacttctcca aggaggatcc cgtctactat 1620attttcagca ccgacgataa gatcgagaaa ttggccaggg gtcctttggc ggctcgctgc 1680tcgttctgga atgattactt gccaaaagtc aggagttggg caggtacttg cgatggcgat 1740tcgtcgtaa 1749<210>7<211>582<212>PRT
<213>Drosophila AChE蛋白<400>7vidrlvvqts sgpvrgrsvt vqgrevhvyt gipyakppve dlrfrkpvpa epwhgvldat 60rlsatcvqyr deyfpgfsge eiwnpntnvs edclyinvwa pakarlrhgr ganggehpng 120kqadtdhlih ngnpqnttng lpiliwiygg gfmtgsatld iynadimaav gnvivasfqy 180rvgafgflhl apempsefae eapgnvglwd qalairwlkd nahafggnpe wmtlfgesag 240sssvnaqlms pvtrglvkrg mmqsgtmnap wshmtsekav eigkalindc ncnasmlktn 300pahvmscmrs vdaktisvqq wnsysgilsf psaptidgaf lpadpmtlmk tadlkdydil 360mgnvrdegty fllydfidyf dkddatalpr dkyleimnni fgkatqaere aiifqytswe 420gnpgyqnqqq igravgdhff tcptneyaqa laergasvhy yyfthrtsts lwgewmgvlh 480gdeieyffgq plnnslqyrp verelgkrml saviefaktg npaqdgeewp nfskedpvyy 540ifstddkiek largplaarc sfwndylpkv rswagtcdgd ss58權(quán)利要求
1.一種編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列，其特征在于，編碼具有乙酰膽堿酯酶活性的蛋白質(zhì)，且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的編碼，果蠅乙酰膽堿酯酶的信號(hào)肽與糖磷脂錨定信號(hào)的核苷酸被切除，且剩余的核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.7相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的果蠅，以其總cDNA為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得乙酰膽堿酯酶的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，為1950bp，以抽提大腸桿菌的質(zhì)粒pT-AChE為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO3相同引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得切除信號(hào)肽序列及糖磷脂錨定序列后的乙酰膽堿酯酶的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，為1749bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者2或者4所述的編碼果蠅乙酰膽堿酯酶的核苷酸基因序列，其特征是，所述的乙酰膽堿酯酶，米氏常數(shù)Km＝12.3±3.7μM。
全文摘要
本發(fā)明涉及果蠅乙酰膽堿酯酶的基因，屬于分子生物基因技術(shù)領(lǐng)域。編碼具有乙酰膽堿酯酶活性的蛋白質(zhì)，且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5相同。所述的編碼，果蠅乙酰膽堿酯酶的信號(hào)肽與糖磷脂錨定信號(hào)的核苷酸被切除，且剩余的核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同。該基因在甲醇酵母細(xì)胞中得到表達(dá)，產(chǎn)物具有乙酰膽堿酯酶活性且分泌于酵母培養(yǎng)基中。本發(fā)明對(duì)低濃度的有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥具有顯著的敏感性，該基因的表達(dá)產(chǎn)物可以用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，并為研制農(nóng)藥生物學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品提供靈敏的蛋白酶材料，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/16GK1727487SQ20051002594
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日
發(fā)明者張大兵, 許誦辭, 武愛(ài)波, 梁婉琪, 潘愛(ài)虎 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)